防止擴增過程中高分子量產物的方法

防止擴增過程中高分子量產物的方法
【專利摘要】本發明涉及用于擴增和檢測可存在于生物樣品中的核酸目標的改進的方法，包含用于產生擴增子的引物對和對于所述擴增子特異性的可檢測的探針或DNA結合染料，其中至少一個引物在5’末端用與目標序列不互補的聚N序列修飾。防止或部分或完全抑制在擴增過程中的高分子量產物的形成。本發明進一步提供適當修飾的引物和包含所述引物的試劑盒用于防止或抑制在核酸目標的擴增和檢測過程中的高分子量產物形成的用途。
【專利說明】防止擴增過程中高分子量產物的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于體外診斷領域，涉及改進的用于擴增和檢測生物樣品中可存在的核酸目標的方法，包括用于產生擴增子的至少一個引物對和對于所述擴增子特異性的可檢測的探針，其中至少一個引物在5’末端用與目標序列不互補的聚N序列修飾。所述改進具體基于的事實為，防止或部分或全部抑制在擴增過程中除所設計的擴增子之外的副產物(即高分子量產物的)的形成。如果本發明在診斷類型的應用中使用，則避免假陰性或假陽性結果。本發明進一步提供適當修飾的引物和包含所述引物的試劑盒用于防止或抑制在擴增和檢測核酸目標過程中高分子量產物形成的用途。
[0002] 【背景技術】
在分子診斷領域，核酸的擴增和檢測非常重要。核酸擴增和檢測的診斷應用的實例是病毒例如人類乳頭狀瘤病毒(HPV)、西尼羅河病毒(WNV)的檢測，或對人類免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)和/或丙型肝炎病毒(HCV)的存在進行的血液捐獻物的常規篩查。所述擴增和檢測技術也適于細菌核酸目標或腫瘤學標志物的分析等。
[0003]對于擴增和檢測核酸目標最突出和廣泛使用的方法是利用聚合酶酶類的聚合酶鏈式反應(PCR, US 4.683.195和US 4.683.202)。相關重要的改進是，如在PCR過程中利用攜帶報告基團或標記物的修飾的寡核苷酸對擴增產物的實時檢測，所述修飾的寡核苷酸已知為水解或5’-核酸酶探針，例如在COBAS? TaqMan? (US 5.210.015和US 5.487.972)上的商業測定中所使用的。其它改進的擴增和檢測方法已知為分子信標技術(W0 95/13399)或利用包含小溝結合物(minor groove binder,MGB)部分的寡核苷酸的方法(W0 03/062445和 WO 2006/135765)。
[0004]進一步已知多種引物(在這些引物的至少一種的5’末端包含添加的具有高GC含量的寡核苷酸)的使用顯示在擴增效率中的改進(Q.Liu等，Genome Research vol.7(1997)，ρ.389-398; WO 01/94638; US 2004/0110182)。對于例如其 5’ 末端已添加 GGAC單元的引物，經過大約12到40個PCR循環后擴增產物的最終數量明顯高于未修飾的引物。
[0005]Afonina 等(BioTechniques vol.43(3) (2007)， p.1-3; WO 2006/135765)描述通過使用具有在5’末端隨機分散的，短的腺嘌呤和胸腺嘧啶豐富的片段的引物和小溝結合物(MGB)熒光水解探針，增加實時PCR熒光信號并從而獲得改進的擴增效率。
[0006]并且，在一些PCR測定中，副產物，像高分子量產物的形成，可以對擴增效率具有實質性的影響，如產生假陽性或假陰性結果。具體而言對于低滴度樣品，由于高分子量擴增產物的形成而預期檢測信號的減少或信號丟失，導致假陰性結果。當進行更多的PCR循環時，擴增效率通常更加減少。
[0007]在定量PCR反應中，經常添加內部驗證和定量標準品并且共擴增。其作為制備和擴增過程的對照并對抑制效果進行補償。內部標準品的擴增過程中高分子量產物的形成可以導致抑制信號和無效標準，使得由內部驗證和定量標準品對照的PCR反應無效。然而，現有技術中，例如WO 2008/064687或WO 2012/032510中描述的含尾部的引物不適于防止或抑制擴增子的高分子量產物的形成，擴增反應進行越長或者PCR循環進行越多，所述擴增子的高分子量產物產生越多。所述含尾部的引物更能夠減少基于所應用引物的非特異性擴增產物的形成。
[0008]假陽性結果的來源是“遺留污染(carryover contamination) ”,其中來自先前PCR反應的PCR產物(擴增子)污染后續的PCR測定。污染物可以通過技術員、設備或甚至經由氣溶膠傳遞。高分子量產物比單個擴增子對污染防止措施像尿嘧啶-DNA糖基化酶(US
6.713.294)更有抗性，并從而顯著地增加遺留污染的風險。在真正的陰性樣品中，其中不存在目標核酸，污染物產生假陽性結果。在真正的陽性樣品中，其中存在目標核酸，污染物與真正的目標共擴增。該共擴增可以歪曲定量測定的結果，而其中真正的目標的準確量必須被確定。
[0009]因此，本領域有需要以提供用于核酸目標的簡單和可靠的擴增和檢測的方法。具體存在需要以提供致力于抑制高分子量副產物的適當的改進的方法。
[0010]
【發明內容】

本發明涉及用于擴增和檢測可存在于生物樣品中的核酸目標的新方法和用途，包括用于產生擴增子的至少一個引物對和對于所述擴增子特異性的可檢測的探針或DNA結合染料，其中至少一個引物在5’末端用與目標序列不互補的聚N序列修飾。所述改進具體基于以下事實，即，防止或部分或完全抑制在擴增過程中高分子量產物的形成，并從而由此避免如假陰性或假陽性結果。從而，本發明的一個主題是:
用于擴增和檢測生物樣品中的核酸目標的方法，其中防止或抑制擴增過程中高分子量產物的形成，所述方法包括下列步驟:
a)使所述樣品中的核酸與擴增試劑接觸，所述擴增試劑至少包含聚合酶、三磷酸核苷或其它核苷單體、用于產生擴增子的延長的正向引物或延長的反向引物和對于所述擴增子特異性的可檢測的探針或DNA`結合染料，其中所述延長的正向引物或所述反向引物的至少一種包含添加到所述引物的5’末端的與目標序列不互補的聚N序列，所述聚N序列由一種類型核苷酸或兩種不同的核苷酸組成，所述核苷酸衍生自腺苷(A)、胸苷(T)、尿苷(U)、胞苷(C)或鳥苷(G)；
b)將所述核酸與所述擴增試劑在足以使擴增反應發生的一段時間和條件下孵育；并
c)經由所述可檢測的探針或DNA結合染料檢測所述擴增子。
[0011]本發明進一步涉及用于擴增和檢測可存在于生物樣品中的核酸目標的新方法和用途，包括用于產生擴增子的至少一個引物對和對于所述擴增子特異性的可檢測的探針或DNA結合染料，其中兩條引物均在5’末端用與目標序列不互補的聚N序列修飾。所述改進具體基于以下事實，g卩，防止或部分或完全抑制在擴增過程中高分子量產物的形成，并從而由此避免如假陰性或假陽性結果。從而，本發明的一個主題是:
用于擴增和檢測生物樣品中的核酸目標的方法，其中防止或抑制擴增過程中高分子量產物的形成，所述方法包含下列步驟:
a)使所述樣品中的核酸與擴增試劑接觸，所述擴增試劑至少包含聚合酶、三磷酸核苷或其它核苷單體、用于生成擴增子的延長的正向引物和延長的反向引物和對于所述擴增子特異性的可檢測的探針或DNA結合染料，其中所述延長的正向引物和反向引物各自包含添加到所述引物的5’末端的與目標序列不互補的聚N序列，所述聚N序列由一種類型核苷酸或兩種不同的核苷酸組成，所述核苷酸衍生自腺苷(A)、胸苷(T)、尿苷(U)、胞苷(C)或鳥苷(G)；
b)在足以使擴增反應發生的一段時間和條件下孵育所述核酸和所述擴增試劑；并
c)經由所述可檢測的探針或DNA結合染料檢測所述擴增子。
[0012]本發明進一步的一個主題是:
用于防止或抑制PCR擴增過程中高分子量產物形成的方法，所述方法包括下列步驟:
a)使生物樣品中的核酸與擴增試劑接觸，所述擴增試劑至少包含聚合酶、三磷酸核苷或其它核苷單體、用于產生擴增子的延長的正向引物和/或延長的反向引物和對于所述擴增子特異性的可檢測的探針或DNA結合染料，其中所述延長的正向引物和/或反向引物的至少一種包含添加到所述引物的5’末端的與目標序列不互補的聚N序列，所述聚N序列由一種類型核苷酸或兩種不同的核苷酸組成，所述核苷酸衍生自腺苷(A)、胸苷(T)、尿苷(U)、胞苷(C)或鳥苷(G)；
b)在足以使擴增反應發生的一段時間和條件下孵育所述核酸和所述擴增試劑；并
c)經由所述可檢測的探針或DNA結合染料檢測所述擴增子。
[0013]根據本發明的方法添加了對本領域的若干改進:通過防止或抑制在PCR過程中高分子量產物的形成，因為熒光抑制被避免而使擴增子的后續檢測更加可靠。這應用于目標和/或內部標準品兩者的擴增。高分子量產物，而不是擴增子，導致在后續PCR反應中的熒光抑制。本發明方法特別是有利于以下樣品的檢測:其中不存在核酸目標或當應用通常至少20個PCR循環時僅含低滴度量的核酸目標。在一些該實施方案中，PCR循環在多于30個循環后終止，有時多于40個，優選多于50個和最優選多于60個循環后終止。對于大部分這些樣品，擴增反應在50個循環之前不終止。在存在來自先前的PCR反應的低水平的污染的條件下，該PCR反應的抑制甚至更加顯著。
[0014]通過使用延長的引物以阻止或抑制高分子量產物形成的根據本發明的方法還可以用于其中不需要用于檢測的探針或DNA結合染料的擴增方法。
[0015]根據本發明的表述“聚N序列”指多核苷酸序列，其可以含有所有5種天然堿基:腺苷(A)、鳥苷(G)、胞苷(C)、胸苷(T)和尿苷(U)，或這些天然堿基的僅四、三、二或一種。根據本發明的聚N序列包含至少兩個或更多相同的堿基，例如，(A)m,⑴m、(G)m、(C)m、(U)m，其中m具體是數目2到10，或不同的堿基，例如(AT) n、(AG) η、(AC) η、(TA) n、(UA) η、(GA)η或(CG) η，其中η具體是數目I到5，并且通常總共不多于50個核苷酸。優選地，所述聚N序列由衍生自腺苷㈧、胸苷(T)、尿苷⑶、胞苷(C)或鳥苷(G)的一種類型的核苷酸或兩種不同的核苷酸組成。聚N序列可以添加到至少一種所使用的引物上。添加到兩種或更多種引物的聚N序列可以是相同或不同的。在本發明的一些實施方案中，正向引物和反向引物包含相同的聚N序列。
[0016]根據一個實施方案，本發明提供上述方法，其中步驟a)中所述的聚N序列包含聚A、聚T、聚AT、聚U、聚C或聚G序列。根據本發明使用以下聚N序列，所述聚N序列包含100%的衍生自腺苷㈧、胸苷⑴、腺苷-胸苷(AT)、尿苷(U)、胞苷(C)或鳥苷(G)的一種類型核苷酸或兩種不同核苷酸，并且長度總共2到10個核苷酸或4到6個核苷酸。根據本發明具體使用包含4到6個連續腺苷堿基(A)的聚N序列尾。聚N尾還可以包含修飾的核苷酸，像烷基化的核苷酸例如N4-乙基-dC、N6-甲基-dA或2’ -O-甲基-核苷酸等，只要所修飾的寡核苷酸(引物)具有在擴增反應中與其互補物雜交和作為模板的能力。[0017]并且，本發明提供試劑盒，其用于通過任何上述方法擴增和檢測生物樣品中的目標核酸。所述試劑盒包含至少一種聚合酶，例如熱穩定的聚合酶、至少四種不同的三磷酸核苷或其它核苷單體、用于產生至少一種擴增子的至少一種延長的正向引物和/或至少一種延長的反向引物，以及至少一種對于所述擴增子特異性的可檢測的探針或DNA結合染料，其中所述延長的正向引物和反向引物的至少一種包含添加到所述引物的5’末端的與目標序列不互補的聚N序列，所述聚N序列由一種類型核苷酸或兩種不同的核苷酸組成，所述核苷酸衍生自腺苷(A)、胸苷(T)、尿苷⑶、胞苷(C)或鳥苷(G)。根據本發明的試劑盒具體是那些其中所述聚N序列包含長度為2到10個核苷酸的聚A、聚T、聚AT、聚U、聚C、聚G序列的試劑盒。聚N序列可以連接到至少一種所使用的引物上。連接到兩種或更多種引物的聚N序列可以是相同或不同的。在本發明的一些實施方案中，所述試劑盒包含含有相同的聚N序列的正向引物和反向引物。試劑盒可以進一步包含額外的引物和探針、酶類像尿嘧啶-N-糖基化酶、適配體、緩沖液組分和去垢劑等。
[0018]為了幫助理解本發明，下面定義若干術語。
[0019]“生物樣品”可以是天然來源的任何樣品。“生物樣品”例如衍生自人并且是體液或身體的組織。在本發明的一個實施方案中，“生物樣品”是血液。
[0020]術語“核苷”指由連接到糖，例如核糖或脫氧核糖的C-1'碳的堿基組成的化合物。核苷的堿基部分通常是雜環堿基，例如，嘌呤或嘧啶。
[0021]術語“核苷酸”指作為單體單元或在多核苷酸內的核苷的磷酸酯。“核苷5’-三磷酸”指具有連接到糖5’ -碳位置的三磷酸酯基團的核苷酸，并且有時表示為“NTP”或“dNTP”和“ddNTP”。修飾的核苷酸是任何核苷酸(如ATP、TTP、UTP、GTP或CTP)，其已被化學修飾，典型地通過修飾堿基、糖或磷酸部分。修飾的核苷酸包括，例如但不限于，堿基部分例如N4-乙基胞苷、N6-甲基腺苷、N6-叔丁基苯甲基腺苷或N4-叔丁基苯甲基胞苷、5-甲基胞苷、6-巰基嘌呤、5-氟尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、6-硫鳥嘌呤，或糖修飾例如2’ -O-甲基-核糖和2’ -氟-或2’ -氨基-2’ -脫氧核糖等。如本文所使用，術語“核苷酸類似物”指非天然存在的任何核苷酸。
[0022]表述“其它核苷單體”指除了標準的三磷酸核苷之外的磷酸活化的核苷，其可以在酶促多核苷酸合成中采用，作為例如四磷酸核苷等。
[0023]術語“目標核酸”和“目標區域”指所要擴增、檢測或另外分析的核酸區域。與引物或探針雜交的序列可以稱為“目標序列”。
[0024]術語“核酸”和“寡核苷酸”指引物、探針和所要檢測的寡聚體片段，并應當對多脫氧核糖核苷酸(包含2-脫氧-D-核糖)，對多核糖核苷酸(包含D-核糖)和對任何其它類型的多核苷酸是通用的，其是嘌呤或嘧啶堿基、或修飾的嘌呤或嘧啶堿基的N-糖苷。術語“核酸”和“寡核苷酸”之間在長度上沒有意向的差異，并且這些術語將互換使用。這些術語僅指分子的一級結構。因此，這些術語包括雙和單鏈DNA，以及雙和單鏈RNA，以及RNA和DNA的雙鏈。
[0025]寡核苷酸的準確大小取決于很多因素和寡核苷酸的最終功能或用途。寡核苷酸可以通過任何合適的方法制備，包括，例如適當序列的克隆和限制性處理和直接化學合成，通過方法例如 Narang等，1979，Meth.Enzymol.68:90-99 的憐酸三酯法；Brown 等，1979，Meth.Enzymol.68:109-151 的憐酸二酯法；Beaucage 等，1981，Tetrahedron Lett.22:1859-1862的亞磷酰胺法；和US 4.458.066中描述的固體支持法。合成方法的綜述提供在 Goodchild, 1990, Bioconjugate Chemistry I (3): 165-187 中。
[0026]術語“擴增(amplification) ”、“擴增(amplifying) ”等一般指導致分子或相關分子集合的拷貝數目增加的任何過程。當其應用于多核苷酸分子時，擴增指產生多核苷酸分子或多核苷酸分子的部分的多個拷貝，典型地從小量的多核苷酸(例如，病毒基因組)開始，其中所擴增的材料(擴增子、PCR擴增子)典型地是可檢測的。多核苷酸的擴增包括各種化學和酶促過程。在聚合酶鏈式反應(反轉錄PCR，PCR)、鏈置換擴增(SDA)反應、轉錄介導的擴增(TMA)反應、基于核酸序列的擴增(NASBA)反應或連接酶鏈式反應(LCR)過程中從一個或幾個拷貝的模板RNA或DNA分子產生多個DNA拷貝，是擴增的形式。擴增不限于起始分子的嚴格復制。例如，使用反轉錄PCR從樣品中有限量的病毒RNA產生多個cDNA分子，是擴增的形式。并且，在轉錄過程中從單個DNA分子產生多個RNA分子，也是擴增的形式。
[0027]術語“擴增子”指在具體目標核酸的擴增之后產生的多核苷酸分子(或共同地，多種分子)。用于產生擴增子的擴增方法可以是任何合適的方法，最典型地，例如通過使用PCR方法。擴增子典型地但不專有地是DNA擴增子。擴增子可以是單鏈的或雙鏈的，或在以任何濃度比的其混合物中。
[0028]術語“高分子量產物”指擴增子的寡聚體(或多聚體或多聯體)并因此包含對引物、探針和DNA結合染料的多個結合位點。隨著更多PCR循環進行，這些具有約1000個堿基對到10000個堿基對的高分子量產物形成增加，具體是因為擴增子非特異性地充當引物。
[0029]術語“雜交”指由兩條單鏈核酸由于互補堿基配對而形成雙鏈體結構。雜交可以在完全互補的核酸鏈之間或包含小的錯配區域的“基本上互補的”核酸鏈之間發生。只有完全互補的核酸鏈可以雜交的條件稱作“嚴格雜交條件”或“序列特異性雜交條件”。在較低嚴格雜交條件下可以獲得基本上互補的序列的穩定的雙鏈體。根據本領域提供的指導(參見，例如 Sambrook 等，2nd Edition 1989, Part 1-3, Molecular Cloning - A LaboratoryManual, Cold Spring H arbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York),核酸【技術領域】的技術人員可以經驗性地考慮多種變量包括，例如寡核苷酸的長度和堿基對濃度、離子強度和錯配堿基對的發生率，從而確定雙鏈體穩定性。
[0030]通常，將嚴格條件選擇為，在規定的離子強度和pH值，對于特定序列比熱解鏈點(Tm)低約5°C。Tm是50%的雙鏈體解離的溫度(在規定的離子強度和pH)。放松雜交條件的嚴格性將允許序列錯配被容忍；容忍的錯配程度可以通過雜交條件的適當調整來控制。
[0031]術語“引物”指寡核苷酸，無論天然的或合成的，其能夠在誘導與核酸鏈互補的引物延伸產物的合成的條件下充當RNA或DNA合成的起始點，所述條件即，在存在四種不同三磷酸核苷和用于聚合的試劑(即，DNA聚合酶或反轉錄酶)的情況下，在適當緩沖液中和在適當的溫度下。引物優選為單鏈寡脫氧核糖核苷酸。引物的適當的長度取決于引物意向的用途，但典型地在從15到35個核苷酸的范圍。短引物分子通常需要更低的溫度以與模板形成足夠穩定的雜交復合物。引物不需要反映模板核酸的準確的序列，但必須足夠互補以與模板雜交。引物可以摻入額外特征，所述特征增加結合到目標序列的特異性(例如修飾的核苷酸，像EP O 866 071和EP I 201 768中描述的3’末端烷基化的核苷酸)，或者允許檢測或固定化引物但不改變引物充當RNA或DNA合成的起始點的基本性質。例如，引物可以在5’端包含額外的核酸序列，其不雜交到目標核酸，但其促進所擴增產物的克隆和/或根據本發明抑制或防止高分子量產物的形成。與模板足夠互補以雜交的引物的區域在本文中稱作雜交區域。
[0032]如本發明所使用的術語“延長的引物”或“聚N延長的引物”指在5’端包含額外的多核苷酸序列(聚N)的引物，所述額外的多核苷酸序列可以包含所有五種天然堿基:腺苷(A)、鳥苷(G)、胞苷(C)、尿苷(U)和胸苷(T)，或這些天然堿基的僅四、三、二或一種。具體而言，根據本發明的聚N序列分別包含至少兩個或更多相同的堿基，例如，㈧m、⑴m、(G)m、(C)m或(U)m，其中m是數目2到10,或不同的堿基,例如(AT)n、(AG)n、(AC)n、(TA)n、(UA) η、(GA) n或(CG) n，其中n分別是數目I到5，并且通常總共不多于50個核苷酸。聚N序列可以例如包括聚Α、聚Τ、聚AT、聚U、聚C或聚G序列。根據本發明在大部分情況下應用如下聚N序列，所述聚N序列包含100%的衍生自腺苷(Α)、胸苷(Τ)、腺苷-胸苷(AT)、尿苷(U)、胞苷(C)或鳥苷(G)的一種類型核苷酸或兩種不同核苷酸，并且長度總共2到10個核苷酸，或4到6個核苷酸。根據本發明，使用至少一種適當延長的引物。添加到至少兩種延長的引物的每一種的聚N序列可以是相同或不同的。
[0033]根據本發明的表述“聚N序列”指由衍生自腺苷㈧、胸苷⑴、尿苷(U)、胞苷(C)或鳥苷(G)的一種類型的核苷酸或兩種不同的核苷酸組成的多核苷酸序列。聚N序列包含至少兩個或更多相同的堿基，例如，⑷m、⑴m、(G)m>⑶m、(C)m,其中m具體是數目2到10，或不同的堿基，例如(AT) n、(AG) η、(AC) η、(TA) n、(UA) η、(GA) η 或(CG) η，其中 η 具體是數目I到5，并且通常總共不多于50個核苷酸。添加到兩種或更多種所使用的引物的聚N序列可以是相同或不同的。在本發明的具體實施方案中，正向引物和反向引物包含聚N序列，所述聚N序列可以是相同或不同的。聚N尾還可以包含修飾的核苷酸，像烷基化的核苷酸例如Ν4-乙基-dC、N6-甲基-dA或2’ -O-甲基-核苷酸等，只要所修飾的寡核苷酸(引物)具有在擴增反應中與其互補物雜交和作為模板的能力。在一些實施方案中，無論正向或反向引物，僅一種引物包含該聚N尾都可以是有用的。
[0034]在一個實施方案中，本發明提供上述方法，其中步驟a)中所述的聚N序列包含聚A、聚T、聚AT、聚U、聚C或聚G序列。根據本發明使用以下聚N序列，所述聚N序列包含100%的衍生自腺苷㈧、胸苷⑴、腺苷-胸苷(AT)、尿苷(U)、胞苷(C)或鳥苷(G)的一種類型的核苷酸或兩種不同核苷酸，并且長度總共2到10個核苷酸。根據本發明也使用在長度上包含4到6個核苷酸的聚N序列。根據本發明具體使用包含四到六個連續腺苷(A)堿基的序列尾。
[0035]如本文所用，“上游”引物指其延長產物是編碼鏈的子序列的引物。“下游”引物指其延長產物是互補的非編碼鏈的子序列的引物。
[0036]如本文所用，“正向”引物指在PCR中從在反義鏈3’端的起始密碼子向在模板DNA(核酸目標)5’端的終止密碼子延伸的引物，而“反向”引物指從在有義鏈5’端的終止密碼子向在模板DNA 3’端的起始密碼子延伸的引物。正向引物通常設計以退火到起始密碼子上游的模板DNA，而反向引物設計以退火到終止密碼子下游的模板DNA的區域。
[0037]如本文所用，術語“探針”指由于互補堿基配對而與目標核酸的序列形成雙鏈體結構的寡核苷酸。探針用于檢測或捕獲目標核酸。探針優選為單鏈寡脫氧核糖核苷酸。探針典型地將由“雜交區域”組成，或包含“雜交區域”，所述“雜交區域”優選由對應目標序列的區域的10到50個核苷酸、更優選15到35個核苷酸組成。
[0038]“對應”指至少基本上與指定的核酸或其互補物互補。探針不需要反映模板核酸的準確的序列，但必須足夠互補以在所選雜交條件下與目標雜交。探針寡核苷酸可以包含，或結合，額外特征，所述額外特征允許檢測或固定化探針，但不顯著改變雜交區域的雜交特征。例如，探針可以通過摻入一種或更多種標記的核苷酸或通過結合一種或更多種分離的可檢測的部分而被標記。標記的核苷酸或可檢測的部分包含例如，但不限于熒光染料，像熒光素、羅丹明、香豆素和花菁，或淬滅染料，像黑洞粹滅劑(Black Hole Quenchers),如來自Biosearch Technologies Inc., Novato, CA的BHQ-2。探針可以是如技術人員已知的例如水解或5’ -核酸酶探針、分子信標探針、包含小溝結合劑的探針或雜交探針等。 [0039]如本文所用，如果在寡核苷酸和目標序列之間存在的錯配的數目少于在寡核苷酸和非目標序列之間存在的錯配的數目，則寡核苷酸引物或探針是對于目標序列“特異性的”。雜交條件可以選擇為，在該雜交條件下只有存在的錯配的數目不多于在寡核苷酸和非目標序列之間存在的錯配的數目，才形成穩定的雙鏈體。在該條件下，目標特異性寡核苷酸僅能與目標序列形成穩定的雙鏈體。因此，在適當的嚴格雜交條件下目標特異性探針的使用使能夠檢測特異的目標序列。類似地，在適當的嚴格擴增條件下目標特異性引物的使用使能夠特異性擴增那些包含目標引物結合位點的目標序列。
[0040]術語“熱穩定的聚合酶酶類”指這樣的酶，其對熱相對穩定并催化三磷酸核苷聚合以形成與目標序列的核酸鏈之一互補的引物延伸產物。如應用于酶的術語“熱穩定的”，具體指在升高的溫度(如，在55°C或更高)保留其生物活性，或在加熱和冷卻的重復循環后保留其生物活性的酶。聚合酶酶類在引物的3’端起始合成并向模板的5’端的方向進行直至合成終止。純化的熱穩定的聚合酶酶類更充分地描述在如US 4.889.818中，并可商購獲得，例如從Roche Diagnostics GmbH/德國商購獲得。
[0041]術語給定的核酸的“互補物”具體指反向平行的多核苷酸鏈，其意味著與給定的核酸具有相同長度并精確地互補的核酸。例如序列5’-AGTTC-3’與序列5’-GAACT-3’互補。術語“完全互補”或“100%互補”等指在反向平行鏈間具有完美的沃森-克里克堿基配對的互補序列(在多核苷酸雙鏈體中沒有錯配)。但是，互補性不需要是完美的；穩定的雙鏈體，例如，可以包含錯配的堿基對或未配對的堿基。術語“部分互補性”、“部分互補”、“不完全互補性”或“不完全互補”等指在反向平行的多核苷酸鏈間低于100%完美的任何堿基比對(例如，在多核苷酸雙鏈體中存在至少一個錯配或未配對的堿基)。因此，核酸的互補物指單個唯一定義的序列。
[0042]術語“可檢測的”、“標記”或“報告物”以其最寬泛的意義，指可檢測的，或允許與其相關聯的部分或性質的檢測的任何部分或性質。例如，包含標記的多核苷酸是可檢測的(并在一些方面稱作為探針)。理想地，標記的多核苷酸允許包含多核苷酸的雜交復合物的檢測。在一些方面，例如標記連接(共價地或非共價地)于多核苷酸。在各個方面，標記可以，可替換地或以組合地:(i)提供可檢測的信號；(ii)與第二標記相互作用以修飾由第二標記提供的可檢測的信號，例如FRET;(iii)穩定化雜交，例如雙鏈體形成；(iv)賦予捕獲功能，例如疏水親和性，抗體/抗原，離子絡合，或(V)改變物理屬性，例如電泳遷移率、疏水性、親水性、溶解性，或層析行為。標記在其結構和其作用機制方面廣泛地變化。
[0043]標記的實例包括但不限于,突光標記(包括,例如淬滅劑或吸收劑)、非突光標記、比色標記、化學發光標記、生物發光標記、放射性標記、質量修飾基團、抗體、抗原、生物素、半抗原、酶(包括，例如，過氧化物酶，磷酸酶等)等。為了進一步闡釋，熒光標記可以包括帶負電的染料，例如熒光素家族的染料，或電中性的染料，例如羅丹明家族的染料，或帶正電的染料，例如花菁家族的染料。熒光素家族的染料包括，例如FAM、HEX、TET、JOE、NAN和Z0E。羅丹明家族的染料包括，例如，德克薩斯紅、ROX、R110、R6G和TAMRA。FAM、HEX、TET、JOE、NAN、ZOE, ROX、R110、R6G 和 TAMRA 是可商購獲得的，從例如 Perkin-Elmer, Inc.(Wellesley, MA, USA)商購獲得,德克薩斯紅是可商購獲得的,從例如Life Technologies(Molecular Probes, Inc.) (Grand Island, NY)商購獲得。花菁家族的染料包括,例如CY2、CY3、CY5、CY5.5 和 CY7,并且是可商購獲得的，從例如 GE Healthcare Life Sciences(Piscataway, NJ, USA)商購獲得。
[0044]術語“DNA結合染料”或“DNA插入染料”指能結合到雙鏈核酸并在結合后發射熒光信號的染料分子，例如可從Life Technologies (Grand Island，NY)獲得的SYBRGREENI 和 SYBRGOLD 或來自 Roche Diagnostics (德國)的 Lightcycler 480 Resolight0
[0045]術語“FRET” (熒光共振能量轉移)和等效術語通常指兩種染料分子的電子狀態間動態的距離依賴性的相互作用，其中能量從供體分子轉移到受體分子而沒有從供體分子發射光子。FRET的效率取決于染料間分子間間隔的倒數，使在與生物大分子尺度相容的范圍內有效。通常，FRET允許共定位分子或單分子內構象變化的成像、動力學分析和/或定量，并具有超過傳統光學顯微鏡限制的空間分辨率。通常，FRET需要，(a)供體和受體分子必須非常接近(典型地，如10-100 A)，(b)受體的吸收譜必須與供體的熒光發射譜重疊，并且(c)供體和受體躍遷偶極取向必須大致平行。
[0046]在大多數FRET應用中，供體和受體染料是不同的，在這種情況下FRET可以通過受體的敏化熒光的出現或通過供體熒光的淬滅來檢測。在一些情況下，供體和受體是相同的，并且FRET可以通過所獲得的熒光去極化來檢測。單供體/受體分子在FRET系統中的使用描述于例如，Packard 和 Komoriya 的 US 7.312.302 中。
`[0047]FRET已變為重要技術，用于研究多種表征為分子接近性的變化的生物學現象。FRET技術現在普遍存在于很多生物學實驗室，并且已適合于在很多生物學系統中使用，包括但不限于，核酸雜交的檢測、實時PCR測定和SNP檢測、蛋白結構和構象、蛋白復合物的空間分布和組裝、受體/配體相互作用、免疫測定、探測單分子相互作用、核酸結構和構象、用于檢測突變的引物延伸測定、自動DNA測序、脂質分布和轉運、膜融合測定(膜融合的脂質-混合測定)、膜電位檢測、突光蛋白酶底物(fluorogenic protease substrates)和用于環化AMP和鋅的指示劑。
[0048]術語“水解探針”或“ 5’ -核酸酶探針”表示用于根據本發明的大多數應用并用于PCR反應中(即在C0BAS? TaqMan?系統上)的探針。這些水解或5’-核酸酶探針由單鏈雜交探針組成，其通常用兩種熒光部分標記。根據熒光共振能量轉移(FRET)的原理，當第一個熒光部分由適當波長的光激發時，所吸收的能量轉移到第二個熒光部分。第二個熒光部分通常是淬滅劑分子，其還可以是非熒光淬滅劑，像BHQ-2。以這種形式使用的典型的熒光染料是例如，FAM、HEX、CY5、JA270、Cyan 500和CY5.5等。在PCR反應退火步驟過程中，標記的雜交探針結合到目標核酸(即，擴增產物)并在后續的延長階段中被TaqDNA聚合酶或如技術人員已知的另一種合適的聚合酶，例如Z05聚合酶的5’到3’核酸外切酶活性降解。其結果是，被激發的熒光部分和淬滅劑部分變得在空間上彼此分離。結果是，在不存在淬滅劑的情況下激發第一熒光部分后，可以檢測到來自第一熒光部分的熒光發射。在LightCycIer?和TaqMan?技術兩種檢測方式中，發射信號的強度都可以與原初目標核酸分子的數目相關聯。
[0049]表述“丙型肝炎病毒的類型”指基于其基因組組織(例如，系統發生分析)的丙型肝炎病毒(HCV)的分類。HCV分離物的分類入特定類型的類別反映其與其它HCV分離物的基因組相關性，和其與其它HCV分離物的相對少的相關性。本文所用的HCV分型命名法與廣泛米用的由 Simmonds 等(2005) “Consensus Proposals for a Unified System ofNomenclature of Hepatitis C Virus Genotypes”，Hepatology 42, N0.4: 962-973 修訂和提出的命名法一致。Simmonds等(2005)的系統將已知HCV分離物分成六(6)種HCV基因型之一，稱為基因型I到6。每個基因型進一步細分成稱為亞型的分組，其反映相同基因型的毒株之間的相關性。HCV亞型通過在基因型后小寫羅馬字母書寫，例如亞型la、亞型lc、亞型6a等。在單個分離物內發現的基因變體稱為準種(quasi species)。全世界已知包括所有6種基因型的大約100個HCV亞型；亞型的數目不是靜態的；隨著更多的HCV分離物被研究和測序，有可能識別出額外的亞型(以及可能的基因型)。
[0050]術語“病毒類型”可以指基因型或亞型。注意，如本文所用，術語“HCV類型”可以指HCV基因型或HCV亞型。術語“HCV分型”指將實驗的(例如，未知類型)HCV分配到已知基因型(例如，1、2、3、4、5或6，或其子集)，或將實驗的HCV分配到已知亞型(例如，la、lb、lc、2a、2b、2c等，或其子集)。相反，還注意到，如本領域通常使用，術語“HCV基因分型”最經常指將HCV分配到HCV的任何亞型之一，例如，最典型地，la、lb、lc、2a、2b、2c等。但是，如本文所用，術語“基因分型” 指僅分配到1、2、3、4、5或6。
[0051]術語“試劑盒”用于指促進樣品的處理、方法、測定、分析或操作的物品的組合。試劑盒可以包含描述如何使用試劑盒的書面說明書、方法所需的化學試劑或酶類、引物和探針，以及任何其它組分。在一些實施方案中，本發明提供了用于使用實時(RT)-PCR的“閉管”檢測的試劑盒。這些試劑盒可以包括，例如，但不限于用于樣品收集的試劑(例如，血樣的收集)、用于RNA和/或DNA的收集和純化的試劑(例如從血液)、用于擴增和檢測的試劑(任選地包括反轉錄酶活性)、適用于反轉錄和第一鏈和第二鏈cDNA合成以產生一種或多種擴增子的引物(但至少一種正向引物和/或一種反向延長的引物)、尿嘧啶-DNA糖基化酶、熱穩定的DNA依賴性的DNA聚合酶和(脫氧核糖)三磷酸核苷。在一些實施方案中，包含反轉錄酶活性和熱穩定的DNA依賴性的DNA聚合酶活性的酶是同樣的酶,例如棲熱菌屬種(Thermus sp.) Z05聚合酶或嗜熱鏈球菌{Thermus thermophilus)聚合酶。
[0052]分子生物學和核酸化學的常規技術，其在現有技術內，在文獻中被充分解釋，參見，例如，Sambrook Λ$:,
2nd Edition 19S9, Part I X Molecular Cloning A Laboratory Manyal, Cold Spring Harbor
laboratory，Cold Spring Harbor, Mew York; Oligcmuclcotide Synthesis (MJ.Gait, ed.9
19S4); Nucleic Add Hybridization (BH Haines.獅 SJ.Higgins, ed、.19S4);顧
Melhods in Enzyinology (AcacIenik Press:, Inc.)系到。[0053]原則上，所有類型的核酸目標都可以使用本發明方法擴增和檢測。然而，該方法具體應用于測試包含高目標的樣品或對照，其中通過在較早的PCR循環中形成的擴增子的聚合，在PCR反應中產生高分子量產物。根據本發明的高目標核酸的實例是病毒例如人類乳頭狀瘤病毒(HPV)、西尼羅河病毒(WNV)的核酸，或那些用于對人類免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎(HBV)和/或丙型肝炎(HCV)的存在進行的血液捐獻物的常規篩查的核酸。然而，本發明的方法也適于細菌目標或腫瘤學標志物的分析等。
[0054]具體而言，丙型肝炎病毒(HCV)感染是正在增長的世界性的關注點。HCV感染經常是持續性的，并引起慢性肝病，表現為肝硬化和肝細胞癌癥。在美國，HCV是肝臟移植的主要原因。世界范圍內，每年報告大約一百萬新的HCV感染，僅在美國，估計四百萬人被感染并且每年發生30000例新的感染。
[0055]目前，在美國每年HCV導致估計8000到10000例死亡。如果沒有改進的診斷和治療方法的開發，預期世界范圍內該數字會在接下來的幾年里顯著增加。
[0056]HCV基因組是高度多態的，并且已經表征了很多毒株(稱為基因型和亞型)。不同的病毒類型與不同的疾病結果和對治療方案的不同反應性相關。
[0057]HCV基因組結構/組織與黃病毒科(Flaviviridae)的基因組結構/組織最為相似。與大部分黃病毒蛋白的已知功能一致，HCV蛋白的N-末端很可能是結構蛋白(包括C(衣殼/核心)，E1和E2包膜蛋白)，并且C末端非結構蛋白，包括N2 (金屬蛋白酶)、NS3(絲氨酸蛋白酶/螺旋酶)、NS4和NS5 (NS5B RNA聚合酶)被認為是在病毒復制中發揮作用。
[0058]原型HCV分離物(現在稱為HCV Ia)的表征和鑒定之后，鑒定了(并繼續鑒定)來自世界各地的其它分離物。序列比較揭示這些獨特的分離物可以彼此不同，達到在HCV基因組的全長范圍多至35%的核苷酸非同一性的程度(Okamoto等(1992) Virology188:331-341)。在整個病毒基因組觀察到序列可變性，并有一些區域顯示比其它區域更多的可變性。例如，通常在5’-UTR區觀察到高序列保守性；相反，一些區域包括包膜(E)區域，顯示高可變核苷酸序列。
[0059]知道在感染中存在的病毒基因型(和/或亞型)為臨床醫生提供用于確定對感染患者的最佳療程的重要指示物。然而，可以區分日益增加數目的已知HCV類型的簡單的診斷方法的開發已成為挑戰。
[0060]用于擴增和檢測目標核酸的本發明方法，其中目標核酸是病毒核酸，優選HCV，是優選的根據本發明的實施方案。
[0061]因此，本發明提供改進的寡核苷酸引物(延長的引物)，其能夠對存在于大部分迄今已知類型的HCV的基因組中的高序列保守區域，例如5’UTR區域，進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增。本發明還提供了改進的寡核苷酸探針，其能夠通過雜交檢測HCV核酸。
[0062]本發明的引物的重要優點是它們能夠擴增所有HCV類型，而沒有同時擴增非目標序列。因此，所述引物使能夠從源自世界所有區域的樣品中檢測HCV的所有類型的HCV檢測分析成為可能。 [0063]因此，本發明的一個目標是用于擴增和檢測生物樣品中的核酸目標，例如HCV的核酸的方法，其中防止或抑制擴增過程中高分子量產物的形成，所述方法包括下列步驟:
a)使所述樣品中的核酸與擴增試劑接觸，所述擴增試劑至少包含聚合酶、三磷酸核苷或其它核苷單體、用于生成擴增子的延長的正向引物和/或延長的反向引物，和對于所述擴增子特異性的可檢測的探針或DNA結合染料，其中所述延長的正向引物是第一 HCV特異性寡核苷酸并且所述反向引物是第二 HCV特異性寡核苷酸，所述引物的至少一種包含添加到所述引物的5’末端并與目標序列不互補的聚N序列，所述聚N序列由一種類型核苷酸或兩種不同的核苷酸組成，所述核苷酸衍生自腺苷(A)、胸苷(T)、尿苷(U)、胞苷(C)或鳥苷(G)；
b)在足以使擴增反應發生的一段時間和條件下孵育所述核酸和所述擴增試劑；并
c)經由所述可檢測的探針或DNA結合染料檢測所述擴增子。
[0064]在本發明的具體實施方案中，所述方法包括在5’端包含聚N序列的引物，所述聚N序列包含聚A、聚T、聚AT、聚U、聚C或聚G序列。聚N序列，其包含100%的一種定義的選擇的核苷酸或兩種定義的選擇的核苷酸，像腺苷(A)、胸苷(T)、腺苷-胸苷(AT)、尿苷(U)、胞苷(C)或鳥苷(G)并且總共2到10個核苷酸。根據本發明具體應用在長度上包含4到6個核苷酸的聚N序列。根據本發明最具體使用包含4到6個連續腺苷(A)核苷酸的聚N序列。
[0065]根據本發明的HCV特異性引物是，例如寡核苷酸，像如下序列的包含聚N的引物:
用作正向引物的《ΙΑΟΛΛΜ;?+*Τ(:ΤΛ?ΧΧΛ+ΙΧΛΧ.ΧΠΤΛ {SEQ IP Μ?; H和用作反向引物的(Α:ΛΛΟ€Λ(；(Χ:ΤΛ?Τ: ACKj<:/\C.jTAt:C:AC:AΛ (SliQ 1Ι> NO:1)。根據本發明也可以使用在
3’末端核苷酸進一步修飾，例如在腺苷的環外氨基烷基化的引物。
[0066]本發明的另一個目標是用于防止或抑制PCR擴增過程中的高分子量產物形成的方法，所述方法包括下列步驟:
a)使生物樣品中的核酸與擴增試劑接觸，所述擴增試劑至少包含聚合酶、三磷酸核苷或其它核苷單體、用于生成擴增子的延長的正向引物和/或延長的反向引物和對于所述擴增子特異性的可檢測的探針或DNA結合染料，其中所述延長的正向引物和所述反向引物均對所要確定的核酸目標，例如HCV是特異性的，所述引物的至少一種包含添加到所述引物的5’末端并與目標序列不互補的聚N序列，所述聚N序列由一種類型核苷酸或兩種不同的核苷酸組成，所述核苷酸衍生自腺苷(A)、胸苷(T)、尿苷(U)、胞苷(C)或鳥苷(G)；
b)在足以使擴增反應發生的一段時間和條件下孵育所述核酸和所述擴增試劑；并
c)經由所述可檢測的探針或DNA結合染料檢測所述擴增子。
[0067]在本發明的一個實施方案中，所述方法包括在5’端包含聚N序列的引物，所述聚N序列包含聚A、聚T、聚AT、聚U、聚C或聚G序列。根據本發明使用以下聚N序列，所述聚N序列包含100%的一種定義的選擇的核苷酸或兩種定義的選擇的核苷酸,像腺苷(A)、胸苷(T)、腺苷-胸苷(AT)、尿苷(U)、胞苷(C)或鳥苷(G)，并且長度總共2到10個核苷酸。根據本發明具體應用在長度上包含4到6個核苷酸的適當的聚N序列。根據本發明最具體使用包含四到六個連續腺苷(A)堿基和/或胸苷(T)堿基的聚N序列。
[0068]根據本發明的HCV特異性引物是，例如寡核苷酸，像如下序列的包含聚N的引物:用作正向引物的GCAGAAAGCGTCTAGCXATGGCGTTA CSEQ ID NO: U和用作反向引物的 GCAAGCACCCTATCAGCXAGTACCACAA (SEQ ID NO: 2)。
[0069]具體而言，根據本發明使用寡核苷酸引物對來擴增HCV核酸，其中所述引物對選自:
ΛΛΛAGCΛΟΛA AGCGTCTAGCCATGGCGTTA ISEQ ID NO: 3)顧
AAAAGCAACICACCCTAI'CAGGCAGTACCACAA (SEQ ID NO； 4),
AAAAAAGCM—;AAAGC:GT(:TA(XX:ATC;GCCnTA {SEQ !O NO: _
AAAAAAGCAAGCACCCI'ATCAGGCAGTACCACAA (SEQ ID NO: 6),
AAAAA A A AGC AGA AAC.CGTCTAGCCATGGCGTTA CSEQ ID NO: 7)和
AAA A A A A AGC A AGC ACCCTATCAGGCAGrF ACXAC AA (SEQ ID MO; 8),.111TG(:AGAAAGCCrrCTAtJCC:ATCiGC:GTTA (SEQ ID NO; 9)顧
WWGC A ACC ACCCT ATC AGGC ACTF ACC AC A A CSEQ III KO; 10),
TnTrrccAGAAAGCGTCliAGCCArFGGCGTTA (StQ ID NO: 11} |l!
TFTITTGC A AGC ACCCT ATC ACGC AGT ACC AC A A (SEQ ID NO: 12),
GGGC；AGAAAGCG1X:TAGClCA-FGGCGTrA (SEQ ID NO: 13)和
CXXXAACXIACICXri'A'fCAGCXAGI'ACCACAA (SEQ ID NO: 14}
ATATGCACiAAAG(:GT€TAGCCATGGC:GTTA (SEQ ID NO； 15)和
ATATGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCAC`AA (SEQ ID NO: 16),
AAAAAACCCACTCTATGTCCGGTC (SEQ ID NO: HI
A A ATGGCGTCTCCC ACCiCGCCTGG (SEQ ID NO: 20),
ATATATGTACGCCGGAATTGiXGGAAA (SEQ ID NO; 21)和
ATATATCTTTCCCCAGGACCTGCCGGT (SEQ ID NO: 22),
和任何所述正向引物(SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、19或21)與任何反向引物(SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、20或22)的任何組合。根據本發明的一個實施方案，一種或多種額外引物可以添加到要使用于HCV擴增的引物對，具體而言第二目標特異性反向引物，例如序列 CTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT (SEQ ID NO: 32)。
[0070] 具體而言，根據本發明使用至少由引物SEQ ID NO:1和引物SEQ ID NO: 2、引物SEQ ID NO: 3 和引物 SEQ ID NO: 4、引物 SEQ ID NO: 5 和引物 SEQ ID NO: 6,SEQ ID NO:9和SEQ ID NO: 10或引物SEQ ID NO: 15和引物SEQ ID NO: 16組成的引物對。并且，具體而言，根據本發明使用由引物SEQ ID NO:1與引物SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 32，引物SEQ ID NO: 3 與引物 SEQ ID NO: 4 和 SEQ ID NO: 32，引物 SEQ ID NO: 5 與引物 SEQ IDNO: 6和 SEQ ID NO: 32，引物SEQ ID NO: 9 與引物SEQ ID NO: 10和 SEQ ID NO: 32，或引物SEQ ID NO: 15與引物SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 32組成的引物組。根據本發明使用的另一對5’ -聚N延長的引物包括以下序列的包含聚N的引物:AAACCCACTCTATGTCCGGTC(SEQ ID NO:23)和 TGGCGTCTCCCACGCGGCTGG (SEQ ID NO:24)。根據本發明使用的又一對5’ -聚N延長的引物包括以下序列的包含聚N的引物:GTACGCCGGAATTGCCGGAAA (SEQ IDNO:25)和CTTTCCCCAGGACCTGCCGGT (SEQ ID NO:26)。根據本發明的引物對可以包括至少一個額外引物，具體而言第二目標特異性反向引物。引物可以在3’-末端區域包含修飾的核苷酸，例如烷基化的核苷酸，像N4-乙基-dC、N6-甲基-dA、N4-叔丁基苯甲基_dC和N6-叔丁基苯甲基-dA以及2’-O-甲基-dU等。
[0071]本發明的寡核苷酸探針雜交到HCV基因組的區域，該區域包含在使用本發明引物擴增的區域內。探針能夠在單組雜交條件下特異性檢測來自所有類型的HCV核酸。當用于檢測用本發明的引物擴增的HCV核酸時，探針的特異性進一步增加HCV檢測的特異性，由此將假陽性的可能性減少到最小。
[0072]在一個實施方案中本發明提供了用于檢測HCV核酸的寡核苷酸探針，其中所述寡核苷酸探針包括HCV特異性核酸序列、可檢測標記，例如熒光部分和任選地淬滅部分。根據本發明的探針可以，例如由下述組成:子序列FCGGAATTGCCAGGACGACCGGP (SEQID NO: 27)或其互補物，其中F是熒光染料如例如6-羧基-熒光素并且P是3’末端磷酸基團，或子序列 CGGTGTACTCACCGTTCCGCAGACCACTATGGCTCT (SEQ ID NO: 28)或其互補物，包含花菁家族的熒光染料如例如連接到5’末端的CY5和3’末端磷酸基團，或子序列FCGGTGTACTCACCGQTTCCG CAGACC ACTATGP (SEQ ID NO: 29)或其互補物，其中F是熒光染料如例如6-羧基-熒光素，Q是非熒光淬滅劑像BHQ-2并且P是3’末端磷酸基團，或子序列GGGCGTGCCCCCGCMGACTGCTAGCCGAGTAG (SEQ ID NO: 30)或其互補物，包含至少熒光染料如例如CY5和/或熒光素，例如FAMjP 3’末端磷酸基團。在本發明的具體實施方案中，探針選自 GGGCGTGCCCCCGCAAGACTGCTAGCCGAGTAG (SEQ ID NO: 30)，包含至少熒光染料如例如CY5 和 / 或熒光素，例如 FAM，和 3’ 末端磷酸基團，CGGTGTACTCACCGTTCCGCAGACCACTATGGCTCT (SEQ ID NO: 28)或其互補物，包含至少熒光染料如例如CY5和/或熒光素，例如FAM，和3’ 末端磷酸基團，FCGGAATTGCCAGGACGACCGGP (SEQ ID NO: 27)，其中 F 是 6-羧基-熒光素并且 P 是 3’ 末端磷酸基團，FCGGTGTACTCACCGQTTCCGCAGACCACTATGP (SEQ ID NO: 29)，其中F是6-羧基-熒光素，Q是BHQ-2并且P是3’末端磷酸基團，和這些探針序列各自的互補物。
[0073]根據本發明的所有探針序列可以用技術人員已知的可選的染料標記，并可以在寡核苷酸探針的不同位置標記。
[0074]本發明的另一方面涉及用于從所有已知HCV類型擴增基因區域的方法，其包括使用至少本發明的延長的正向引物和/或延長的反向引物進行PCR，并使用本發明的探針或所述探針各自的互補物檢測擴增的DNA。本發明的引物和探針或所述探針各自的互補物使用于HCV核酸的特異性檢測的特別簡單和快速方法成為可能。[0075]本發明的另一方面涉及用于擴增和檢測HCV核酸的試劑盒，其包含至少兩種本發明的HCV特異性延長的擴增引物。這些試劑盒可以包括額外的試劑，例如本發明的探針。所述試劑盒還可以包括一種或多種擴增試劑，例如聚合酶、尿嘧啶-DNA糖基化酶、適配體、緩沖鹽、去垢劑、三磷酸核苷和其它組分，像例如甘油和/或DMS0。
[0076]通常應用于根據本發明的方法的核酸技術是聚合酶鏈式反應(PCR)，用于擴增核酸的特異性序列的方法，使得對以先前不可檢測的低量存在于樣品中的核酸的快速檢測成為可能(參見US 4.683.195 ；4.683.202和4.965.188)。檢測擴增的核酸的優選的方法是通過與序列特異性寡核苷酸探針雜交(參見Saiki等，1986，Nature 324:163-166)。
[0077]所述檢測方法可以包括但不限于結合或插入特異性染料，如溴化乙錠、SYBRGREEN或Lightcycler 480 Resolight，其插入雙鏈DNA并之后改變其熒光。具體而言，檢測步驟實時進行。通過使用可商購獲得的實時PCR設備(例如LightCycler?或COBAS? TaqMan?),PCR擴增和擴增產物的檢測可以組合在單個封閉的試管中，并具有顯著減少的循環時間(例如 EP O 912 760、EP I 033 411 ；EP O 543 942、EP O 919 565)。由于檢測與擴增同時發生，實時PCR方法排除對擴增產物操作的需要，并消除擴增產物間交叉污染的風險。實時PCR大大減少轉換時間并且是在臨床實驗室中對傳統PCR技術的有吸引力的替代。作為如在LightCycler?技術(例如EP O 912 760、EP I 033 411)中使用的實時PCR的替代，根據本發明優選應用水解或5’-核酸酶探針技術。如使用COBAS? TaqMan?實現的此技術，利用由兩種熒光部分標記的單鏈水解探針。根據熒光共振能量轉移(FRET)的原理，當第一個熒光部分由適當波長的光激發時，所吸收的能量轉移到第二個熒光部分。第二個熒光部分通常是淬滅劑分子，其還可以是非熒光淬滅劑，像BHQ-2。以這種形式使用的典型的熒光染料是例如，FAM、HEX、CY5、JA270、Cyan 500和CY5.5等。在PCR反應退火步驟過程中，標記的雜交探針結合到目標核酸(即，擴增產物)并在后續的延長階段中被Taq DNA聚合酶或如技術人員已知的另一種合適的聚合酶,例如Z05聚合酶的5’到3’核酸外切酶活性降解。其結果是，被激發的熒光部分和淬滅劑部分變得在空間上彼此分離。結果是，在不存在淬滅劑的情況下激發第一熒光部分后，可以檢測到來自第一熒光部分的熒光發射。在使用LightCycler?和COBAS? TaqMan?分析儀的兩種檢測方式中，發射信號的強度都可以與原初目標核酸分子的數目相關聯 。根據本發明具體使用水解或5’ -核酸酶探針。
[0078]作為FRET的替代，可以使用雙鏈DNA結合染料例如熒光DNA結合染料(例如SYBRGREEN I? 或 SYBRG0LD?，可從 Life Technologies (Molecular Probes)獲得，或Lightcycler 480 Resolight,可從德國 Roche Diagnostics GmbH獲得)檢測擴增產物。與雙鏈核酸相互作用后，這些熒光DNA結合染料在用光在合適的波長激發后發射熒光信號。雙鏈DNA結合染料例如核酸插入染料也可以使用(如上述)。當使用雙鏈DNA結合染料時，通常進行解鏈曲線用于驗證擴增產物的存在。
[0079]在本發明的另一個實施方案中，防止擴增產物的遺留污染，例如源自更早的PCR反應的擴增子和高分子量產物(聚合的擴增子)。防止遺留污染的普遍和有效的方式涉及尿嘧啶-DNA糖基化酶，縮寫為“UDG”或“UNG”(EC 3.2.2.3)的使用。這些包含尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的酶識別在單鏈或雙鏈DNA中存在的尿嘧啶并切割尿嘧啶堿基和脫氧核糖之間的N-糖苷鍵，留下無堿基位點，參見例如US 6.713.294。這些酶很好地降解包含尿嘧啶的小尺寸的擴增子，但對包含尿嘧啶的大尺寸的高分子量產物(聚合的擴增子)的效率較低。因此，污染后，高分子量產物可以作為后續PCR反應的目標，可能導致在陰性樣品中的假陽性測試結果或在陽性樣品中不準確的滴度。并且，污染和尿嘧啶-DNA糖基化酶的不完全降解可以導致后續PCR反應中信號抑制，并從而導致假陰性結果或無效測試結果，這是由于聚合的擴增子及其多種的引物和探針結合序列耗盡了引物和探針的混合物。因此，在PCR中防止高分子量產物對于在目標陰性和陽性樣品中獲得正確的測試結果是至關重要的。
[0080]然而，用于擴增和檢測生物樣品中的目標核酸的本發明方法具體在存在尿嘧啶-DNA糖基化酶的情況下進行。在存在尿嘧啶-DNA糖基化酶的情況下，進一步改進對擴增過程中來自先前的PCR反應的污染性高分子量產物的防止和抑制。根據本發明具體合適的是組合使用尿嘧啶-DNA糖基化酶和至少一種包含含有多個腺苷(A)和/或胸苷(T)核苷酸的聚N尾的引物。
[0081]最優化用于控制擴增反應中的遺留污染的尿嘧啶-N-DNA糖基化酶(UNG)的制備已被公開，例如在US 6.187.575中。使用UNG以防止遺留污染也已描述，參見Longo等“Useof uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerasechain reaction” (1990) Gene, 93:125-128。在 US 6.287.823 和 6.518.026 和 US2003/0077637中描述了使用UNG控制遺留污染的現有技術方法。
[0082]一般來說，此類方法涉及兩個步驟。首先，PCR測定必須包括dUTP，從而擴增子(其是潛在的遺留污染物)包含尿嘧啶。該方法涉及用dUTP替換擴增反應中一些或所有的dTTP。可選地(或另外)，一個或多個尿嘧啶堿基可以摻入擴增引物中。然而應當注意，如果引物中的尿嘧啶離5’端太近，則該方法在防止后續擴增方面效率較低。dUTP的使用不干擾PCR測定。含尿嘧啶的擴增子產生后，其可以通過標準方法檢測和分析，盡管存在替換胸腺嘧啶的尿嘧啶。
[0083]接下來，后續的PCR添加尿嘧啶-N-DNA糖基化酶。方便地，UNG在包含所有PCR組分的標準反應混合物中`是有活性的。這使得能夠將UNG加入組裝的PCR反應中，或甚至PCR預混物中。在熱循環開始之前，將反應混合物在PCR預混物的背景下對UNG活性最優的溫度下(約40°C到50°C)或在UNG有活性的溫度范圍內孵育。如果存在來自先前反應的包含尿嘧啶的污染物，UNG將切掉尿嘧啶留下無堿基位點。已知具有無堿基位點的DNA在高溫在高pH條件下是不穩定的。當熱循環開始時，這些DNA被降解。高溫還使UNG酶失活，允許產生新的包含尿嘧啶的DNA擴增子。
[0084]根據本發明具體應用的是組合使用包含尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的酶與引物，所述引物中的至少一種正向引物和/或至少一種反向引物在3’末端包含聚N尾，所述尾包含多個腺苷(A)和/或胸苷(T)核苷酸并且長度是2到10個核苷酸。
[0085]本發明的另一個目標是用于通過任何上述方法擴增和檢測生物樣品中的目標核酸的試劑盒。所述試劑盒包括至少一種包含DNA聚合酶活性的酶，具體是熱穩定的DNA聚合酶、至少一種包含尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的酶、任選包含反轉錄酶活性的酶、至少四種不同的三磷酸核苷或其它核苷單體、用于產生至少一種擴增子的至少一種聚N序列延長的正向引物和/或至少一種聚N序列延長的反向引物，其中所述延長的正向引物和/或延長的反向引物包含添加到所述引物的5’末端并與目標序列不互補的聚N序列，所述聚N序列由一種類型核苷酸或兩種不同的核苷酸組成，所述核苷酸衍生自腺苷(A)、胸苷(T)、尿苷(U)、胞苷(C)或鳥苷(G);以及至少一種對于所述擴增子特異性的可檢測的探針或DNA結合染料，以及各自的緩沖液。所述試劑盒進一步包含用于例如樣品制備的試劑、內部對照、額外引物和探針、適配體、去垢劑和緩沖液組分等。根據本發明使用的適配體是短的、單鏈DNA-或RNA-寡核苷酸(25-70個堿基)，其通過其3D結構結合特定分子(即，蛋白，Z05
DNA 聚合酶)(#MWili C.Tuerk.糊 1.Gold; Syittfoifttic evdution of ligands by exponential enrkhim'n1: RNA ligands to
bwcteriophrtgeT^I DKA polymerase, Scienct% volume 1990, p, 505-S10)。
[0086]具體合適的試劑盒是其中所述聚N序列包含長度為2到10個核苷酸的聚A、聚T、聚AT、聚U、聚C、聚G序列的試劑盒。聚N序列可以連接到至少一種引物的5’端并且在使用兩種或更多5’端延長引物的情況下，可以是相同或不同的。根據本發明的具體實施方案是使用在5’端包含相同聚N序列的引物。具體而言，根據本發明使用包含四到六個連續腺苷㈧堿基的聚N序列。
[0087]【專利附圖】

【附圖說明】
圖1:未延長的參考引物的結果:在經過60和30到60個PCR循環后，在用于高陽性對照(HPC)的PCR反應中的高分子量產物(HMWP，聚合的擴增子，少或未遷移進4%瓊脂糖凝膠)的形成；對于PCR反應進行瓊脂糖凝膠分析，分析經過60個循環后的HPC的12份重復，或各自經過30、40、50和60個循環后的三份重復；所使用的引物:SEQ ID N0:1和2 (4%瓊脂糖凝膠)。
[0088]圖2:具有2個G的5’延長的引物的結果:經過30、40、50和60個循環后，用于高陽性對照的PCR反應中的HMWP顯著減少；所使用的引物:SEQ ID NO: 13和14，每個用叔丁基苯甲基(tBu-Bn)在3’端修飾(4%瓊脂糖凝膠)。
[0089]圖3:具有4個T的5’延長的引物的結果:經過30、40、50和60個循環后，用于高陽性對照的PCR反應中的HMWP顯著減少；所使用的引物:SEQ ID NO: 9和10，每個用叔丁基苯甲基(tBu-Bn)在3’端修飾(4 %瓊脂糖凝膠)。
[0090]圖4:具有4個A的5’延長的引物的結果:經過30、40、50和60個循環后，用于高陽性對照的PCR反應中無HMWP ;所使用的引物:SEQ ID N0:3和4，每個用叔丁基苯甲基(tBu-Bn)在3’端修飾(4%瓊脂糖凝膠)。
[0091]圖5:具有6個A的5’延長的引物的結果:經過30、40、50和60個循環后，用于高陽性對照的PCR反應中無HMWP ；所使用的引物:SEQ ID NO: 5和6，每個用叔丁基苯甲基(tBu-Bn)在3’端修飾(4%瓊脂糖凝膠)。
[0092]圖6:具有8個A的5’延長的引物的結果:經過30、40、50和60個循環后，用于高陽性對照的PCR反應中無HMWP (但輕微形成引物二聚體)；所使用的引物:SEQ ID N0:7和8，每個用叔丁基苯甲基(tBu-Bn)在3’端修飾(4%瓊脂糖凝膠)。
[0093]圖7:具有2個AT的5’延長的引物的結果:經過30、40、50和60個循環后，用于高陽性對照的PCR反應中無HMWP ;所使用的引物:SEQ ID NO: 15和16，每個用叔丁基苯甲基(tBu-Bn)在3’端修飾(4%瓊脂糖凝膠)。
[0094]在5’端用三或四種不同堿基延長的引物(所謂的混合的懸垂變體，例如分別是GACTTA和CTCTAA)的結果:經過50和60個PCR循環后，在用于高陽性對照的PCR反應中適度形成HMWP ;經過30、40、50和60個循環后，對PCR反應進行瓊脂糖凝膠分析；所用的引物:SEQ ID NO: 17和18，每個用叔丁基苯甲基(tBu-Bn)在3’端修飾(4%瓊脂糖凝膠)。
實施例
[0095]所有實驗在等效實驗條件下進行(即，使用相同的預混組合物、相同的引物濃度、相同的樣品制備概況、相同的熱循環概況并且每份凝膠分析相同量的擴增子)。從而如下進行實驗:由根據本發明的修飾的引物替換預混物中的參考引物。除非在圖中另有說明，通常以5份重復測試HPC，并且PCR循環在30、40、50、60個循環后終止；擴增產物在4%瓊脂糖凝膠上分析。
[0096]實施例1:
樣品材料:
用于實驗的HPC (高陽性對照)由約5E+06 IU/mL的高滴度樣品組成，所述樣品包括在陰性人血漿中被殼的(armored) HCV RNA材料。被殼的RNA由被囊化在MS2細菌噬菌體外殼蛋白中的非感染性的體外轉錄的目標區域的HCV RNA組成(供應商即Ambion)，并包含HCV引物和探針結合區域。人血漿對于HCV RNA、HIV-1 RNA和HBV DNA是非反應性的。如果使用高滴度陽性HCV患者樣品也獲得類似結果。
[0097]核酸提取
對于核酸提取，每個反應使用ImL樣品材料。除非在圖中另有說明，通常每個實驗條件測試樣品材 料的5份重復。核酸提取方法是現有技術并且為技術人員所知
(參見_細 Sanibrook 等,2nd Edition 1989, Part 1^3, Molecular
CIO ni ιιι? A Labowtory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New
York; Oligonucleotide Syiithciii(M.J.Gait, ed., 1984》。可選地,可以使用可商購獲得的核
酸提取試劑盒，即高純度病毒核酸試劑盒(Roche Diagnostics)或C0BAS? AmpliPrep總核酸分離試劑盒(TNAI) (Roche Diagnostics)。
[0098]在此處所述實驗中，核酸提取基于C0BAS? AmpliPrep總核酸分離試劑盒(TNAI)(Roche Diagnostics)。樣本制備試劑由磁性玻璃顆粒懸浮物、裂解試劑、蛋白酶試劑、洗脫緩沖液和清洗試劑組成。在核提取前將定量標準品RNA加入樣本。通過與蛋白酶和離液裂解/結合緩沖液(其釋放核酸并保護所釋放的HCV RNA免于血清或血漿中的RNA酶)一起孵育裂解被殼的HCV顆粒和定量標準品RNA被殼的顆粒。隨后，HCV RNA和定量標準品RNA結合到磁性玻璃顆粒上。未結合的物質例如鹽、蛋白和其它細胞雜質通過清洗磁性顆粒去除。吸收的核酸在升高的溫度下用水緩沖液洗脫。
[0099]PCR反應混合物
由根據本發明的修飾的引物替換預混物中的參考引物。以大批次制備不含正向引物和反向引物的預混物。對于每個實驗，用如圖1-8中所規定的延長的引物或參考引物補充此不完全的預混物。
[0100]表1:預混物組合物
【權利要求】
1.用于擴增和檢測樣品中的核酸目標的方法，其中防止或抑制擴增過程中高分子量產物的形成，所述方法包括下列步驟: a)使所述樣品中的核酸與擴增試劑接觸，所述擴增試劑至少包含聚合酶、三磷酸核苷或其它核苷單體、用于產生至少一種擴增子的至少一種延長的正向引物和/或至少一種延長的反向引物，和至少一種對于所述擴增子特異性的可檢測的探針或DNA結合染料，其中所述延長的正向引物和/或反向引物的至少一種包含添加到所述引物的5’末端的與目標序列不互補的聚N序列，所述聚N序列由一種類型的核苷酸或兩種不同的核苷酸組成，所述核苷酸衍生自腺苷㈧、胸苷(T)、尿苷(U)、胞苷(C)或鳥苷(G)； b)將所述核酸與所述擴增試劑在足以使擴增反應發生的條件下孵育一段時間，其中所述擴增反應在50個循環之前不終止；和 c)經由所述可檢測的探針或DNA結合染料檢測所述擴增子。
2.根據權利要求1的方法，其中所述聚N序列由聚A、聚T、聚AT、聚U、聚C或聚G序列或其混合物組成，并且長度為2到10個核苷酸。
3.根據權利要求1或2的方法，其中所述聚N序列在長度上由4到6個核苷酸組成。
4.根據權利要求1的方法，其中所述目標核酸是病毒核酸。
5.根據權利要求1的方法，其中所述病毒核酸是HCV的核酸。
6.根據權利要求1的方法，其中步驟b)在存在包含尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的酶的情況下進行。
7.根據權利要求1-6的方法，其中所述添加到所述引物5’末端的與目標序列不互補的聚N序列由一種類型的核苷酸或兩種不同核苷酸組成，所述核苷酸衍生自腺苷(A)或胸苷(T)，并且孵育步驟b)在存在包含尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的酶的情況下進行。
8.根據權利要求1-7的方法，其中至少一種所述延長的正向引物包括下列的序列之
9.根據權利要求1-8的方法，其中至少一種所述可檢測的探針包括下列的序列之一: (SEQ ID NO:27), (SEQ ID NO:28), (SEQ ID NO:29), (SEQ ID NO:30)和這些序列各自的互補序列或子序列。
10.用于防止或抑制PCR擴增過程中的高分子量產物形成的方法，所述方法包括下列步驟: a)將樣品中的核酸與擴增試劑接觸，所述擴增試劑至少包含聚合酶、三磷酸核苷或其它核苷單體、用于產生至少一種擴增子的至少一種延長的正向引物和/或至少一種延長的反向引物，和對于所述擴增子特異性的至少一種可檢測的探針或DNA結合染料，其中所述延長的正向引物和/或反向引物包含添加到所述引物的5’末端的與目標序列不互補的聚N序列，所述聚N序列由一種類型的核苷酸或兩種不同的核苷酸組成，所述核苷酸衍生自腺苷(A)、胸苷(T)、尿苷(U)、胞苷(C)或鳥苷(G)； b)將所述核酸與所述擴增試劑在足`以使擴增反應發生的條件下孵育一段時間，其中所述擴增反應在50個循環之前不終止；和 c)經由所述可檢測的探針或DNA結合染料檢測所述擴增子。
11.根據權利要求10的方法，其中所述聚N序列由聚A、聚T、聚AT、聚U、聚C或聚G序列或其混合物組成，并且長度為2到10個核苷酸。
12.根據權利要求10或11的方法，其中所述聚N序列在長度上由4到6個核苷酸組成。
13.根據權利要求11-12中任一項的方法，其中所述目標核酸是病毒核酸。
14.根據權利要求11-13中任一項的方法，其中所述病毒核酸是HCV的核酸。
15.根據權利要求11-14中任一項的方法，其中步驟b)在存在包含尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的酶的情況下進行。
16.根據權利要求11-15中任一項的方法，其中至少一種所述延長的正向引物包括下列的序列之一:
17.根據權利要求11-16中任一項的方法，其中至少一種所述可檢測的探針包括下列的序列之一:
(SEQ ID NO:27), (SEQ ID NO:28), (SEQ ID NO:29), (SEQ ID NO:30)和這些序列各自的互補序列或子序列。
18.至少一種延長的正向引物和/或至少一種延長的反向引物在用于防止或抑制PCR擴增過程中的高分子量產物形成中的用途，所述至少一種延長的正向引物和/或至少一種延長的反向引物各自包含添加到各引物的5’末端的聚N序列，所述聚N序列由一種類型的核苷酸或兩種不同的核苷酸組成，所述核苷酸衍生自腺苷(A)、胸苷(T)、尿苷(U)、胞苷(C)或鳥苷(G)，所述PCR擴增在50個循環前不終止。
19.用于擴增和檢測樣品中的目標核酸的試劑盒，其中防止或抑制擴增過程中高分子量產物的形成，所述試劑盒包括: (a)至少一種包含DNA聚合酶活性的酶， (b)至少一種包含尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的酶，(c)三磷酸核苷或其它核苷單體， (d)用于產生至少一種擴增子的至少一種延長的正向引物和/或至少一種延長的反向引物，和 (e)至 少一種對于所述擴增子特異性的可檢測的探針或DNA結合染料， 其中所述延長的正向引物和/或反向引物的至少一種包含添加到所述引物的5’末端的與目標序列不互補的聚N序列，所述聚N序列由一種類型的核苷酸或兩種不同的核苷酸組成，所述核苷酸衍生自腺苷(A)、胸苷(T)、尿苷(U)、胞苷(C)或鳥苷(G)，并且長度為4到10個核苷酸。
【文檔編號】C12Q1/68GK103773841SQ201310492172
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2013年10月18日 優先權日:2012年10月18日
【發明者】R.巴比爾, F.貝格曼, D.西茨曼 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司