一種奶牛體外性控胚胎的生產(chǎn)方法

一種奶牛體外性控胚胎的生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明是一種制備奶牛體外性控胚胎的方法。本發(fā)明的特點(diǎn)是通過在胚胎培養(yǎng)液內(nèi)適時加入促進(jìn)nanog基因表達(dá)的小分子化合物vitaminA，從而顯著提高了奶牛體外性控胚胎的囊胚率。本發(fā)明對性控胚胎體外的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，獲得的性控胚胎提高了發(fā)育質(zhì)量，具有理想的妊娠率和適合產(chǎn)業(yè)化推廣等特點(diǎn)。
【專利說明】一種奶牛體外性控胚胎的生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種奶牛體外性控胚胎的生產(chǎn)方法，屬于生物與新醫(yī)藥領(lǐng)域，具體方向是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]奶牛體外性控胚胎技術(shù)是通過遺傳評估、性控精液、卵母細(xì)胞采集與成熟、體外受精、胚胎體外培養(yǎng)和胚胎移植等結(jié)合產(chǎn)生的現(xiàn)代生物技術(shù)，對充分利用珍貴的種質(zhì)資源，加快良種擴(kuò)繁和牛群遺傳改良，提高奶牛業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義。
[0003]奶牛性控胚胎可通過用性控精液獲得，或者對常規(guī)胚胎進(jìn)行PCR法性別鑒定。利用性控精液輸精的方法，由于目前商業(yè)化的性控精液均為X型精子，性控胚胎后代為雌性，并且利用X精子和Y精子DNA含量的差別利用流式細(xì)胞分離技術(shù)進(jìn)行性別控制，存在價格昂貴、效率低、性控精液受精率低和性控胚胎妊娠率低等缺點(diǎn)。通過對常規(guī)胚胎進(jìn)行性別鑒定的方法適合奶牛的育種工作，尤其是種公牛的培育，能提高育種效率。
[0004]影響性控胚胎質(zhì)量的因素很多，主要包括卵母細(xì)胞分離和體外成熟情況、胚胎培養(yǎng)液成分及比例、胚胎體外培養(yǎng)條件和胚胎凍融的損傷等。影響牛性控胚胎早期發(fā)育的一個極其重要的因素是發(fā)育阻滯。受精卵分裂的前幾個細(xì)胞周期中，其合成代謝是由貯存在卵母細(xì)胞質(zhì)中的rRNA和mRNA負(fù)責(zé) 完成的，在這個時期內(nèi)，胚胎細(xì)胞可以順利的分裂、發(fā)育。隨著胚胎的繼續(xù)發(fā)育，合子的基因開始啟動轉(zhuǎn)錄，其代謝活動逐步由母源mRNA控制轉(zhuǎn)變?yōu)楹献颖旧淼膍RNA控制。在這個過程中，胚胎對所處的環(huán)境條件特別敏感，很容易出現(xiàn)發(fā)育阻滯現(xiàn)象，發(fā)育阻滯出現(xiàn)的時間與合子基因啟動的時間有關(guān)，牛和羊胚胎發(fā)生在8-16細(xì)胞期。
目前，體外胚胎的質(zhì)量與體內(nèi)胚胎相比仍有較大差距，常出現(xiàn)發(fā)育阻滯現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)較少、卵裂球形狀不規(guī)則、存在死亡的細(xì)胞和細(xì)胞質(zhì)碎片、發(fā)育速率和抗凍性降低以及酶活性和營養(yǎng)物攝取的改變等方面。體外胚胎生產(chǎn)過程中的精子分離、體外受精、胚胎體外培養(yǎng)和胚胎冷凍保存等過程都可能干擾到配子和胚胎的基因組甲基化水平和乙?；?，影響胚胎發(fā)育調(diào)控基因和受其調(diào)控的靶基因的正常表達(dá)，這可能是導(dǎo)致IVF胚胎發(fā)育阻滯、囊胚率低、流產(chǎn)率高和發(fā)育異常的原因之一。在體內(nèi)，配子的受精和胚胎的發(fā)育過程中，基因組DNA不對稱的去甲基化、重新甲基化及組蛋白乙?；揎椶D(zhuǎn)變發(fā)生始終存在。然而，體外胚胎的發(fā)育過程中，存在高的甲基化水平以及異常的去甲基化水平。因此，體外胚胎基因組異常的甲基化修飾是導(dǎo)致胚胎發(fā)育阻滯和遲緩的重要原因。
[0005]2003年,Chambers I等發(fā)現(xiàn)一種新的ES細(xì)胞多能性維持因子Nanog,之后的研究證明Nanog在胚胎發(fā)育早期特異性表達(dá)。Nanog在早期卵裂階段沒有明顯的表達(dá)，但在桑葚胚時可檢測到它的mRNA的存在，nanog基因的表達(dá)水平受表觀遺傳的影響較大，特別是DNA的甲基化可抑制期表達(dá)，體外外部環(huán)境影響胚胎的表觀遺傳修飾。而此時的體外胚胎剛好容易發(fā)生發(fā)育阻滯。我們通過在CRlaa培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上適時加入能夠促進(jìn)nanog基因表達(dá)的小分子化合物vitaminA，從而顯著提高了奶牛體外性控胚胎的囊胚率。[0006]本發(fā)明對性控胚胎體外的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，獲得的性控胚胎提高了發(fā)育質(zhì)量，具有理想的妊娠率和適合產(chǎn)業(yè)化推廣等特點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明涉及一種奶牛體外性控胚胎的生產(chǎn)方法。
[0008]通過在胚胎培養(yǎng)液內(nèi)加入vitamin A,促進(jìn)胚胎的體外發(fā)育，到達(dá)胚胎體外胚胎培養(yǎng)的理想狀態(tài)。在體外受精后培養(yǎng)到6-7天時，可以獲得發(fā)育良好的囊胚。再通過分子生物學(xué)方法對胚胎進(jìn)行性別鑒定。從而獲得奶牛的體外性控胚胎。
[0009]其中，所述哺乳動物為奶牛，胚胎為奶牛胚胎。
[0010]所述性控胚胎的性別鑒定方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為CRlaa培養(yǎng)液，培養(yǎng)6-7天，形成的奶牛囊胚。
[0012]圖2為本發(fā)明該改良的培養(yǎng)液CRlaa+vitamin A，培養(yǎng)6-7天，形成的奶牛囊胚。
[0013]圖3 為胚胎性別鑒定電泳圖。M:分子量marker (lkb DNA ladder) ;1、2、3、4、5、6、
7、8、9、10、11、12:檢測的胚胎樣品編號。
【具體實(shí)施方式】
[0014]下述實(shí)施例中如無特殊說明所用方法均為常規(guī)方法，所用試劑均可以從商業(yè)途徑獲得。
[0015]引物合成和DNA序列測定由invitrogen公司完成。
[0016]Pencillin-streptomycin 購于 invitrogen 公司。培養(yǎng)用 TCM-199 由 Gibco 公司生產(chǎn)。其他化學(xué)試劑除特別指明外，均為Sigma公司生產(chǎn)。
[0017]培養(yǎng)皿為Nunclon公司產(chǎn)品。
[0018]RNA提取試劑盒購于Qiagen公司。
[0019]Pfu DNA擴(kuò)增酶、克隆載體、膠回收試劑盒購于Transgen公司。
[0020]克隆載體購于Transgen公司。
[0021]CRlaa培養(yǎng)液為sigma公司。
[0022]限制性內(nèi)切酶購于Takara公司。
[0023]酶切、連接、回收、轉(zhuǎn)化、PCR擴(kuò)增等分子生物學(xué)實(shí)驗操作步驟詳見《分子克隆(第
三版)》。
[0024]實(shí)施例1，卵母細(xì)胞收集 [0025]卵巢來自于天津本地的奶牛屠宰場，2小時內(nèi)將卵巢運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗室，運(yùn)輸條件為將卵巢放于滅菌后的0.9%的生理鹽水內(nèi)，含3%的Pencillin-streptomycin抗生素,運(yùn)輸溫度為36°C。卵巢運(yùn)回實(shí)驗室后進(jìn)行洗卵操作，在顯微鏡下對發(fā)育良好且由顆粒細(xì)胞均勻包被的卵母細(xì)胞進(jìn)行收集。
[0026]實(shí)施例2，卵母細(xì)胞的體外成熟
[0027]收集到的卵母細(xì)胞進(jìn)行含1% Pencillin-streptomycin的PBS溶液沖洗3次。然后放入4孔板培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)，每孔放入30個卵母細(xì)胞，培養(yǎng)液為TCM-199，每孔500培養(yǎng)箱CO2為5%，溫度為39°C，培養(yǎng)時間24小時。
[0028]實(shí)施例3，體外受精[0029]體外培養(yǎng)成熟的卵母細(xì)胞用Hepes清洗2次。
[0030]用長柄鑷子從貯藏罐中取出細(xì)管后，直接放入38°C -40°C溫水中解凍，全部融化后取出，擦干水，用專用剪刀剪開細(xì)管，套上外套管備用。
[0031]運(yùn)用上浮法使精子獲能。在150ulB0液上覆蓋無菌石蠟油形成受精滴，將30-40枚成熟的卵母細(xì)胞和2-5X IO6 / ml精子加入到受精滴內(nèi)，放入CO2箱中共培養(yǎng)18h。
[0032]實(shí)施例4，胚胎培養(yǎng)
[0033]將獲得的受精卵利用PBS沖洗干凈后，放于4孔板內(nèi)分組培養(yǎng)。培養(yǎng)液為CRlaa或CRlaa+vitamin A(IuM),每孔加入培養(yǎng)液Iml, 2天換液一次。
[0034]實(shí)施例5，胚胎性別鑒定與凍存
[0035]收集到的優(yōu)良胚胎(見附圖1)，分別在顯微操作儀下從胚胎內(nèi)獲取單細(xì)胞標(biāo)本，放入標(biāo)記好的PCR排管內(nèi)，加入20微升含蛋白激酶K的裂解液進(jìn)行細(xì)胞裂解，裂解程序為水浴55°C，5min,之后水浴95°C，5min。取好標(biāo)本后的胚胎進(jìn)行正常冷凍程序凍存，封存于細(xì)管內(nèi)，最終在液氮里長期保存待用。
[0036]在牛的Y染色體上找到一段性別鑒定片段，利用Primerf軟件設(shè)計性別鑒定引物一對如下:上游引物:5’-ctagctcgagatgttcagagtattgaacgacgatgt-3’，下游引物 1:5’_gatcgcggccgcttcaatattgaaaataagcac-3’ ),目的片段長度為 690bp (圖 3)。
[0037]PCR擴(kuò)增條件40個循環(huán)，退火溫度為65°C，DNA聚合酶為pfu DNA聚合酶，反應(yīng)體系20微升，擴(kuò)增程序詳見pfu DNA聚合酶說明書。電泳條件為2%的瓊脂糖凝膠，80U，35min。通過單細(xì)胞PCR擴(kuò)增法獲得的性別鑒定Y染色體陽性率為47.8%，性別鑒定的準(zhǔn)確度為95%。(受單細(xì)胞樣品DNA含量少的條件所限，約有2%的樣品由于假陰性誤判為雌性胚胎)
[0038]通過對目的片段的PCR擴(kuò)增、電泳分離、克隆載體連接和測序，證實(shí)該片段在雄性胚胎細(xì)胞中為陽性、雌性胚胎細(xì)胞中為陰性。目的片段回收、質(zhì)粒雙酶切、克隆載體構(gòu)建、PCR擴(kuò)增和電泳等一系列過程(方法詳見《分子克隆(第三版)》)。
[0039]實(shí)施例4，性控胚胎移植
[0040](一 )受體牛處理
[0041]使用前列腺素(PGF2CI) —次肌注，誘導(dǎo)發(fā)情。給處于情期8~15d且直腸檢查黃體的受體牛一次注射PGF2a。
[0042]( 二 )發(fā)情觀察
[0043]根據(jù)母牛接受爬跨確認(rèn)為發(fā)情、早、晚各觀察30min發(fā)清情況。對發(fā)情牛需做直腸檢查，以確認(rèn)卵泡，次日上午或晚上做直腸檢查確定是否排政若在發(fā)情后36h以后排卵的牛不能用作受體牛。
[0044](三)胚胎移植
[0045](I)受體牛檢查:移植前直檢黃體，其直徑在11~15mm以上，黃體的手感性好，質(zhì)地軟而充實(shí)。
[0046](2)受體牛的準(zhǔn)備:將受體牛保定，清除糞便，肌注2%靜松靈Iml或用2%的普魯卡因3ml在I~2尾椎間硬膜外麻醉。清洗外陰，用高錳酸鉀水沖洗消毒，用滅菌紙擦干，最后經(jīng)酒精棉球消毒。
[0047](3)器械準(zhǔn)備:先將移植槍、搶頭及金屬保護(hù)外套消毒。
[0048](4)胚胎解凍:胚胎細(xì)管從液氮內(nèi)環(huán)狀保護(hù)外套內(nèi)取出后，空氣中停留5秒鐘，放置在35-38°C溫水內(nèi)水浴20秒。用紙擦干細(xì)管以便于抓牢細(xì)管從而將插頭從細(xì)管上擰下。保留標(biāo)簽用于識別胚胎信息。胚胎細(xì)管放入移植槍內(nèi)，戴好外套。
[0049](5)胚胎移植術(shù)者用左手扒開外陰，右手持移植器插入陰道，然后左手伸進(jìn)直腸，移植器到達(dá)子宮頸口時，右手用力將移植槍捅破外套填片，插入子宮頸。左手在直腸內(nèi)誘導(dǎo)使槍頭輕輕穩(wěn)妥地插入黃體例子宮角至大彎處，持移植器的右手推出胚胎，緩慢旋轉(zhuǎn)地抽出移植槍。
[0050](6)妊娠診斷:采用直腸檢查法，在移植后2個月開始檢查。
[0051]實(shí)施例5批量定向選育優(yōu)良種公牛
[0052] (一)移植的雄性胚胎，犢牛出生后做好牛號標(biāo)記和飼養(yǎng)管理。移植性控胚胎58枚，妊娠27頭，成活23頭，均為雄性，性控胚胎的妊娠率達(dá)到46.5%，成活率達(dá)到39.6%。
[0053]( 二)犢牛生長到6月齡時，選擇生長發(fā)育優(yōu)良個體，采血獲取DNA樣品，利用基因組檢測芯片 Illumina，2011a(LD，6909SNP)或 Illumina，2011b (50K，54609SNP)進(jìn)行基因組檢測。
[0054](三)按照檢測結(jié)果對公牛進(jìn)行排序，在18-24月齡選擇GCPI育種值達(dá)到國家良種補(bǔ)貼標(biāo)準(zhǔn)的公牛進(jìn)行精液生產(chǎn)，一方面可以提前2-3年實(shí)現(xiàn)凍精的提前銷售，另一方面取少數(shù)凍精進(jìn)行后裔測定工作，30月齡時完成體型鑒定工作，5歲時通過后裔測定值，計算出常規(guī)育種方法獲得的CPI綜合育種值。
[0055](四)通過對公牛基因組育種值和后測育種值的關(guān)聯(lián)性分析，確定兩個育種值之間各性狀變量之間的相關(guān)性，選擇獲取優(yōu)良種公牛(附圖3)。
[0056](五)根據(jù)育種需要，選擇育種需求性狀變量相關(guān)系數(shù)最高的胚胎后代組合做為育種突破口，移植大量的備用胚胎資源，同時引進(jìn)和更新基因型庫，從而在5-10年的短時間內(nèi)形成種公牛穩(wěn)定和定向的選育體系。
【權(quán)利要求】
1.一種奶牛體外性控胚胎的生產(chǎn)方法。
2.通過在胚胎培養(yǎng)液內(nèi)加入vitaminA，促進(jìn)胚胎的體外發(fā)育。
3.通過分子生物學(xué)方法對胚胎進(jìn)行性別鑒定。
4.其中，所述哺乳動物為奶牛，胚胎為奶牛胚胎。
5.所 述性控胚胎的性別鑒定方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【文檔編號】C12Q1/04GK103525757SQ201310485053
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月15日
【發(fā)明者】馬毅, 姚強(qiáng), 趙慶彬 申請人:天津市奶牛發(fā)展中心