滇重樓的分子鑒定方法

滇重樓的分子鑒定方法
【專利摘要】本發明公開了一種滇重樓的分子鑒定方法，屬分子標記【技術領域】。該方法將待鑒定樣品PCR反應獲得擴增產物測序后，與滇重樓條形碼比對，當擴增產物的序列與滇重樓條形碼所示的堿基序列的相似性達到98.2%以上，且在位點1-4的堿基為CTGA、在位點19的堿基缺失、在位點77的堿基都為C、在位點138的堿基都為C、在位點792的堿基為G、在位點1110-1113的堿基為GGCG、在位點1116的堿基為G和在位點1119-1120的堿基為CC時，該待鑒定樣品為滇重樓。本發明克服了用感官審評或理化分析等方法難以鑒別滇重樓的真偽以及重樓屬下不同重樓植物的技術問題，能有效、簡便快速地對滇重樓植物進行鑒定。
【專利說明】滇重樓的分子鑒定方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及分子標記【技術領域】，具體涉及采用PCR技術對重樓屬下滇重樓植物的分子鑒別技術。/
【背景技術】
[0002]重樓屬(Paris L.)隸屬于百合科(Liliaceae)重樓族(Parideae),全屬共28種，均為多年生草本，分布于歐亞大陸的熱帶及溫帶地區。我國產22種(18種為我國特有)，并以云貴高原至四川邛崍山區為屬的分布及多樣化中心；國內各省區中，云南產16種，其中6種為云南特有,其種類多樣性又居全國之首(Ji et al.Phylogeny andclassification of Paris (Melanthiaceae) inferred from DNA sequence data[J].Annals of Botany, 2006，98:245-256)。
[0003]重樓屬是一個有著重要經濟價值的植物類群，重樓的藥用在我國有著悠久的歷史，但藥用重樓的基源一直比較混亂，本屬蚤休亞屬(Paris subg.Daiswa sensus, Jiet al.Phylogeny and classification of Paris (Melanthiaceae) inferred from DNAsequence data [J].Annals of Botany, 2006，98:245-256)的所有種類均具有粗壯的根狀莖。為澄清藥用重樓基源混亂的問題，李恒對《滇南本草》等古籍文獻進行考證，表明藥用重樓應以滇重樓(Paris polyphylla var.yunnanensis)為正品,其它種類均為代用品(李恒.重樓屬的系統發育.見:李恒(主編)，重樓屬植物.北京:科學出版社[M]，1998，8-65)。重樓以根狀莖入藥，根據形態學、解剖學等特征難以對正品及代用品進行區分，使得在藥材的收購及工廠化生產中無法將兩者區別開來；鑒于不同種類的重樓在藥用成分留體皂甙的種類、含量等方面存在顯著的差異(陳昌祥.重樓屬的植物化學.見:李恒(主編)，重樓屬植物.北京:科學出版社[M].1998，159-193)，滇重樓及代用品的混用將給中醫用藥醫藥工業生產的質量控制帶來了極大的隱患。此外，蚤休亞屬的多數種類(14種)為我國特有種，其分布區范圍均十分狹窄、種群數目和種群個體數目有限，大部分種類的生存和種群繁衍已受到嚴重的威脅，因而被《中國物種紅色名錄》(汪松，謝焱，2004)列為極威種(4種)、瀕危種(2種)和易威種(2種)，如不盡快采取保護措施還繼續將這些種類作為藥用重樓采集，無疑會加快它們滅絕的速度。因此，對滇重樓及其代用品的鑒定方法和手段進行研究，摸索一套在藥材收購和生產中行之有效的鑒定方法，對于醫藥生產的質量控制及保護重樓屬植物中的珍惜、瀕危種類有著重要的意義。
[0004]近年來，由于DNA分子標記技術在植物學中的廣泛應用，使藥用植物的鑒別工作也取得了空前的發展。傳統的鑒定手段人為干擾因素較多，而DNA分子標記在中藥鑒別中不受生長發育階段、供試部位、環境條件的影響，能從分子水平上客觀地反映待測材料之間的差異，特別適合藥材近緣品種和道地藥材的鑒定，一般能夠通過雜交或電泳等方式直觀地體現出來。從國內外研究狀況來看，由于DNA分子標記技術能客觀反映物種間親源關系和遺傳多樣性，近年來，不少學者都嘗試把它們用于藥用植物的鑒定，如Fushimi等(Fushimi H et al.18S Ribosomal RNA gene sequences of three Panax cspecies andthe correspondiing ginseng drugs [J].Biol Pharm Bull, 1996, 19:1350)通過變異等位基因擴增技術(MASA)對matK基因片段測序，發現人參與西洋參、竹節參間的matK基因片段上第102號核苷酸序列不同，以此來鑒別人參與西洋參、竹節參。曹暉(曹暉等.三七及其偽品的DNA測序鑒別[J].中藥材，2001, 24:398-402)采用PCR直接測序技術測定三七及其4種偽品的ISSrRNA基因和matK基因核苷酸序列，并作序列變異分析。丁小余(丁小余等.束花石斛及其相似種的DNA分子鑒別[J].中國中藥雜志，2002，27:13-18)等對束花石斛及其相似種玫瑰石斛、喇叭唇石斛、報春石斛、兜唇石斛等植物進行ITS (核糖體轉錄間隔區)的分析，結果顯示，束花石斛及其相似種在rdna-1ts序列上存在著顯著而穩定的差異，根據rdna-1ts區堿基序列差異，能準確鑒別束花石斛及其相似種植物及藥材。王艇(王艇等.中藥材厚樸的DNA擴增產物指紋分析研究[J].中藥材，2001，24:710-715)等采用DNA指紋技術(DAF)鑒別中藥材厚樸、凹葉厚樸及其常見的偽品、混淆品，獲得了清晰可靠的DNA指紋圖譜。
[0005] 對于滇重樓的藥材的鑒定目前主要還是利用傳統的形態鑒別方式，盡管也有學者利用滇重樓中皂甙類物質進行藥材品質的判斷依據，但由于滇重樓的藥理作用并非僅僅由單一成分決定，同時各品種所含皂甙類化學成分及含量有較大差別，因此僅用皂甙類物質鑒別藥材的品質和真偽也不具客觀性。分子方面，張金渝(張金渝等.多葉重樓遺傳多樣性的RAPD分析[J].生物多樣性，2004，12:517-522)等利用RAPD技術從植物系統分類的角度對重樓屬中的4種植物進行多態性分析，發現不同種類指紋圖譜有明顯的差異；何俊(何俊等.多葉重樓遺傳多樣性的ISSR分析[J].云南植物研究，2007，29:388-392)等采用ISSR技術對主要分布于云南的滇重樓不同居群進行多態性分析，發現不同居群的指紋圖譜也有明顯的差異，認為遺傳多樣性主要存在于居群間；但由于有限的采樣數量和所采用分子標記的低分辨率，加之上述作者并未從分子鑒定的角度對滇重樓進行研究，因此重樓屬不同種類和居群的遺傳多樣性和分子鑒定還有待進一步的研究。
[0006]條形碼技術在零售業的發展過程中起到了舉足輕重的作用，它大大節省了交易時間，提高了銷售效率。類似地，在分類學上，根據對同一目標基因DNA序列的分析，來完成物種鑒定的過程被稱為DNA Barcode編碼過程，DNA Barcode是國際上近年來發展起來的物種鑒定新技術。利用DNA Barcode技術得到的研究結果在不同物種之間具有可比性，而且它操作的簡便性和高效性將以我們無法想象的速度加快物種鑒定和進化歷史研究的步伐(Schindel et al.DNA barcoding, a useful tool for taxonomists [J].Nature.2005, 435:17)。
[0007]但到目前為止，還沒有應用DNA Barcode技術對滇重樓進行分子鑒別，更沒有滇重樓的專用條形碼的報道。本發明人特別通過引物的選擇開創性地利用DNA Barcode技術對重樓屬下滇重樓進行分子鑒定。通過2011年和2012年兩次查新檢索，目前在國內外未發現有關滇重樓植物的DNA Barcode及其分子鑒定的相關報道。

【發明內容】

[0008]本發明要解決的技術問題是克服現有技術存在難以用傳統的表型特征審評或理化分析等方法鑒別不同種的重樓的技術問題，其目的是提供一種既方便又能準確地對重樓屬下滇重樓植物的分子鑒定方法。[0009]本發明所提供的滇重樓的分子鑒定方法，包括以下步驟:
[0010]( I)對待鑒定樣品進行總DNA提取；
[0011](2)PCR反應，以步驟(1)提取的總DNA為模板，用psbA/trnH引物擴增，獲得擴增產物，所述的PsbA/trnH引物由上游引物psbA和下游引物trnH組成,所述的上游引物psbA的喊基序列如SEQ ID NO:I所不，下游引物trnH的喊基序列如SEQ ID NO:2所不；
[0012](3)將擴增產物測序后與滇重樓條形碼比對，所述的滇重樓條形碼的堿基序列如SEQ ID NO:3所示，當擴增產物的序列與SEQ ID NO:3所示的堿基序列的相似性達到98.2%以上，且在位點1-4上的堿基為CTGA、在位點19上的堿基缺失、在位點77上的堿基都為C、在位點138上的堿基都為C、在位點792上的堿基為G、在位點1110-1113上的堿基為GGCG、在位點1116上的堿基為G和在位點1119-1120上的堿基為CC時，該待鑒定樣品為滇重樓。 [0013]在步驟(1)所述的待鑒定樣品的總DNA提取中，待測樣品可以取0.5g，按照CTAB法提取總DNA，提取的總DNA樣本經RNA酶A純化后，用紫外分光光度計測定260nm和280nm下的光密度值，當測得DNA純度達到0D260/0D280在1.6-1.8之間，則將總DNA濃度稀釋到200ng/ μ I，用于步驟(2) PCR反應。
[0014]在步驟(2)所述的PCR反應中，反應熱循環程序為:94°C預變性5min ;然后進入循環，每個循環94°C變性30sec，54°C退火30sec，72°C延伸90sec，共30個熱循環，最后延伸72°C延伸7min ;4°C冷卻后取出擴增產物。
[0015]與現有技術相比，本發明的有益效果是:
[0016](I)本發明克服了現有技術中用感官審評或理化分析等方法難以鑒別滇重樓原料的真偽以及重樓屬下不同重樓植物的技術問題。
[0017](2)滇重樓主要分布于滇西北、滇東北、滇中等地，針對這些地區，本發明在前期全面地采集了滇重樓在主要分布的24個地區的樣本(還囊括了部分西南及東南樣品)，排除了滇重樓序列信息位點在不同產地個體之間的變異，通過建立滇重樓的psbA-trnH片段序列標簽，據此區分重樓屬下的不同重樓植物，使滇重樓特有的DNA條形碼更加真實有效。通過成功建立滇重樓主要分布地區的滇重樓DNA條形碼，能有效的對滇重樓植物進行鑒定，確保了滇重樓的道地性。
[0018](3)本發明通過建立的滇重樓的DNA條形碼，能輕易地將滇重樓與其他植物區分開來。
[0019](4)本發明采用葉綠體上的一段內含子區域作為目標片段，避免了因染色體基因組的復雜性帶來的PCR擴增成功的不確定性，使植物的鑒定更加容易。
[0020](5)本發明通過對重樓屬下不同重樓植物及不同來源的滇重樓植物的葉綠體片段的PCR測序分析，發現滇重樓與重樓屬下其它重樓植物在序列位點上存在穩定的差異，可以通過以下途徑來區分重樓屬下不同重樓植物，因而，本發明能準確地鑒定出滇重樓:
[0021]序列比對顯示，所有地區的滇重樓在位點1-4上的堿基都為CTGA，而其余重樓為AGAC ;所有地區的滇重樓在位點19上的堿基缺失,而其余重樓為A ;所有地區的滇重樓在位點77上的堿基都為C,而其余重樓為T ;所有地區的滇重樓在位點138上的堿基都為C,而其余重樓為T ;所有地區的滇重樓在位點792上的堿基都為G,而其余重樓為T或C ;所有地區的滇重樓在位點1110-1113上的堿基都為GGCG，而其余重樓為TCGA ;所有地區的滇重樓在位點1116上的堿基都為G,而其余重樓為T ;所有地區的滇重樓在位點1119-1120上的堿基都為CC，而其余重樓為TA、TG或GA。詳細情況見表2。通過這些滇重樓的DNA條形碼可以非常容易的對滇重樓進行鑒定。
[0022](5)本發明利用高效自動化技術測序，即縮短了實驗時間又降低了繁雜的人工測序勞作，易于對擴增樣本進行標準化分析，提高了數據的可靠性。
[0023]序列表中SEQ ID NO:1所示的堿基序列是psbA/trnH引物的上游引物psbA的堿
基序列。
[0024]序列表中SEQ ID NO:2所示的堿基序列是psbA/trnH引物的下游引物trnH的堿基序列
[0025]序列表中SEQ ID NO:3所示的堿基序列是滇重樓條形碼。
【具體實施方式】
[0026]以下實施例無特別說明為常規方法。
[0027]本發明的主要儀器:
[0028]DYY — 8C型電泳儀(北京六一儀器廠)；臺式冷凍離心機(Beckman Coulter)；PCR 儀(MJ Research (Waltham, MA, USA) PTC200-well thermal cycler);紫外分光光度計(UV-2550型，SHIMADZU公司)、凝膠成像系統等。
[0029]實施例1滇重樓條形碼的構建
[0030]1、滇重樓樣本的 采集
[0031]滇重樓主要分布于滇西北、滇東北、滇中地區，針對這些地區，本發明在前期全面地采集了滇重樓在主要分布的24個地區的樣本(還囊括了部分西南及東南樣品)，詳見表1，排除了滇重樓序列信息位點在不同產地個體之間的變異，使滇重樓特有的DNA條形碼更加真實有效。所采集的滇重樓樣本均經植株形態鑒定確認是滇重樓。另外，還采集了重樓屬下的其它不同種，用于區別滇重樓DNA條形碼與其它種之間序列的差異。
[0032]2、樣本DNA的提取
[0033]樣本各0.5g,分別按照改進的 CTAB法(Doyle J.DNA protocols for plants-CTABtotal DNA isolation.1n:Hewitt GM,Johnston A,eds.Molecular techniques intaxonomy.Berlin:Springer, 1991, 283-293.)提取基因組 DNA(見第二章)。提取的 DNA 經純化后，用紫外分光光度計測定260nm和280nm下的光密度值，當測得DNA純度達到0D260/0D280在1.6-1.8之間，則將總DNA濃度稀釋到200ng/ μ 1，用于PCR反應。擴增反應在PCR儀上進行。如果用紫外分光光度計測定260nm和280nm下的光密度值，測得DNA純度沒有達到0D260/0D280在1.6-1.8之間，表明DNA純度不夠，易造成擴增不成功，需重新提取DNA。
[0034]3、選擇目標片段引物
[0035]選擇位于葉綠體基因組上的psbA-trnH片段作為擴增的目標片段，RNA酶、dNTP、PCR reaction buffer,均購自上海生工和寶生物公司；
[0036]弓丨物為psbA/trnH,psbA/trnH引物,所述的psbA/trnH引物由上游引物psbA和下游引物trnH組成，所述的上游引物psbA的堿基序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物trnH的喊基序列如SEQ ID NO:2所不。
[0037]4、PCR 擴增
[0038]樣本DNA加入psbA/trnH引物進行擴增，反應熱循環程序為:94°C預變性5min ；然后進入循環，每個循環94°C變性30sec，54°C退火30sec，72°C延伸90sec，共30個熱循環，最后延伸72°C延伸7min ;4°C冷卻后取出；擴增反應在PCR儀上進行。PCR反應體系(25 μ L): ddH2017.8 μ L, 10 X PCR buffer (Mg+2+Plus) 2.5 μ L, dNTPs (2.5mmol/L) 1.5 μ L，Tag 酶(5u/μ L) 0.2 μ L，正向引物(10 μ mol/L) I μ L,反向引物(lOymol/L) I μ L,模板 DNA (50ng/ μ L) 1.0 μ L。
[0039]5、PCR產物純化及測序
[0040]將擴增成功的PCR產物(出現明顯PCR條帶)進行純化后(采用上海生工核酸凝膠純化試劑盒)，送上海生工測序中心使用ABI3730XL測序儀(Applied BiosystemsC0., USA)雙向測序。
[0041]6、數據處理和分析
[0042]測序峰圖米用序列拼接軟件CodoncodeAligner v2.06 (CodonCodeC0., USA)校對拼接，去除低質量序列及引物區，利用clustalX v2.0(HigginsD.G)進行多序列比對并查錯，得到序列表中SEQ ID NO:3所示的堿基序列，即是滇重樓條形碼。
[0043]7、結果與分析
[0044](I)PCR擴增效率和測序成功率
[0045]PCR擴增效率和測序成功率是評價DNA條形碼序列的一個重要指標，實驗表明，psbA-trnH片段在重樓屬植物中擴增非常容易，測序成功率高，適合做為重樓屬植物的條形碼序列。
[0046](2) DNA條形碼序 列種內種間差異分析
[0047]理想的DNA條形碼序列應當具有明顯的種間變異，同時種內變異足夠小。實驗表明，psbA-trnH片段在滇重樓種內變異幅度在0.0%-1.8%之間，而種間變異程度在
4.0%-6.2%之間，因此該序列適合做為重樓屬植物的條形碼序列，且很容易將不同種重樓鑒別開來。
[0048](3)在重樓屬藥用植物材鑒定中的作用
[0049]本實驗中，發明人為排除滇重樓不同產地個體間存在的變異信息，找到滇重樓特有的區別與其它重樓的信息位點，便從取樣策略上，廣泛采集了滇重樓所分布的區域，以此來確保滇重樓條形碼的準確性。通過比對發現，葉綠體上的psbA-trnH片段在滇重樓種內變異很小，即不同產地間個體的序列相似性達到(98.2%-100%)，說明該片段在滇重樓種內的信息位點很穩定；而種間比較發現，滇重樓與重樓屬下的其它重樓種間的序列相似性低于96%，即該片段在種間變異幅度較大，可以輕易地將不同種重樓區分開來。因此僅從序列的相似性程度就可以將滇重樓與其它重樓種區分開來。
[0050]另外，為了找到滇重樓特有的DNA條形碼，發明人通過序列比對分析，找出了滇重樓內部穩定的信息位點，而這些位點恰恰區別于重樓屬下的其它重樓植物，詳細信息見表
2。通過這些特有的信息位點，可以輕易的將滇重樓植物與重樓屬下的其他重樓植物鑒別開來。
[0051]本實驗通過對葉綠體基因組部分片段進行研究，結果顯示，psbA-trnH片段序列兩端的序列都很保守，便于通用引物的設計，序列在種內變異穩定，種間存在較大幅度變異，易于重樓屬植物的鑒定，適合做滇重樓的DNA條形碼，該條形碼的發現對于滇重樓道地藥材的保護利用具有十分重要的作用。[0052]表1本實驗中所采集的滇重樓樣本收集信息情況
【權利要求】
1.滇重樓的分子鑒定方法，包括以下步驟: (1)對待鑒定樣品進行總DNA提取； (2)PCR反應，以步驟(1)提取的總DNA為模板，用psbA/trnH引物擴增，獲得擴增產物，所述的psbA/trnH引物由上游引物psbA和下游引物trnH組成,所述的上游引物psbA的喊基序列如SEQ ID NO:I所不，下游引物trnH的喊基序列如SEQ ID NO:2所不； (3)將擴增產物測序后與滇重樓條形碼比對，所述的滇重樓條形碼的堿基序列如SEQID NO:3所示，當擴增產物的序列與SEQ ID NO:3所示的堿基序列的相似性達到98.2%以上，且在位點1-4上的堿基為CTGA、在位點19上的堿基缺失、在位點77上的堿基都為C、在位點138上的堿基都為C、在位點792上的堿基為G、在位點1110-1113上的堿基為GGCG、在位點1116上的堿基為G和在位點1119-1120上的堿基為CC時，該待鑒定樣品為滇重樓。
2.根據權利要求1所述的滇重樓的分子鑒定方法，在步驟(1)所述的待鑒定樣品的總DNA提取中，待測樣品取0.5g，按照CTAB法提取總DNA，提取的總DNA樣本經RNA酶A純化后，用紫外分光光度計測定260nm和280nm下的光密度值，當測得DNA純度達到0D260/0D280在1.6-1.8之間，則將總DNA濃度稀釋到200ng/μ 1，用于步驟(2) PCR反應。
3.根據權利要求1或2所述的滇重樓的分子鑒定方法，在步驟(2)所述的PCR反應中，反應熱循環程序為:94°C預 變性5min ;然后進入循環，每個循環94°C變性30sec，54°C退火30sec，72°C延伸90sec，共30個熱循環，最后延伸72°C延伸7min ;4°C冷卻后取出擴增產物。
【文檔編號】C12Q1/68GK103484558SQ201310484979
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年10月16日 優先權日:2013年10月16日
【發明者】劉濤, 楊生超, 謝世清, 年麗菊, 李瑪, 王玲 申請人:云南農業大學