干細胞衍生的視網膜色素上皮細胞的制作方法
【專利摘要】本發明涉及可通過從干細胞、特別是人類干細胞定向分化獲得的RPE細胞。已經特別發現的是，在存在TGF超家族的一種或更多種成員例如激活蛋白A的情況下培養干細胞誘導定向分化為成熟的和功能性的RPE細胞。這通過對成熟RPE細胞特異的標志物，包括MiTF-A、RPE65或斑萎蛋白的表達被證明。根據一個特定的實施方式，所述細胞是在先用煙酰胺（NA）培養的，發現了這增強細胞對TGF超家族的一種或更多種成員的誘導效應的反應。本發明還提供了進行定向分化的方法，以及利用產生的RPE細胞的方法。
【專利說明】干細胞衍生的視網膜色素上皮細胞[0001]本申請是申請號為200880020748.0、申請日為2008年4月27日、發明名稱為“干細胞衍生的視網膜色素上皮細胞”的中國專利申請的分案申請。發明領域[0002]本發明涉及生產已分化的視網膜色素上皮細胞(RPE)的方法和系統，并涉及由此獲得的RPE細胞的治療用途。[0003]相關技術的列表[0004]以下是被認為是對描述本發明領域的現有技術水平相關的參考文獻的列表。[0005](I)Strauss 0., The retinal pigment epithelium in visual function ； Physiol.Rev.85:845-881, 2005.[0006](2) Lund RD.et al., Cell transplantation as a treatment for retinal disease ；Prog Retin Eye Res20:415-449,2001.[0007](3)Haruta M.,Embryonic stem cells !potential source for ocular repair ； Semin Ophthalmol.20 (I): 17-23,2005.[0008](4) Haruta M.et al., In vitro and in vivo characterization of pigment epithelial cells differentiated from primate embryonic stem cells ；Invest Ophthalmol Vis Sci45:1020-1024，2004.[0009](5)Aoki H.et al.,Embryonic stem cells that differentiate into RPE cell precursors in vitro develop into RPE cell monolayers in vivo ；Exp Eye Res.82 (2):265-274,2006.[0010](6) Klimanskaya 1.et al., Derivation and comparative assessment of retinal pigment epithelium from human embryonic stem cells using transcriptomics ；Cloning Stem Cells6 (3):217-245,2004.[0011](7)Lund RD.et al.,Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats ；Cloning Stem Cells8 (3): 189-199,2006.
[0012](8) PCT 申請公開 N0.W006/070370o[0013]發明背景[0014]視網膜色素上皮細胞(RPE)的功能障礙、損傷和喪失是某些眼部疾病和病癥的突出特征，例如年齡相關的黃斑變性(AMD)、遺傳性黃斑變性，包括Best病(卵黃樣黃斑營養不良的早期發作的形式)和色素性視網膜炎(RP)的亞型。這些疾病的可能的治療是RPE(和光受體)移植到受疾病影響的那些的視網膜中。相信的是，通過RPE細胞移植的RPE細胞補充可以延緩、停止或逆轉退化，改善視網膜功能和預防源自這些狀況的失明。[0015]斑(macula)，視網膜的中心部分，對于精細的可視細節和色彩感覺負責，并且對于我們許多日常的視覺工作例如面部識別和閱讀是關鍵的。在普遍的視網膜退化例如色素性視網膜炎(RP)中，以及在更特異性地靶向斑區域的不同疾病如年齡相關的黃斑變性(AMD) 和Best病中，作為疾病過程的部分，斑常常受影響。在許多這些疾病中，原發的功能障礙和衰竭在視網膜色素上皮細胞(RPE)中發生，視網膜色素上皮細胞位于光受體的底部。[0016]高度專門化的RPE細胞在支持光受體功能方面起到重要作用:它們從脈絡膜血管主動轉運營養物，參與維生素A的再循環，維生素A是光受體中發色團所必需的，以及作為這些細胞的正常更新過程的一部分攝取并再循環脫落的光受體外部片段、[0017]在RP的亞型Best病和AMD中，RPE的衰竭最終導致視覺喪失和失明。替換這些細胞是可能的治療介入2，但是從人類供體或胚胎獲得這樣的細胞是困難的。如果可以闡明使人類胚胎干細胞細胞定向分化成為功能性RPE細胞的方式，人類胚胎干細胞(hESC)可以充當RPE細胞潛在無限的供體來源3。早先已經描述了使hESC定向分化成為神經前體細胞(NP)高度富集的培養物的方法(Reubinoff BE.et al., Neural progenitors from human embryonic stem cells ；Nat Biotechnoll9:1134-1140,2001 ；Itsykson P.et al., Derivation of neural precursors from human embryonic stem cells in the presence of noggin ；Mol Cell Neurosc1.30 (I): 24-36, 2005)。此外，已經體外和體內地顯不了 hESC在嚙齒動物中移植到視網膜下間隙之后產生視網膜細胞的潛力(Banin E.et al.， Retinal Incorporation and Differentiation of Neural Precursors Derived from Human Embryonic Stem Cells ；Stem Cells24 (2):246-257,2006.)[0018]已經展現了小鼠和非人靈長類ESC分化成為RPE細胞，以及在移植后存活和減慢視網膜退化的潛力4’5。顯示了 hESC向RPE的自發的分化，然而，分化過程的效率是低的，需要相當的分化時間，在4-8周的分化后僅獲得僅很低百分比(〈1%)的含RPE細胞的群集。此外，雖然在RCS大鼠中在這些RPE細胞的視網膜下移植之后觀察到改善的視網膜功能，移植的細胞作為真正的成熟RPE細胞的功能沒有展現，這種效應可能潛在地與非RPE特異性營養效應相關6A A 10O[0019]近來還顯示了，hESC可以被定向可再生地分化成為RPE細胞，其中hESC的定向的而非自發的分化成為RPE的結局在存在煙酰胺(NA)的情況下發生8。[0020]發明概述[0021]根據第一個方面，本發明提供了轉化生長因子(TGF-β )超家族的成員用于制備培養系統的用途，所述培養系統用于促進人類干細胞(hSC)定向和增加分化為視網膜色素上皮(RPE)細胞。[0022]根據第二個方面，本發明提供了促進hSC定向分化為RPE結局的方法，所述方法包括:[0023](a)提供包含hSC的細胞培養物；和[0024](b)在培養系統中培養所述細胞培養物中的細胞，所述培養系統包含補充有TGF3 超家族的一種或更多種成員的基礎培養基，從而所述hSC被促使趨向定向分化為RPE結局。[0025]根據第三個方面，提供了細胞培養物，其包含通過在存在TGF0超家族的一種或更多種成員的情況下hSC的定向分化所獲得的RPE細胞。優選的，所述RPE細胞是通過在此公開的方法獲得的終末分化的(成熟的)RPE細胞。如在此將顯示的，這樣的RPE細胞展現了幾種特征性性狀，其不同于當hSC自發地分化成RPE細胞時所獲得的性狀。優選的，所述RPE細胞能夠在它們的分化期間響應于TGF`ii信號傳導。[0026]根據第四個方面，提供了將hSC衍生的RPE細胞移植到受試者的眼睛中的方法，所述RPE細胞通過所述hSC的定向分化獲得,所述方法包括[0027](a)提供包含hSC的細胞培養物；[0028](b)在培養系統中培養所述細胞培養物，所述培養系統包含補充有TGF β超家族的一種或更多種成員的基礎培養基，從而所述hSC被誘導分化成RPE細胞；[0029](c)從所述細胞培養物收獲RPE細胞；和[0030](d)將所述RPE細胞移植到所述受試者的眼睛中。[0031]根據第五個方面，提供了細胞培養系統，其包含通過所述hSC的定向分化所獲得的可移植的hSC衍生的RPE細胞。所述移植的RPE細胞展現了一種或更多種參數，所述參數表明所述移植的細胞在所述受試者眼睛內是功能性的。所述移植的RPE細胞的功能性通過它們攝取光受體的脫落的外部片段同時改善視網膜功能的能力來展現。[0032]在此公開的方法的培養系統中的hSC是分化中的hSC，即，基本上處于未分化的狀態的hSC的群體，或者其中至少部分所述細胞已經被誘導經歷了定向分化的初始階段， 以及有的時候，大部分所述細胞已經被誘導經歷了定向分化的初始階段。根據一個實施方式,分化的初始階段通過先期將細胞暴露于NA來實現，而當未分化的細胞共同暴露于NA和 TGF^超家族的一種或更多種成員時分化的初始階段也將發生。不受理論的限制，假定的是，對NA的先期暴露(在與TGF β超家族的一種或更多種成員孵育之前)引起細胞趨向定向分化(與自發的分化相對)成為具有特定RPE形態的RPE細胞，這將在下文進一步討論。[0033]根據優選的實施方式，hSC是人類胚胎干細胞(hESC)。[0034]根據一個實施方式,在包含TGFP超家族的一種或更多種成員的培養基中培養細胞是在hSC具有初始的分化、定向分化，優選的由NA導致定向分化之后至少兩天。[0035]根據第五個方面，提供了在受試者中治療或預防視網膜疾病或病癥(其包括視網膜色素上皮的功能障礙、損傷和/或喪失)的方法，所述方法包括向所述受試者眼內移植 hSC衍生的RPE細胞，所述RPE細胞通過誘導hSC趨向定向分化來獲得。可移植的RPE細胞優選的通過在此公開的方法獲得。[0036]附圖的簡要描述[0037]為了理解本發明和顯示它如何實際上進行，現在將參考附圖通過僅非限制性的實例來描述優選的實施方式，在附圖中:[0038]附圖1A-1E:實時PCR，分析存在NA的情況下RPE標志物的表達。hESC的分化通過將它們作為自由浮動的群集(cluster)來培養來誘導。在6周的分化時，RPE標志物MiTF-A (附圖1A)和RPE65 (附圖1B)的表達水平在存在NA的情況下顯著增加。在連續時點的實時PCR分析展現了，在存在NA的情況下MiTF-A (附圖1C)和RPE65 (附圖1D)的表達水平隨著時間逐漸提高。包括斑萎蛋白(Bestrophin)、CRALBP和Mertk的RPE標志物的其他轉錄產物的表達通過平板接種的色素化的群集的RT-PCR分析來展現(附圖1E)。+/_分別表示逆轉錄酶的存在或缺乏。[0039]附圖2A-2F:NA的RPE分化誘導效應不取決于特定的培養基組成。在KO培養基中(附圖2A)，或在補充有N2的Neurobasal培養基中、其I周`后用補充有B27的DMEM/F12 (NN培養基)替換(附圖2C)，分化12周的hESC群集的暗視野顯微照片。在兩種培養基中， NA增加了朝向色素化細胞的分化(附圖2B，D)，而已分化的hESC群集的大小和它們的總數在用NN培養基時較小(白色箭頭標出分化中的群集內的色素化區域)。在RNA水平上，在兩種培養基中，NA增添提高了 MiTF-A和RPE65的表達水平(分別附圖2E和F)。[0040]附圖3A-3L:hESC的自由浮動群集內的黑色素表達細胞是推定的RPE細胞。具有高度富集色素化細胞的限定區域的分化中的hESC的自由浮動群集的暗視野顯微照片(附圖3A)。在解離和平板接種之后與抗0tx2和MiTF免疫反應性的色素化細胞的熒光(附圖 3B)和相差(附圖3C)圖像。顯示了在表明限制的色素化區域的平板接種之后分化中的群集的暗視野顯微照片(附圖3D)。在色素化區域內具有RPE細胞典型的形態學特征的細胞的相差圖像(附圖3E)。間接的免疫熒光染色顯示了，這些細胞表達RPE細胞的標志物，包括MiTF (附圖3F)、Z0-1 (附圖3G)、斑萎蛋白(附圖3H)、RPE65 (附圖31)和CRALBP (附圖 3J)。在解離之后，低密度平板接種并培養，色素化細胞失去了色素沉著并獲得了纖維樣的形態學(相差圖像K附圖3K)。在進一步延長培養和增殖成高密度培養物之后，細胞再次獲得了表示RPE細胞特征的形態和色素沉著(附圖3L)。[0041]附圖4A-4E:激活蛋白A誘導RPE分化。人類ESC被容許作為自由浮動群集在存在或不存在激活蛋白A的情況下分化6周，激活蛋白A在分化第一周之后添加。群集的暗視野顯微照片顯示了，激活蛋白A顯著地提高包括色素化細胞的群集的百分比(附圖4A、B)(白色箭頭標出分化中的群集內的色素化區域，某些群集內色素化區域的邊界由虛線標出)。在存在激活蛋白A的情況下，色素化的區域的邊界更為清晰地與群集內圍繞的非色素化區域分開。此外，色素化的細胞在存在激活蛋白A的情況下是更暗色的(附圖4B)。在RNA水平上，實時PCR分析顯示了，RPE65 (附圖4D)和斑萎蛋白(附圖4E)的表達在存在激活蛋白A 的情況下顯著提高。MiTF-A的表達不被激活蛋白A處理改變(附圖4C)。[0042]附圖5A-5G =BMPs和TGF β 3在RPE分化中起作用。人類ESC作為自由浮動群集被誘導分化6周。偶爾觀察到自發分化成色素化細胞(附圖5Α)，但是當培養基補充NA時顯著提高(附圖5Β，最左側和左側暗視野圖像；白色箭頭標出分化中的群集內色素化的區域)。 在不存在(附圖OT)和存在(附圖5C)NA的情況下，培養基補充頭發生素(noggin)阻斷了分化成為色素化細胞。在RNA水平上，實時PCR分析顯示了，在存在和不存在NA的情況下，頭發生素都降低了 MiTF-A的表達水平(附圖5E)。當在存在NA的情況下在hESC群集的分化期間將TGFβ 3添加給培養基時，它顯著地增加了 MiTF-A (附圖5F)而非RPE65 (附圖5G) 的表達水平。[0043]附圖6A-6J:在大鼠眼中移植的hESC衍生的RPE細胞的存活和整合。在hESC衍生的RPE細胞的眼內移植之后，色素化的細胞可以在白化大鼠的眼睛中容易地體內鑒定(附圖6A，6B)。在剜出眼睛(附圖6B)和除去角膜和晶狀體之后，可以看見主要的移植物和其他分散的色素化斑點(附圖6C)。在組織切片中，包括也共表達GFP的暗色色素化細胞的移植物可以被鑒定(附圖6D-6G)，證明了細胞是hESC衍生的的事實。移植的細胞可以在玻璃體內區域中、視網膜和晶狀體之間(附圖6H)、視網膜中(偶爾地沿著注射的管道伸入玻璃體內)(附圖61)以及在視網膜下間隙(附圖61、60，6P)中找到。移植的h ESC衍生的RPE細胞(用箭頭標出的色素化的細胞)整合到白化大鼠的RPE層中(附圖6J)。在對照的非移植的眼的RPE層中沒有觀察到色素化細胞。在移植物內，用ZO-1 (附圖6K-6N)的免疫染色顯示了在移植的GFP+hESC衍生的細胞之間存在緊密連接。這種連接是RPE細胞的特征。在移植到患有RPE功能障礙和視網膜退化的RCS大鼠的視網膜下間隙中之后，與遠離移植物的區域相比(由箭頭標出)，光受體層的相對保存可以在靠近移植物處見到(附圖60;矩形內的區域由星號標記，在附圖6P中擴大)。注意到大量移植的hESC衍生的RPE細胞具有多邊形的形狀和鵝卵石樣外觀(附圖6P)(星號)。在此處顯示的所有情況中，RPE細胞來源于不存在激活蛋白A的情況下的hESC。[0044]附圖7:電子視網膜成像記錄顯示了，hESC衍生的RPE細胞的移植提供了在營養不良的RCS大鼠的眼睛中視網膜功能的拯救。與同伴的非移植的對照眼相比，在來自hESC的 RPE細胞的移植之后在RCS大鼠眼中全視野ERG反應更高(n=ll只大鼠)。用于這些實驗的 RPE細胞是沒有向培養基添加激活蛋白A來衍生的。顯示了對不斷提高強度的四次刺激的暗適應的混合的視錐-視桿反應的b-波幅。[0045]附圖8A-81:顯示了在誘導來自hESC的色素化細胞發育中NA的效果的形態學和標志物表達的分析。暗視野顯微照片顯示了在存在(附圖8A、8C和SE)或不存在(附圖SB、 8D或8F)NA (白色箭頭標出分化中的群集內的色素化區域)的情況下，在hESC衍生的群集培養4周(附圖8A、8B)、6周(附圖8C、8D)和8周(附圖8E、8F)期間色素化細胞的逐漸出現。 在補充有NA的培養基中(粗線的柱)和在對照培養物(細線的柱)中在培養期間不同時點， 含有色素化區域的群集的百分比的直方圖表示(附圖SG)。在具有NA補充的8周培養期間， 色素化細胞(附圖8H)和對早期RPE標志物抗MiTF免疫反應性的細胞(附圖81)的百分比的直方圖表示。標尺柱:(A) 200mm ;*p〈0.05 ;**p〈0.001。[0046]附圖9A-9S:顯示了在hESC分化中的群集中隨著時間的RPE發育進展的實時PCR、 免疫染色和流式細胞術分析。(附圖9A-9L)實時PCR，分析了在存在(粗線的柱)或不存在 (細線的柱)NA的情況下培養的群集中RPE發育中關鍵基因的表達的時機。在hESC衍生的群集的8周分化期間在連續的時點分析了以下標志物的逐步表達:hESC特異性標志物0ct4 (附圖9A);早期神經標志物0tx2 (附圖9B)、Musashi (附圖9C)和Pax6 (附圖9D);視網膜祖代標志物Six3 (附圖9E)、Rxl (附圖9F)和ChxlO (附圖9G) ；RPE標志物MiTF-A (附圖 9H)、RPE65 (附圖91)和斑萎蛋白(附圖9J);光受體祖代標志物Crx (附圖9K);黑色素細胞發育標志物SoxlO (有橫條的柱，附圖9L) (M51黑素瘤細胞系被用作對照)。在具有(粗線)或缺乏(細線的柱)NA的情況下8周的群集分化中，展現了 hESC特異性標志物TRA-1-60 (附圖9M)和神經祖代標志物PSA-NCAM (附圖90)的逐步表達的FACS分析。在存在NA的情況下分化2周和4周的群集內，表達早期神經標志物:PSA-NCAM (粗線的柱)、巢蛋白(有橫條的柱)、Musashi (細線的柱)、Pax6 (縱條紋的柱)的細胞的百分比的間接免疫熒光分析 (附圖9N)。免疫熒光圖像，表現了表達這些標志物的細胞，PSA-NCAM (附圖9P)、巢蛋白(附圖 9Q)、musashi (附圖 9R)、Pax6 (附圖 9S)。[0047]附圖10A-10J:形態學、標志物表達和功能的分析，顯示了 hESC的自由漂浮的群集內色素表達細胞是推定的RPE細胞。鬼筆環肽染色顯示了表現RPE的特征的hESC衍生的色素化子代內F-肌動蛋白的分布(附圖10A);在解離、低密度平板接種并培養之后，色素化細胞失去色素沉著并獲得纖維樣形態(相差圖像，I周培養)(附圖10B)。在進一步延長培養和增殖成高密度培養物之后，細胞再次獲得了表示RPE細胞特征的形態和色素沉著(1.5個月的培養)(附圖10C)。hESC衍生的RPE細胞的電子顯微鏡分析 ，顯示了作為RPE的特性的特征:微絨毛(附圖10D)、基膜(附圖10E)、黑色素顆粒(附圖10D)、緊密連接(附圖10F)。 相差(附圖10G)和熒光圖像(附圖10H-J)顯示了 hESC衍生的色素細胞的綠色熒光膠乳珠子的吞噬作用(白色箭頭)；細胞膜用紅色熒光染料PKH染色(灰色)。三幅共焦熒光圖像表現了連續的Z軸切片(附圖10H-J)。[0048]附圖11A-11P:形態學和基因表達的分析，顯示了來自TGFβ家族的因子促進朝向 RPE結局的分化。分化4周的hESC衍生的群集的暗視野顯微照片顯示了在存在激活蛋白的情況下在這個早期階段色素化細胞的出現(附圖11A)，以及與僅有NA (附圖11B)相反的， 在存在激活蛋白A和NA的情況下(附圖11C)色素化群集分化的數量的提高。與激活蛋白 A類似，補充TGFii I同樣提高了色素化群集的出現(附圖11D)。相比之下，激活蛋白信號傳導途徑的抑制物SB431542與激活蛋白A和NA—起的應用降低了激活蛋白A對色素化群集出現的效力(附圖HE)。色素化群集的發育還通過在存在FGFii與NA的情況下培養細胞而被消除(附圖HF)。激活蛋白受體和激活蛋白A的轉錄產物的表達通過在存在或缺少 NA的情況下培養的2周齡群集、以及未分化的hESCs作為對照的RT-PCR分析來展現(附圖 11G)。在存在嫩、嫩+4(^4、嫩+58431542、嫩+々(^4+58431542、嫩+了6?0 I的情況下在培養4 周后含有色素化區域的群集的百分比的直方圖分析(附圖11H)。在NA (粗線的柱)或激活蛋白A和NA (對角條紋的柱)添加的4周培養之后色素化細胞的百分比的直方圖分析(附圖 111)。在不同濃度的激活蛋白A下色素化細胞的百分比的直方圖分析(附圖11J)，以及RPE 標志物斑萎蛋白(附圖11K)和RPE65 (附圖11L)的轉錄產物的表達水平，所述激活蛋白A 濃度對于RPE誘導140ng/ml是最佳的。在有(對角條紋的柱)或沒有(粗線的柱)激活蛋白 A添加、存在NA的情況下的hESC分化中，激活蛋白A對視網膜和RPE基因，斑萎蛋白(附圖 llM)、MiTF-總(附圖llN)、Rxl (附圖110)和ChxlO (附圖1IP)的表達水平的作用的實時 PCR時間-過程分析。**p〈0.005.(白色箭頭標出分化中的群集內的色素化區域)。[0049]附圖12A-12E:來自用NA和激活蛋白A處理的hESC的RPE細胞在營養不良的RCS 大鼠眼睛中的視網膜下移植之后存活。色素化細胞的群集可以使用眼底成像系統(附圖 12A-12C);眼底照像(附圖12A)和無紅光照像(附圖12B)來容易地在RCS大鼠的眼睛中體內鑒定，其顯示了移植物的視網膜下的位置(注意到視網膜血管經過色素化區域)。hESC衍生的GFP表達細胞可以在熒光激發和使用發射濾波器時被看見發射熒光(附圖12C)。在熒光顯微鏡中離體(ex vivo)成像的眼杯制品中(附圖12D-12E)，可以看見視網膜下的GFP陽性細胞的大的群集(附圖12D)以及多個分散的較小的群集(附圖12E)。[0050]附圖13A-13F:在RCS大鼠眼睛中視網膜下hESC衍生的激活蛋白A處理的RPE細胞移植物的組織學外觀。蘇木素和曙紅(附圖13A和1B)染色的組織切片顯示了視網膜下的和偶爾地視網膜內位置的移植的hESC衍生的色素化細胞，其以群集或作為分離的細胞出現(箭頭)。使用GFP的免疫染色(附圖13C-13F)確認了這些細胞確實是hESC衍生的。移植物常常是十分大的和分散的(附圖13C，13E)，共同表達GFP的色素化細胞可以明顯地看出(附圖13D，13F)。注意到GFP陽性色素化細胞整合在宿主的RPE層之內(附圖13D，箭頭)。[0051]附圖14A-140:移植的hESC衍生的色素化細胞表達成熟RPE的標志物。免疫染色揭示了，移植物內大量的移植的細胞表達作為成熟RPE細胞的特征的蛋白質，包括RPE特異性標志物RPE65 (附圖14A-14E)和斑萎蛋白(附圖14F-14J)以及緊密連接標志物ZO-1 (附圖14K-140)。附圖14A、14F和14K顯示了共表達GFP和相關標志物的移植物的低放大率熒光圖像。在每一排的高放大率共焦圖像顯示了在單個細胞水平下色素(通過Nomarski光學器件)以及GFP和不同標志物的共表達。這些系列確認了這些細胞確實是hESC衍生的，以及它們在體內表達成熟RPE的標志物。在附圖14M中，注意到宿主RPE對ZO-1染色(虛線箭頭)，而它`在附圖14N、140中是GFP陰性的(相應的區域是暗色的)，與ZO-1陽性hESC衍生的細胞相反(附圖14M中的完整箭頭)其確實共表達GFP (附圖14N，140)。
[0052]附圖15A-15C:移植的hESC衍生的、激活蛋白A處理的RPE細胞提供了 RCS大鼠視網膜退化模型中的功能拯救。與同類的非移植的對照眼相比，以及與單獨進行培養基的視網膜下注射的眼睛相比，在8周齡記錄的全視野ERG反應在來自hESC的、激活蛋白處理的RPE細胞的移植之后的RCS大鼠眼睛中是更高的。在移植的眼(附圖15A)和它同類的對照眼(附圖15B)中顯示了在暗適應狀態下對一系列提高強度的白色閃光的代表性的ERG反應。附圖15C顯示了在移植的眼和不同組的對照眼之間平均幅度方面的顯著的區別(
【權利要求】
1.一種促進人類多能干細胞定向分化為視網膜色素上皮(RPE)結局的方法，所述方法包括:a.在補充了煙酰胺(NA)的培養基中培養人類多能干細胞，以產生分化中的細胞；和然后b.在誘導所述分化中的細胞分化為RPE細胞的條件下在補充了激活蛋白A的培養基中培養所述分化中的細胞。
2.權利要求1的方法，其中所述多能干細胞包括商業上可獲得的胚胎干細胞。
3.權利要求1的方法，其中在補充了煙酰胺的所述培養基中的所述培養進行至少2天， 然后在補充了激活蛋白A的所述培養基中進行培養。
4.權利要求1的方法，其中所述培養以懸浮培養進行。
5.權利要求1的方法，其中在補充了煙酰胺的所述培養基中培養所述分化中的細胞大約2周。
6.權利要求1的方法，其中補充了激活蛋白A的所述培養基進一步補充煙酰胺。
7.權利要求1的方法，其中所述煙酰胺的濃度是大約10mM。
8.權利要求1的 方法，其中所述激活蛋白A的濃度是20-180ng/ml。
【文檔編號】C12N5/071GK103555654SQ201310484803
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2008年4月27日 優先權日:2007年4月18日
【發明者】M·伊德爾森, R·阿爾珀-皮努斯, A·奧博倫斯基, E·巴寧, B·魯比諾夫 申請人:哈達錫特醫學研究服務及發展有限公司