一種固定化細胞生產高功能性三糖含量的低聚異麥芽糖的方法
【專利摘要】本發明涉及一種固定化細胞生產高功能性三糖含量的低聚異麥芽糖的方法。該方法以淀粉為原料，經液化、糖化制得麥芽糖漿，并采用固定化黑曲霉細胞技術與模擬移動床色譜分離技術聯產制備高功能性三糖含量低聚異麥芽糖。本方法中糖化液經過固定化細胞轉苷后異麥芽糖（IG2）、潘糖（P）和異麥芽三糖（IG3）三種功能性組分總量達到60%以上，固定化細胞底物轉化率高于固定化酶，所得產品的指標遠遠高于國內外同類產品，經色譜分離后三種功能性組分可達90%以上，同時大大縮短反應時間，操作便利，適合大規模連續化生產。
【專利說明】一種固定化細胞生產高功能性三糖含量的低聚異麥芽糖的方法
【技術領域】[0001]本發明涉及一種固定化細胞生產高功能性三糖含量的低聚異麥芽糖的方法，特別涉及一種利用固定化細胞與模擬移動床色譜分離技術聯產制備高功能性三糖含量低聚異麥芽糖的方法，屬于淀粉糖生產【技術領域】。
【背景技術】
[0002]低聚異麥芽糖是功能性低聚糖中產量最大、應用最廣泛的一種糖，在人體大腸中不能被有害菌利用，但能有效促進雙歧桿菌的增殖，從而促進胃腸道蠕動，改善胃腸道微生態環境，提高機體免疫力，分解腸內毒素與致癌物質，同時低聚異麥芽糖還具有防齲齒的功能，可降低人體內膽固醇和血脂水平。
[0003]目前，低聚異麥芽糖是以淀粉為原料采用多種酶聯合作用經過液化、糖化、轉苷等操作，以生產盡可能多的異麥芽糖(IG2)、潘糖(P)和異麥芽三糖(IG3)等功能性成分。市場上低聚異麥芽糖產品主要有兩種規格，分別是MO - 50型(IG2+P+IG3+Gn≥50%，IG2+P+IG3 ≥ 35%)和 IMO -90 型(IG2+P+IG3+Gn ≥ 90%, IG2+P+IG3 ≥ 45%)，其中 IG2、P、IG3 是體現低聚異麥芽糖功能性的主要成分，其含量高低反映了產品質量的好壞，也影響產品的應用和價格前景。
[0004]采用傳統工業化生產工藝生產的產品存在諸多問題，產品中功能性三糖的含量不高，糖化轉苷后三糖含量維持在35 - 40%之間，即使經過發酵純化也難以突破50%，同時，轉葡萄糖苷酶采用進口產品，成本過高，并且糖化、發酵時間過長，料液透射比降低，產生異味，難以實現連續化生產。
[0005]固定化細胞技術起源于20世紀70年代，是在固定化酶的基礎上發展起來的新技術，固定化細胞能在固定后繼續進行正常的生長、繁殖和新陳代謝，并且代替游離細胞以及固定化酶來生產所需產品，正越來越受到更多關注。固定化細胞技術與固定化酶法相比可以省去酶的分離純化工作，減少酶活性損失，同時固定在細胞環境中的酶比純化后的酶更為穩定。
[0006]目前固定化技術生產低聚異麥芽糖集中于固定化酶領域，而固定化細胞及與模擬移動床色譜分離技術聯產低聚異麥芽糖尚未見研究報道。
【發明內容】
[0007]本發明針對現有技術的不足，提供一種固定化細胞生產高功能性三糖含量的低聚異麥芽糖的方法。
[0008]術語說明
[0009]IG2+P+IG3:異麥芽糖、潘糖和異麥芽三糖占干物質的質量百分比。
[0010]DE值:還原糖(以葡萄糖計)占糖漿干物質的質量百分比。
[0011]本發明的技術方案如下:[0012]一種固定化細胞生產高功能性三糖含量的低聚異麥芽糖的方法，包括如下步驟:
[0013](I)將產α -轉葡萄糖苷酶菌株采用海藻酸鈉-氯化鈣-殼聚糖法固定化，制備固定化細胞，然后按柱體積的20~80%向柱體內裝入固定化細胞，制得固定化細胞柱；
[0014]所述步驟(1)中的α -轉葡萄糖苷酶菌株為黑曲霉(Aspergillus niger) BLB -28囷株；
[0015](2)將淀粉質原料經過液化、糖化得到麥芽糖質量百分含量40~90%、固形物質量百分含量30~55%的麥芽糖漿；
[0016](3)調節步驟(2)制得的麥芽糖漿pH為3.5~6.0,通入步驟(1)制得的固定化細胞柱，固定化細胞柱中麥芽糖漿:固定化細胞體積比為(3~10): 1，麥芽糖漿通入速度為
0.5~12倍固定化細胞(裝柱)體積/h，持續循環反應20~60h，收集獲得IG2+P+IG3不小于60%的低聚異麥芽糖粗液；
[0017](4)將步驟 (3)制得的低聚異麥芽糖粗液經純化、干燥，制得低聚異麥芽糖。
[0018]所述步驟(1)中的α -轉葡萄糖苷酶菌株為黑曲霉(Aspergillus niger) BLB -28菌株，保藏號為CGMCC N0.5143，購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。經研究發現，該菌株與其他菌株相比是高轉葡萄糖苷酶表達量的菌株，同時所產轉葡萄糖苷酶為胞外酶，在菌株被固定后底物無需通過細胞膜在胞外即可實現高效轉化。
[0019]根據本發明優選的，所述步驟(1)中的海藻酸鈉-氯化鈣-殼聚糖法固定化的具體步驟為:
[0020]取α -轉葡萄糖苷酶菌株的種子液，濾除質量百分比為10%~40%的水分，制得除水種子液，然后加入質量百分比濃度為3%的海藻酸鈉溶液，除水種子液:海藻酸鈉溶液的質量比為1: (I~5)，攪拌均勻，然后向質量濃度為3%的氯化鈣溶液中勻速滴加，固定4~12h后，取出固定化的膠珠顆粒，清洗后，浸入pH5~7的氯化鈣和殼聚糖的混合液中，氯化鈣質量百分比濃度為0.5~3%，殼聚糖質量百分比濃度為0.1~2%，繼續浸泡6 -12h，清洗后，即得。
[0021]根據本發明優選的，所述步驟(2)中的淀粉質原料為玉米淀粉、木薯淀粉、小麥淀粉、碎米淀粉。
[0022]根據本發明優選的，所述步驟(2)中的液化為二次噴射液化。進一步優選的，淀粉乳質量濃度為20~40%，pH值5.5~6.5，高溫α -淀粉酶的添加量為0.2~0.8L/噸淀粉，一次噴射液化溫度108°C，二次噴射液化溫度125°C，液化液DE值為10~22%。
[0023]根據本發明優選的，所述步驟(2)中的糖化，糖化酶為質量占40~60%的真菌淀粉酶、質量占20~40%的β -淀粉酶和質量占5~20%的普魯蘭酶混合后的復合糖化酶，復合糖化酶添加量為每噸淀粉0.15~0.5L，反應溫度58~60°C，反應時間12~24h。
[0024]根據本發明優選的，所述步驟(4)中的純化，步驟如下:
[0025]將步驟(3)制得的低聚異麥芽糖粗液濃縮至固形物質量百分比含量為55~65%，在壓力0.2~0.4MPa、溫度55~75°C、水耗比1: (1.5~2)、每小時進料量1.5~2.5m3的條件下，經色譜分離，制得IG2+P+IG3含量90%以上的低聚異麥芽糖漿和葡萄糖含量75%以上的葡萄糖漿。
[0026]根據本發明優選的，所述步驟(4)中的干燥為經過真空蒸發干燥濃縮至固形物質量百分含量50~60%的液體產品，或經真空蒸發干燥制得的液體產品繼續經真空干燥或噴霧干燥至固態產品。
[0027]有益效果
[0028]1、本發明采用固定化黑曲霉細胞技術生產低聚異麥芽糖，將環境因素對酶活的影響降到最低，為α -轉葡萄糖苷酶提供穩定高效的產酶環境，底物轉化效率高，無需進行其他純化處理，轉苷后料液功能性三糖含量> 60%，遠遠高于傳統工藝，對三糖含量無特殊要求的產品可無需色譜分離，直接濃縮出料；
[0029]2、采用海藻酸鈉-氯化鈣-殼聚糖固定化方法，操作步驟簡便，同時固定化細胞機械強度高，固定化細胞可重復使用40批無破碎，重復使用60批以上輕微破碎，有利于工業化生產實施；
[0030]3、料液無需活性炭脫色，不需離子交換柱脫鹽，一次濃縮后進入色譜分離，使整個工藝簡化，操作便利；
[0031]4、低聚異麥芽糖粗液進入連續模擬移動床進行色譜分離，耗水減少，每小時進料量增加，分離效率加快，縮短工藝時間，分離出殘留的葡萄糖，既提高低聚異麥芽糖的產品純度，同時回收葡萄糖，藕聯生產高果糖漿，提高原材料利用率。
【具體實施方式】:
[0032]下面結合實施例對本發明的技術方案做進一步闡述，但本發明所保護范圍不限于此。
[0033]生物材料來源
[0034]黑曲霉(Aspergillusniger) BLB -28 菌株,該菌株保藏號為 CGMCC No5143，購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
[0035]真菌淀粉酶購自諾維信公司，該產品為液態，酶活2500FAU/g ；
[0036]β -淀粉酶購自諾科生化工程有限公司，該產品為液態，酶活3000MANU/g ；
[0037]普魯蘭酶購自杰能科公司，該產品為液態，酶活1000ASPU/g。
[0038]設備說明
[0039]色譜分離系統為購自法國諾華賽公司Applexion型號的色譜分離裝置。
[0040]實施例1
[0041]一種固定化細胞生產高功能性三糖含量的低聚異麥芽糖的方法，步驟如下:
[0042](I)將含有黑曲霉(Aspergillus niger) BLB - 28菌株的種子液,濾除質量百分比為10%的水分，然后與質量濃度為3%的海藻酸鈉以1:1的體積比混合均勻，再均勻滴入質量濃度為3%的氯化鈣溶液中固定4h，取出固定化的膠珠顆粒，清水洗凈，浸入pH5 -7、含質量濃度為0.5%氯化鈣和質量濃度為0.1%殼聚糖的混合溶液，再浸泡6h，然后按柱體積的20%向柱體內裝入固定化細胞，制得固定化細胞柱；
[0043](2)采用玉米淀粉調漿，調漿濃度為20% (質量濃度)，并調節pH為5.5，加入高溫α -淀粉酶，添加量為每噸淀粉添加0.2L，然后送入液化噴射器，一次噴射溫度108°C，二次噴射液化溫度125°C，出料DE值為11.2%，制得液化液；
[0044]向液化液中加入復合糖化酶(其中真菌淀粉酶的質量占40%、β -淀粉酶的質量占40%、普魯蘭酶的質量占20%)，添加量為每噸淀粉加入復合糖化酶0.4L，在58~60°C下，保溫反應12h，制得麥芽糖質量百分含量40.7%、固形物質量百分含量22%的麥芽糖漿；[0045](3)調節步驟(2)制得的麥芽糖漿pH為3.5，通過蠕動泵將麥芽糖漿送入步驟(1)制得的固定化細胞柱中，控制固定化細胞柱中麥芽糖漿與固定化細胞的體積比為3:1，調節蠕動泵流速為0.5倍裝柱體積/h，持續循環反應20h，收集出料料液即為低聚異麥芽糖粗液;經測定，IG2+P+IG3含量為60.35%，詳見表1 ；
[0046](4)將步驟(3)制得的低聚異麥芽糖粗液濃縮至固形物質量百分比含量為55%，進入色譜分離系統，色譜運行壓力0.2MPa，溫度55°C，水耗比1:1.5，每小時進料1.5m3，得到的低聚異麥芽糖漿經過高效液相檢測，IG2+P+IG3含量為90.7%，葡萄糖質量百分比含量為
0.33%，詳見表1 ;通過真空蒸發器濃縮至固形物質量百分比含量50%，制得IG2+P+IG3含量>90%的低聚異麥芽糖。同時經色譜分離系統后獲得葡萄糖質量百分比含量為75.2%的葡萄糖漿。
[0047]實施例2
[0048]一種固定化細胞生產高功能性三糖含量的低聚異麥芽糖的方法，步驟如下:
[0049](I)將含有黑曲霉(Aspergillus niger) BLB - 28菌株的種子液,濾除質量百分比為40%的水分，然后與質量濃度為3%的海藻酸鈉以1:5的體積比混合均勻，再均勻滴入質量濃度為3%的氯化鈣溶液中固定12h，取出固定化的膠珠顆粒，清水洗凈，浸入pH5 -7、含質量濃度為3%氯化鈣和質量濃度為2%殼聚糖的混合溶液，再浸泡12h，然后按柱體積的80%向柱體內裝入固定化細胞，制得固定化細胞柱；
[0050](2)采用玉米淀粉調漿，調漿濃度為40% (質量濃度)，并調節pH為6.5，加入高溫α -淀粉酶，添加量為每噸淀粉添加0.8L，然后送入液化噴射器，一次噴射溫度108°C，二次噴射液化溫度125°C，出料DE值為21.5%，制得液化液；
[0051]向液化液中加入復合糖化酶(其中真菌淀粉酶的質量占60%、β -淀粉酶的質量占30%、普魯蘭酶的質量占10%)，添加量為每噸淀粉加入復合糖化酶1.0L，在58~60°C下，保溫反應24h，制得麥芽糖質量百分含量87.3%、固形物質量百分含量51%的麥芽糖漿；
[0052](3 )調節步驟(2 )制得的麥芽糖漿pH為6.0，通過蠕動泵將麥芽糖漿送入步驟(1)制得的固定化細胞柱中，控制固定化細胞柱中麥芽糖漿與固定化細胞的體積比為10:1，調節蠕動泵流速為12倍裝柱體積/h，持續循環反應60h，收集出料料液即為低聚異麥芽糖粗液；經測定，IG2+P+IG3含量為65.12%，詳見表1 ；
[0053](4)將步驟(3)制得的低聚異麥芽糖粗液濃縮至固形物質量百分比含量為65%，進入色譜分離系統，色譜運行壓力0.4MPa，溫度75°C，水耗比1:2，每小時進料2.5m3，得到的低聚異麥芽糖漿經過高效液相檢測，IG2+P+IG3含量為91.9%，葡萄糖質量百分比含量為
0.42% ;通過真空蒸發器濃縮至固形物質量百分比含量60%，制得IG2+P+IG3含量> 90%的低聚異麥芽糖。同時經色譜分離系統后獲得葡萄糖質量百分比含量78.31%的葡萄糖漿。
[0054]實施例3
[0055]一種固定化細胞生產高功能性三糖含量的低聚異麥芽糖的方法，步驟如下:
[0056](1)將含有黑曲霉(Aspergillus niger) BLB - 28菌株的種子液,濾除質量百分比為20%的水分，然后與質量濃度為3%的海藻酸鈉以1:2的體積比混合均勻，再均勻滴入質量濃度為3%的氯化鈣溶液中固定6h，取出固定化的膠珠顆粒，清水洗凈，浸入pH5 -7、含質量濃度為2%氯化鈣和質量濃度為1%殼聚糖的混合溶液，再浸泡12h，然后按柱體積的70%向柱體內裝入固定化細胞，制得固定化細胞柱；[0057](2)采用玉米淀粉調漿，調漿濃度為32% (質量濃度)，并調節pH為6.3，加入高溫α -淀粉酶，添加量為每噸淀粉添加0.3L，然后送入液化噴射器，一次噴射溫度108°C，二次噴射液化溫度125°C，出料DE值為18.8%，制得液化液；
[0058] 向液化液中加入復合糖化酶(其中真菌淀粉酶的質量占60%、β -淀粉酶的質量占25%、普魯蘭酶的質量占15%)，添加量為每噸淀粉加入復合糖化酶0.6L，在58~60°C下，保溫反應20h，制得麥芽糖質量百分含量55.7%、固形物質量百分含量35%的麥芽糖漿；
[0059](3 )調節步驟(2 )制得的麥芽糖漿pH為4.5，通過蠕動泵將麥芽糖漿送入步驟(1)制得的固定化細胞柱中，控制固定化細胞柱中麥芽糖漿與固定化細胞的體積比為8:1，調節蠕動泵流速為9倍裝柱體積/h，持續循環反應55h，收集出料料液即為低聚異麥芽糖粗液；經測定，IG2+P+IG3含量為64.77%，詳見表1 ；
[0060](4)將步驟(3)制得的低聚異麥芽糖粗液濃縮至固形物質量百分比含量為58%，進入色譜分離系統，色譜運行壓力0.3MPa，溫度65°C，水耗比1:2，每小時進料2.5m3，得到的低聚異麥芽糖漿經過高效液相檢測，IG2+P+IG3含量為91.7%，葡萄糖質量百分比含量為
0.32% ;通過真空蒸發器濃縮至固形物質量百分比含量55%，制得IG2+P+IG3含量> 90%的低聚異麥芽糖。同時經色譜分離系統后獲得葡萄糖質量百分比含量77.37%的葡萄糖漿。
[0061]對比例I
[0062]一種低聚異麥芽糖的制備方法，步驟如下:
[0063](I)玉米淀粉調漿，調漿濃度為32% (質量濃度)，并調節pH為6.3，加入高溫α -淀粉酶，添加量為0.3L/噸淀粉，將淀粉乳送入液化噴射器，一次噴射溫度108°C，二次噴射液化溫度125°C，出料DE值為18.8%，制得液化液；
[0064](2)向液化液中加入復合糖化酶(其中真菌淀粉酶的質量占60%、β -淀粉酶的質量占25%、普魯蘭酶的質量占15%)，添加量為每噸淀粉加入復合糖化酶0.6L，在58~60°C下，保溫反應20h，制得麥芽糖質量百分含量55.7%、固形物質量百分含量35%的麥芽糖漿；
[0065](3)調節上述麥芽糖漿pH為4.5，加入現有市售α -轉葡萄糖苷酶，每噸淀粉加入
1.0La -轉葡萄糖苷酶，在58~60°C下，保溫48h后，取樣滅酶活，經測定，IG2+P+IG3含量為 35.78% ；
[0066]對比例2
[0067]一種低聚異麥芽糖的制備方法，步驟如下:
[0068](I)玉米淀粉調漿，調漿濃度為32% (質量濃度)，并調節pH為6.3，加入高溫a -淀粉酶，添加量為0.3L/噸淀粉，將淀粉乳送入液化噴射器，一次噴射溫度108°C，二次噴射液化溫度125°C，出料DE值為18.8%，制得液化液；
[0069](2)向液化液中加入復合糖化酶(其中真菌淀粉酶的質量占60%、β -淀粉酶的質量占25%、普魯蘭酶的質量占15%)，添加量為每噸淀粉加入復合糖化酶0.6L，在58~60°C下，保溫反應20h，制得麥芽糖質量百分含量55.7%、固形物質量百分含量35%的麥芽糖漿；
[0070](3)調節麥芽糖漿pH為4.5，通過蠕動泵將麥芽糖漿送入固定化a -轉葡萄糖苷酶柱中，固定化酶裝柱體積為整個柱體積的70% ； α -轉葡萄糖苷酶的固定化方法采用現有固定化技術，具體步驟可參見中國專利文獻CN102296032A (申請號201110254748.0)中說明書實施例5的方法。
[0071](4)調節蠕動泵流速為9倍裝柱體積/h，該過程持續55h，收集出料料液，經測定，IG2+P+IG3 含量為 44.32%o
[0072]對比例3
[0073]—種BLB - 28種子液制備低聚異麥芽糖的方法，步驟如下:
[0074](I)玉米淀粉調漿，調漿濃度為32% (質量濃度)，并調節pH為6.3，加入高溫α -淀粉酶，添加量為0.3L/噸淀粉，將淀粉乳送入液化噴射器，一次噴射溫度108°C，二次噴射液化溫度125°C，出料DE值為18.8%，制得液化液；
[0075](2)向液化液中加入復合糖化酶(其中真菌淀粉酶的質量占60%、β -淀粉酶的質量占25%、普魯蘭酶的質量占15%)，添加量為每噸淀粉加入復合糖化酶0.6L，在58~60°C下，保溫反應20h，制得麥芽糖質量百分含量55.7%、固形物質量百分含量35%的麥芽糖漿；
[0076](3)調節麥芽糖漿pH為4.5，并向其中加入黑曲霉BLB -28種子液，控制麥芽糖漿與種子液體積比為3:1，保溫48h后，取樣滅菌，經測定，其組分:IG2+P+IG3的質量百分比含量為48.1% ；
[0077]表1低聚異麥芽糖(ΙΜ0)組分分析表
[0078]
【權利要求】
1.一種固定化細胞生產高功能性三糖含量的低聚異麥芽糖的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)將產α-轉葡萄糖苷酶菌株采用海藻酸鈉-氯化鈣-殼聚糖法固定化，制備固定化細胞，然后按柱體積的20~80%向柱體內裝入固定化細胞，制得固定化細胞柱； 所述步驟(1)中的α -轉葡萄糖苷酶菌株為黑曲霉(Aspergillus niger) BLB-28菌株; (2)將淀粉質原料經過液化、糖化得到麥芽糖質量百分含量40~90%、固形物質量百分含量30~55%的麥芽糖漿； (3 )調節步驟(2 )制得的麥芽糖漿pH為3.5~6.0，通入步驟(1)制得的固定化細胞柱，固定化細胞柱中麥芽糖漿:固定化細胞體積比為(3~10):1，麥芽糖漿通入速度為0.5~12倍固定化細胞體積/h，持續循環反應20~60h，收集獲得IG2+P+IG3不小于60%的低聚異麥芽糖粗液； (4)將步驟(3)制得的低聚異麥芽糖粗液經純化、干燥，制得低聚異麥芽糖。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中的海藻酸鈉-氯化鈣-殼聚糖法固定化的具體步驟為: 取α-轉葡萄糖苷酶菌株的種子液，濾除質量百分比為10%~40%的水分，制得除水種子液，然后加入質量百分比濃度為3%的海藻酸鈉溶液，除水種子液:海藻酸鈉溶液的質量比為1: (I~5)，攪拌均勻，然后向質量濃度為3%的氯化鈣溶液中勻速滴加，固定4~12h后，取出固定化的膠珠顆粒，清洗后，浸入PH5~7的氯化鈣和殼聚糖的混合液中，氯化鈣質量百分比濃度為0.5~3%，殼聚糖質量百分比濃度為0.1~2%，繼續浸泡6~12h，清洗后，即得。`
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中的淀粉質原料為玉米淀粉、木薯淀粉、小麥淀粉、碎米淀粉。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中的液化為二次噴射液化。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，淀粉乳質量濃度為20~40%，pH值5.5~6.5，高溫α -淀粉酶的添加量為0.2~0.8L/噸淀粉，一次噴射液化溫度108°C，二次噴射液化溫度125°C，液化液DE值為10~22%。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中的糖化，糖化酶為質量占40~60%的真菌淀粉酶、質量占20~40%的β -淀粉酶和質量占5~20%的普魯蘭酶混合后的復合糖化酶，復合糖化酶添加量為每噸淀粉0.15~0.5L，反應溫度58~60°C，反應時間12~24h。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中的純化，步驟如下: 將步驟(3)制得的低聚異麥芽糖粗液濃縮至固形物質量百分比含量為55~65%，在壓力0.2~0.4MPa、溫度55~75°C、水耗比1:(1.5~2)、每小時進料量1.5~2.5m3的條件下，經色譜分離，制得IG2+P+IG含量90%以上的低聚異麥芽糖漿和葡萄糖含量75%以上的葡萄糖漿。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中的干燥為經過真空蒸發干燥濃縮至固形物質量百分含量50~60%的液體產品，或經真空蒸發干燥制得的液體產品繼續經真空干燥或噴霧干燥至固態產品。
【文檔編號】C12R1/685GK103484512SQ201310480110
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年10月14日 優先權日:2013年10月14日
【發明者】劉宗利, 王乃強, 賈慧慧, 薛雅鶯, 李方華 申請人:保齡寶生物股份有限公司