一種敲除染色體的方法
【專利摘要】一種敲除染色體的方法，屬于生物【技術領域】。染色體的主要功能是真核生物的遺傳載體。但不同染色體具有不同的核苷酸序列，它在細胞、組織、器官等發育、分化以及生物進化中等也會存在顯著差異，利用染色體缺失的生物材料，可以更好地研究它們的各自作用。將胞嘧啶脫氨酶基因(CD)插入到細胞的特定染色體上，通過單倍體培養和正向選擇獲得轉CD的單倍體；振蕩培養含CD的單倍體制備細胞懸浮系；在添加5-氟胞嘧啶的培養基中振蕩培養含CD的懸浮細胞；經過0.1-100小時培養后，在覆蓋于旺盛愈傷組織的濾紙上接種稀釋的懸浮細胞，進行10-600小時的看護培養；挑選出單細胞團，經鑒定后獲得CD插入染色體的缺失細胞。
【專利說明】一種敲除染色體的方法
【技術領域】
[0001]一種敲除染色體的方法，屬于生物【技術領域】。可以廣泛應用于生命科學的基礎研究；獲得的染色體缺失材料可在農林、食品和環境等領域具有廣泛的應用前景。
【背景技術】
[0002]染色體的主要功能是真核生物的遺傳載體。但不同染色體具有不同的核苷酸序列，它在細胞、組織、器官等發育、分化以及生物進化中等也會存在顯著差異，利用染色體缺失的生物材料，可以更好地研究它們的各自作用；獲得的染色體缺失材料也具有廣泛的應用前景。
【發明內容】
[0003]將胞嘧啶脫氨酶基因(⑶)插入到細胞的特定染色體上，通過單倍體培養和抗生素等試劑的正向選擇獲得轉CD的單倍體。
[0004]振蕩培養含⑶的單倍體制備細胞懸浮系，接著在含0.0001-10%的5-氟胞嘧啶培養基中振蕩培養含CD的懸浮細胞，進行負向選擇，培養時間為0.1-100小時。
[0005]在覆蓋于旺盛愈傷組織的濾紙上接種經過負向選擇且已稀釋的懸浮細胞，進行10-600小時的看護培養，然后挑選出單細胞團，經鑒定后獲得CD插入染色體的缺失細胞。
【具體實施方式】
[0006]1.獲得轉胞嘧啶脫氨酶基因(⑶)甘草基因
[0007]I)⑶基因的植物表達載體構建
[0008]將來自大腸桿菌的⑶基因插入到PC0MB1A1304的GFP基因的上游；電導入農桿菌LB4404 ;挑單菌斑培養、鑒定。
[0009]2)農桿菌介導轉⑶基因
[0010]挑經過鑒定的單菌斑，振蕩培養20小時；然后，用新鮮培養基將其稀釋到OD62tl為
0.6-0.9的懸浮液；挑選飽滿甘草種子依次經過70%酒精、無菌水、10%次氯酸鈉和無菌水消毒清洗后接種在MS固體培養基上；12 / 12小時光照培養一周，獲得無菌苗；剪取幼葉、莖尖等外植體接種在含lmg/L2，4-D的固體MS培養基上誘導愈傷組織發生，2-4天后與培養稀釋后的農桿菌溫育1-50分鐘；取出外植體用無菌水反復清洗后再接種到含50mg / L潮霉素的愈傷組織誘導培養基中；培養7-20天。獲得的愈傷組織一部分用于再生芽分化、根誘導形成再生植株；一部分進行繼代培養獲得松散型愈傷組織，以制備懸浮培養細胞系。
[0011]3)轉⑶基因的植株鑒定
[0012]A.⑶S瞬間表達鑒定
[0013]取出部分愈傷組織、幼芽和根尖進行6US化學染色鑒定；出現藍色的陽性材料進行記錄，其對應的剩余材料進入下面的實驗。
[0014]B.CD基因的PCR鑒定[0015]取部分⑶S鑒定陽性的材料，按CTAB法提取基因組DNA ;利用⑶特異性引物進行PCR ；PCR陽性的剩余材料進入下一輪試驗。
[0016]C.⑶基因插入I號染色體的植株選擇 [0017]取PCR陽性植株的根尖制作有絲分裂的細胞裝片；在顯微鏡下尋找含分裂中期細胞的裝片；在熒光顯微鏡下，尋找I號染色體含綠色熒光的裝片；驗證并確定I號染色體插入GFP和⑶的生物材料。
[0018]2.通過單倍體培養和抗生素等試劑的正向選擇獲得轉⑶的單倍體。
[0019]I)花藥培養單倍體細胞團及其鑒定
[0020]取I號染色體插入CD基因的生物材料栽培；開花后取花粉培養分別在含5-氟胞嘧啶和不含5-氟胞嘧啶的培養基上培養；獲得的愈傷組織分別用于下面兩個實驗。
[0021]2)花藥培養單倍體植株及其鑒定
[0022]愈傷組織加入含激素的誘導幼芽的培養基中誘導再生植株及鑒定。
[0023]3.振蕩培養含⑶的單倍體制備細胞懸浮系
[0024]I)制備愈傷組織。
[0025]2)制備懸浮培養細胞系。
[0026]4.負向選擇培養，獲得缺失含CD基因染色體的懸浮細胞
[0027]在含0.0001-10%的5-氟胞嘧啶培養基中振蕩培養含⑶的懸浮細胞，進行負向選擇，培養時間為0.1-100小時。
[0028]5.看護培養選擇單細胞團
[0029]I)稀釋懸浮細胞系。
[0030]2)制備生長旺盛的愈傷組織。
[0031]3)看護培養懸浮細胞。
[0032]在覆蓋于旺盛愈傷組織的濾紙上接種經過負向選擇且已稀釋的懸浮細胞，進行10-600小時的看護培養。
[0033]6.⑶插入染色體的缺失細胞鑒定與獲得
[0034]I)⑶S化學鑒定
[0035]2) PCR 鑒定
[0036]3)細胞學鑒定
[0037]然后挑選出單細胞團，經鑒定后獲得CD插入染色體的缺失細胞。
【權利要求】
1.將胞嘧啶脫氨酶基因(CD)插入到細胞的特定染色體上，通過單倍體培養和抗生素等試劑的正向選擇獲得轉CD的單倍體。
2.振蕩培養含CD的單倍體制備細胞懸浮系，接著在含0.0001-10%的5-氟胞嘧啶培養基中振蕩培養含CD的懸浮細胞，進行負向選擇，培養時間為0.1-100小時。
3.在覆蓋于旺盛愈傷組織的濾紙上接種經過負向選擇且已稀釋的懸浮細胞，進行10-600小時的看 護培養， 然后挑選出單細胞團，經鑒定后獲得CD插入染色體的缺失細胞。
【文檔編號】C12N5/10GK103540609SQ201310476293
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年10月10日 優先權日:2013年10月10日
【發明者】李興林, 李夢麗, 別振宇 申請人:天津科技大學