快速檢測番茄褪綠病毒的引物、試劑盒及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種快速檢測番茄褪綠病毒的引物，該引物包括上游引物和下游引物，上游引物的堿基序列如SEQ?ID?NO.5所示，下游引物的堿基序列如SEQ?ID?NO.6所示。本發明還公開了一種快速檢測番茄褪綠病毒的試劑盒，該試劑盒包括上述的上游引物和下游引物，以及常規PCR檢測的常規試劑。本發明提供的引物、試劑盒可以用于鑒定番茄褪綠病毒，以及檢測待測樣品中是否含有番茄褪綠病毒。采用本發明的特異引物或試劑盒檢測ToCV，操作簡單、快速、結果可靠、特異性強、靈敏度高，非常適合應用在口岸現場檢測，對于早期檢測診斷、田間疫情調查及進出口岸檢測具有重要作用。
【專利說明】快速檢測番茄褪綠病毒的引物、試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程中病毒檢測技術及相關領域，尤其涉及快速檢測番茄褪綠病毒的特異引物對、試劑盒及其應用。
【背景技術】
[0002]番爺褪綠病毒(Tomato Chlorosis Virus, ToCV)為長線形病毒科下的毛型病毒屬成員，主要侵染番茄和辣椒，在農業生產上造成嚴重危害。該病毒于1998年在佛羅里達州首次報道，然后在法國、意大利、巴西、以色列等世界各地相繼發現，可侵染番茄等重要農作物，在番茄上產生的典型癥狀為葉片脈間發病初期變黃，后期葉片發紅，葉脈顏色加深，葉片增厚，極大降低了番茄產量與品質。番茄褪綠病毒可通過多種方式傳播，包括種苗調運、粉虱帶毒等。
[0003]目前，ToCV在中國僅有兩份報道，分別為山東和北京，且在山東多個番茄產區都已檢測到，并造成番茄減產甚至絕產。因此，如何快速、有效、準確地對番茄褪綠病毒進行檢測是亟需解決的問題。
[0004]PCR技術具有特異性強、快速、準確等特點，在病原體檢測、疾病診斷、法醫學鑒定等方面得到了廣泛的應用，并且是分子生物學領域常規的方法和手段。PCR技術為快速、準確地檢測番茄褪綠病毒提供技術支持，對快速檢測番茄褪綠病毒具有重要意義。
【發明內容】
[0005]針對上述現有技術，本發 明提供了一種快速檢測番茄褪綠病毒的引物，以及試劑盒、檢測方法。
[0006]本發明是通過以下技術方案實現的:
[0007]一種快速檢測番茄褪綠病毒的引物，該引物包括上游引物和下游引物，上游引物的喊基序列如SEQ ID N0.5所不，下游引物的喊基序列如SEQ ID N0.6所不。
[0008]一種快速檢測番茄褪綠病毒的試劑盒，該試劑盒包括上述的上游引物和下游引物，以及常規PCR檢測的常規試劑，比如=IOXPCR buffer、dNTP、Taq DNA polymerase、反轉錄常規試劑和電泳常規試劑。
[0009]上述的快速檢測番茄褪綠病毒的引物、快速檢測番茄褪綠病毒的試劑盒可以用于鑒定番茄褪綠病毒，具體應用時，檢測方法如下:以待測病毒的cDNA為模板，用所述的快速檢測番茄褪綠病毒的引物(SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示的上游引物和下游引物)進行PCR擴增，電泳并檢測PCR擴增產物；如果PCR擴增產物中有1074bp的條帶，則待測病毒為候選的番茄褪綠病毒；如果PCR擴增產物中沒有得到1074bp的條帶，則待測病毒為候選的非番茄褪綠病毒。
[0010]上述的快速檢測番茄褪綠病毒的引物、快速檢測番茄褪綠病毒的試劑盒可以用于檢測待測樣品中是否含有番茄褪綠病毒，具體應用時，檢測方法如下:以待測樣品中的待測病毒的CDNA為模板，用所述的快速檢測番茄褪綠病毒的引物(SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示的上游引物和下游引物)進行PCR擴增，電泳并檢測PCR擴增產物；如果PCR擴增產物中有1074bp的條帶，則待測樣品中含有番茄褪綠病毒；如果PCR擴增產物中沒有得到1074bp的條帶，則待測樣品中不含有番茄褪綠病毒。
[0011]所述待測病毒為番茄褪綠病毒。所述待測樣品可為植物樣本。所述植物具體可為被番茄褪綠病毒感染的植物(如番茄)。
[0012]所述PCR 擴增的反應體系由 18 μ LddH20,2.5 μ L 10XPCR buffer、1.0yL10mmol/L dNTP.0.5μ L lOmmol/L SEQ ID N0.5 所示的 DNA、0.5 μ L lOmmol/L SEQ ID N0.6所示的DNA、2.0yL模板和0.5 μ L 5U/μ L Taq DNA polymerase組成；所述PCR的反應條件為:94°C 3min ；94°C 30, 58°C 30s, 72°C 70s，30 個循環；72°C IOmin0 10XPCR buffer 具體購自北京全式金生物技術有限公司。
[0013]本發明提供的檢測引物、試劑盒，具有快速高效、操作簡單、靈敏度高、特異性好的優點，對于早期檢測診斷、田間疫情調查及進出口岸檢測具有很強適用和應用性。
[0014]采用本發明的特異引物或試劑盒檢測ToCV，操作簡單、快速、結果可靠、特異性強、靈敏度高，非常適合應用在口岸現場檢測。本發明的特異引物或試劑盒可用于ToCV 口岸檢測和田間疫情調查，特別適合農業部門的各檢疫檢查站、各口岸檢驗檢疫局、植物病毒研究機構等應用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]圖1為特異性篩選結果，M為Trans 2K Plus DNA Maker, 1-5分別為設計的ToCV的5對特異引物對，6-10依次為5對引物的陰性對照。
[0016]圖2為反應體系中引物對加入量的優化結果，M為Trans 2K PlusDNA Maker, 1-4分別為引物的不同加入量:0.5 μ L、0.8 μ L、l.0 μ L、l.5 μ L，5-8依次為不同引物加入量的陰性對照。
[0017]圖3為退火溫度的優化結果，M為Trans 2K Plus DNA Maker, 1-4分別為不同的退火溫度:48°C，53.6°C，56°C，58°C，5-8依次為不同退火溫度的陰性對照。
[0018]圖4為特異性檢測結果，M為Trans 2K Plus DNA Maker, 1-5為田間ToCV感病樣品，6為黃瓜花葉病毒(CMV)，7為煙草花葉病毒(TMV)，8為馬鈴薯Y病毒(PVY)，9為番茄花葉病毒(ToMV)，10為陰性對照。
[0019]圖5 為靈敏性檢測結果，M為 Trans 2K Plus DNA Maker，1-7 依次為 KT1，10-2，10-3，1θΛ I O—5，I O—6，10_7倍濃度的RNA，8為陰性對照。
【具體實施方式】
[0020]下面結合實施例對本發明作進一步的說明。
[0021]以下的實施例便于更好的理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下屬實施例中所用的實驗材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0022]PCR 儀為 TaKaRa PCR 擴增儀。ReverseTranscription 購自寶生物。EasyTaq 酶、10 X PCRbuffer、dNTPs和DNA Marker均購自北京全式金生物技術有限公司。
[0023]番爺裡綠病毒(TomatoChlorosis Virus, ToCV):RNA 病毒；參考文獻:CompIetesequence of the RNAl of a European isolate of tomato chlorosis virus.Archivesof Virology(2007)152:839-841.[0024]實施例1特異引物對的設計
[0025]根據NCBI上的番茄褪綠病毒的核酸序列設計了五對引物，引物序列如下:
[0026]第一對引物:
【權利要求】
1.一種快速檢測番茄褪綠病毒的引物，其特征在于:該引物包括上游引物和下游引物，上游引物的堿基序列如SEQ ID N0.5所示，下游引物的堿基序列如SEQ ID N0.6所示。
2.一種快速檢測番茄褪綠病毒的試劑盒，其特征在于:該試劑盒包括SEQ ID N0.5所示的上游引物和SEQ ID N0.6所示的下游引物，以及PCR檢測的常規試劑。
3.根據權利要求2所述的快速檢測番茄褪綠病毒的試劑盒，其特征在于:所述PCR檢測的常規試劑包括:10XPCR buffer、dNTP、Taq DNA polymerase、反轉錄常規試劑和電泳常規試劑。
4.權利要求1所述的快速檢測番茄褪綠病毒的引物、權利要求2所述的快速檢測番茄褪綠病毒的試劑盒在鑒定番茄褪綠病毒中的應用。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于:具體應用時，檢測方法如下:以待測病毒的cDNA為模板，用SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示的上游引物和下游引物進行PCR擴增，電泳并檢測PCR擴增產物；如果PCR擴增產物中有1074bp的條帶，則待測病毒為候選的番茄褪綠病毒；如果PCR擴增產物中沒有得到1074bp的條帶，則待測病毒為候選的非番茄褪綠病毒。
6.權利要求1所述的快速檢測番茄褪綠病毒的引物、權利要求2所述的快速檢測番茄褪綠病毒的試劑盒在檢測待測樣品中是否含有番茄褪綠病毒中的應用。
7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于:具體應用時，檢測方法如下:以待測樣品中的待測病毒的cDNA為模板，用SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示的上游引物和下游引物進行PCR擴增，電泳并檢測PCR擴增產物；如果PCR擴增產物中有1074bp的條帶，則待測樣品中含有番茄褪綠病毒；如果PCR擴增產物中沒有得到1074bp的條帶，則待測樣品中不含有番爺褪綠病毒。
8.根據權利要求5或7所述的應用，其特征在于:所述PCR擴增的反應體系由18μ LddH20、2.5μ L 10XPCR bufferU.0μ L IOmmoI/L dNTP,0.5μ L IOmmoI/L SEQ IDN0.5 所示的 DNA、0.5 μ L I Ommo I/LSEQ ID N0.6 所示的 DNA、2.0yL 模板和 0.5 μ L 5U/μ LTaq DNA polymerase 組成。
9.根據權利要求5或7所述的應用，其特征在于:所述PCR擴增的反應條件為:940C 3min ；94°C 30, 58°C 30s, 72°C 70s, 30 個循環；72°C IOmin0
【文檔編號】C12Q1/68GK103498010SQ201310474211
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年10月11日 優先權日:2013年10月11日
【發明者】竺曉平, 趙黎明, 李剛 申請人:山東農業大學