檢測主要亞型禽白血病病毒的lamp試劑盒的制作方法

檢測主要亞型禽白血病病毒的lamp試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測主要亞型禽白血病病毒的LAMP試劑盒，采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)，并根據(jù)根據(jù)禽白血病病毒POL基因序列設(shè)計(jì)了兩對特異性引物（內(nèi)引物FIP和BIP、外引物F3和B3）。應(yīng)用本發(fā)明及其建立的檢測方法，利用ＬＡＭＰ實(shí)時(shí)濁度儀對ＡＬＶＬＡＭＰ反應(yīng)引物、反應(yīng)體系及反應(yīng)進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)、定量、全程密閉監(jiān)控分析，實(shí)現(xiàn)了高效、特異性擴(kuò)增ＡＬＶ的ＬＡＭＰ引物。本發(fā)明具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、迅速得出結(jié)果、不造成污染、可實(shí)時(shí)檢測產(chǎn)物等優(yōu)點(diǎn)，只需按建立的體系加樣即可實(shí)時(shí)檢測出禽白血病病毒，快速準(zhǔn)確的獲得檢測結(jié)果，為簡便、快速地檢測禽白血病病毒帶來便利。
【專利說明】檢測主要亞型禽白血病病毒的LAMP試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于禽白血病病毒檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種檢測主要亞型禽白血病病毒的LAMP試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]禽白血病病毒(ALV)根據(jù)其宿主范圍、不同亞型的干擾情況及其囊膜中和抗原特性，可將其分為A到JlO個亞型，雞群中常見為A、B、J和E亞型。禽白血病自在中國出現(xiàn)并流行以來，一直受到臨床獸醫(yī)、養(yǎng)殖業(yè)者以及科研人員的高度關(guān)注，在現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)中急需該病的普查及凈化的技術(shù)手段。雖然目前有檢測ALV的多種方法報(bào)道，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(EL I S A)、免疫組化等，檢測核酸的有定量競爭P C R、原位P CR,RT-PC R等，然而傳統(tǒng)PCR檢測需要經(jīng)過變性一退火一延伸，加上DNA提取整個過程大概需要2-4小時(shí)才能得出結(jié)果。這些方法在成本、靈敏度、操作方便性上存有缺陷，一定程度上限制了它們在生產(chǎn)中的實(shí)際應(yīng)用。L A M P作為一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)，較其它分子生物學(xué)檢測方法而言具有試驗(yàn)條件低、靈敏度高和特異性強(qiáng)等優(yōu)勢，在醫(yī)學(xué)微生物的檢測中受到親睞并推廣應(yīng)用。盡管如此，以往技術(shù)中所用的LAMP方法檢測仍需要I小時(shí)后加入染料才能判斷結(jié)果，反應(yīng)中加入的突光染料syber-green,需采用瓊脂糖凝膠電泳紫外線分析顯像,存在開蓋跑電泳觀察造成的氣溶膠污染，缺乏對反應(yīng)的實(shí)時(shí)監(jiān)控很難排除這些干擾因素，不能對檢測結(jié)果做出準(zhǔn)確的判定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種特異性強(qiáng)、敏感性高、簡便快速的檢測主要亞型禽白血病病毒的LAMP試劑盒，以便于基層實(shí)時(shí)、快速、準(zhǔn)確地檢測禽白血病病毒。
·[0004]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:檢測主要亞型禽白血病病毒的LAMP試劑盒，該試劑盒含有以下試劑:2X反應(yīng)緩沖液、引物、Bst DNA聚合酶、熒光目視檢測試劑、禽白血病病毒陽性模板和超純水；引物包括內(nèi)引物FIP和BIP、外引物F3和B3，
[0005]內(nèi)引物FIP 的序列為 CTACATTAGTGGGCGCTGTCGGAACAACTGGAAGCACGCG，
[0006]內(nèi)引物BIP 的序列為 TCAAGATGGGACAGGAGGGAGITTTGGCTTAACGCATCCTCT ；
[0007]外引物F3 的序列為 TGAITTGGGGGCAAGTGTAC ；
[0008]外引物B3 的序列為 ATGACTCCGCACGTGGAG。
[0009]該試劑盒每劑含有2X反應(yīng)緩沖液12.5μ 1、引物FIP和BIP各40pmol、引物F3和B3各5pmol、BSt DNA聚合酶I μ 1、熒光目視檢測試劑0.2 μ I和禽白血病病毒陽性模板
2μ I。
[0010]2Χ反應(yīng)緩沖液來自10pamp脫氧核糖核酸擴(kuò)增試劑盒；熒光目視檢測試劑采用鈣黃綠素突光染料，來自10pamp突光目視檢測試劑盒。
[0011]本發(fā)明采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)，并根據(jù)禽白血病病毒POL基因序列設(shè)計(jì)了兩對特異性引物(內(nèi)引物FIP和BIP、外引物F3和B3)，由此發(fā)明了檢測主要亞型禽白血病病毒(禽白血病病毒ALV的主要亞型A、B、E、J)的LAMP試劑盒。本發(fā)明提供的LAMP試劑盒及其檢測方法，利用LAMP實(shí)時(shí)濁度儀對A L V L AM P反應(yīng)引物、反應(yīng)體系及反應(yīng)進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)、定量、全程密閉監(jiān)控分析，實(shí)現(xiàn)了高效、特異性擴(kuò)增A L V的L A M P引物，建立了可視化的檢測禽白血病的LAMP方法，它只能從禽白血病陽性樣本中進(jìn)行核酸的特異性擴(kuò)增，不與其它常見家禽病原發(fā)生非特異性反應(yīng)。應(yīng)用本發(fā)明只需按建立的體系加樣即可實(shí)時(shí)檢測出禽白血病病毒，快速準(zhǔn)確的獲得檢測結(jié)果，為簡便、快速地檢測禽白血病病毒帶來便利。
[0012]與傳統(tǒng)檢測手段相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn): [0013]〈1>特異性強(qiáng)——所檢測的陰性對照株均無陽性結(jié)果出來，與PCR檢測結(jié)果一致。
[0014]〈2>靈敏度高——普通PCR檢測方法的靈敏度為IO3Copies/μ L數(shù)量級，而本發(fā)明檢測限約為20copies/yL，是普通PCR的100倍左右。
[0015]<3>迅速得出結(jié)果——普通PCR整個過程在2-4小時(shí)左右才能得出結(jié)果，一般LAMP方法也要I小時(shí)，本發(fā)明提供的檢測方法反應(yīng)在25-35min間即出現(xiàn)擴(kuò)增。
[0016]〈4>不造成污染——用于觀察的熒光染料為反應(yīng)前加入，加入的商用染料鈣黃綠素(來自10pamp突光目視檢測試劑盒,非syber-green),且檢測過程無需開蓋。
[0017]〈5>可實(shí)時(shí)檢測產(chǎn)物-利用Tubidimeter real-time LA-320池度儀可實(shí)時(shí)分析
LAMP反應(yīng)的結(jié)果，達(dá)到實(shí)時(shí)監(jiān)測判斷產(chǎn)物的目的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1是本發(fā)明LAMP檢測方法的特異性檢測結(jié)果，圖中:1ALV-A，2ALV-B，3ALV-E,4ALV-J,5MDV,6REV,7AILT。
[0019]圖2是本發(fā)明LAMP檢測方法的敏感性檢測結(jié)果，圖中:12X 10°copies/μ L，22 XIO1Copies/μ L,32 XIO2Copies/μ L,42 XIO3Copies/μ L,52 XIO4Copies/μ L,62 X IO5Copies/ μ L, 72 X IO6Copies/ μ L, 82 X IO7Copies/ μ L。
[0020]圖3是本發(fā)明LAMP檢測方法的熒光可視化檢測結(jié)果，圖中:左管為以禽白血病病毒為模板的反應(yīng)情況，右管為陰性對照。
【具體實(shí)施方式】
[0021]1、材料的準(zhǔn)備
[0022]禽白血病病毒A亞型、B亞型、E亞型、J亞型均為為廣西大學(xué)禽病室保存。LAMP法DNA擴(kuò)增試劑盒(10pamp脫氧核糖核酸擴(kuò)增試劑盒)購自北京藍(lán)譜生物科技有限公司。
[0023]2、LAMP弓丨物的設(shè)計(jì)與合成
[0024]根據(jù)GenBank中禽白血病病毒POL基因序列，利用LAMP法引物輔助設(shè)計(jì)軟件PrimerExplorer V4軟件設(shè)計(jì)得一套LAMP引物，其中F3/B3為外引物，F(xiàn)IP/BIP為內(nèi)引物，具體如下:
[0025]內(nèi)引物FIP 的序列為 CTACATTAGTGGGCGCTGTCGGAACAACTGGAAGCACGCG (見序列表SEQ.1D.N0.1),
[0026]內(nèi)引物BIP 的序列為 TCAAGATGGGACAGGAGGGAGITTTGGCTTAACGCATCCTCT(見序列表SEQ.1D.N0.2)；[0027]外引物F3 的序列為 TGAITTGGGGGCAAGTGTAC (見序列表 SEQ.1D.N0.3)；
[0028]外引物B3 的序列為 ATGACTCCGCACGTGGAG (見序列表 SEQ.1D.N0.4)。
[0029]3、病毒的DNA提取
[0030]取待檢病毒液或研磨好的病料，12000rpm離心2min，吸取上清100 μ L后，按基因組DNA提取試劑盒(購自生工生物工程(上海)股份有限公司，Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒)說明書提取模板DNA。
[0031]4、LAMP反應(yīng)體系建立及具體操作步驟
[0032]參考DNA擴(kuò)增試劑盒說明書，按25 μ I體系配置:
[0033]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測主要亞型禽白血病病毒的LAMP試劑盒，其特征在于該試劑盒含有以下試劑: 2X反應(yīng)緩沖液、引物、Bst DNA聚合酶、熒光目視檢測試劑、禽白血病病毒陽性模板和超純水；所述引物包括內(nèi)引物FIP和BIP、外引物F3和B3， 內(nèi)引物 FIP 的序列為 CTACATTAGTGGGCGCTGTCGGAACAACTGGAAGCACGCG， 內(nèi)引物 BIP 的序列為 TCAAGATGGGACAGGAGGGAGITTTGGCTTAACGCATCCTCT ； 外引物 F3 的序列為 TGAITTGGGGGCAAGTGTAC ； 外引物B3的序列為ATGACTCCGCACGTGGAG。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測主要亞型禽白血病病毒的LAMP試劑盒，其特征在于該試劑盒每劑含有2X反應(yīng)緩沖液12.5μ 1、引物FIP和BIP各40pmol、引物F3和B3各5pmol、Bst DNA聚合酶I μ 1、熒光目視檢測試劑0.2 μ I和禽白血病病毒陽性模板2 μ I。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測主要亞型禽白血病病毒的LAMP試劑盒，其特征在于:所述2X反應(yīng)緩沖液來自10pamp脫氧核糖核酸擴(kuò)增試劑盒；所述熒光目視檢測試劑采用鈣黃綠素突光染料，來自10pamp突光目視檢測試劑盒。
【文檔編號】C12Q1/70GK103627818SQ201310470459
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年10月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月10日
【發(fā)明者】韋平, 彭昊, 韋天超, 磨美蘭, 吳元俊, 秦麗莉, 石夢霞, 畢玉彧, 宋麗麗, 王培坤 申請人:廣西大學(xué)