可分泌抗β2-微球蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種可分泌抗β2-微球蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞，其保藏號為CCTCC?No：C2013130。該雜交瘤細胞的分泌產(chǎn)量高，其分泌得到的抗β2-微球蛋白單克隆抗體具有高親和力、高特異性等優(yōu)點，可廣泛應(yīng)用在β2-微球蛋白檢測領(lǐng)域，如檢測試劑或檢測設(shè)備的制備領(lǐng)域等，在特異性、靈敏度和檢測率等方面較之傳統(tǒng)的檢測方法具有顯著的優(yōu)勢。此外，本發(fā)明還涉及一種該雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體、該雜交瘤細胞及其單克隆抗體的應(yīng)用。
【專利說明】可分泌抗β 2-微球蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及β 2-微球蛋白免疫檢測領(lǐng)域，尤其是涉及一種可分泌抗β2_微球蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞及應(yīng)用 。
【背景技術(shù)】
[0002]β 2微球蛋白以下簡稱β2Μ，是由淋巴細胞、血小板、多形核白細胞產(chǎn)生的一種小分子球蛋白，分子質(zhì)量為11800，由99個氨基酸組成的單鏈多肽，電泳在β 2區(qū)。β 2Μ是細胞表面人類淋巴細胞抗原(HLA)的β鏈(輕鏈)部分(為一條單鏈多肽)，分子內(nèi)含一對二硫鍵，不含糖，與免疫球蛋白穩(wěn)定區(qū)的結(jié)構(gòu)相似。β 2Μ廣泛存在于血漿、尿液、腦脊液、唾液以及初乳中。正常人β2Μ的合成率及從細胞膜上的釋放量相當恒定，且不受年齡、性別、機體肌肉組織多少的影響。β2Μ可以從腎小球自由濾過，99.9%在近端腎小管吸收，并在腎小管上皮細胞中分解破壞，測定血β2Μ比血肌酐能更好地反映腎小球濾過率(GFR)的變化。研究發(fā)現(xiàn)血β2Μ與GFR顯著負相關(guān)，而與血肌酐、尿素氮顯著正相關(guān)，血β2Μ評價腎功能比血肌酐更敏感。血β2Μ測定可更早地發(fā)現(xiàn)腎小球功能受損，各種原發(fā)或繼發(fā)性腎小球病變累及腎小球濾過功能時，均可使血β2Μ增高。正常情況下β2Μ的排出是很微量的，從而血清中β2Μ含量是腎損害診斷的早期指標。
[0003]血清β 2Μ增高，除因腎小球過濾降低外，另一個原因是合成增加，如惡性增生性病變及結(jié)締組織病變，如肺癌、腎癌、乳腺癌以及消化系統(tǒng)惡性腫瘤等，會導致血液中游離的β2Μ水平異常升高。因此，近幾年，β2Μ成為一種重要的腫瘤血清學診斷標志物而被廣泛關(guān)注。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]基于此，有必要提供一種可分泌抗β 2-微球蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞。
[0005]此外，還有必要提供上述雜交瘤細胞或其分泌的單克隆抗體在醫(yī)學檢測領(lǐng)域的應(yīng)用。
[0006]一種可分泌抗β2_微球蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞，保藏號為CCTCC No:C2013130。
[0007]上述可分泌抗β 2-微球蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞在制備診斷腎臟損傷疾病或腫瘤的檢測試劑或檢測設(shè)備領(lǐng)域的應(yīng)用。
[0008]上述可分泌抗β 2-微球蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞在制備β 2-微球蛋白檢測試劑或檢測設(shè)備領(lǐng)域的應(yīng)用。
[0009]一種由上述可分泌抗β 2-微球蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體。
[0010]上述單克隆抗體在制備診斷腎臟損傷疾病或腫瘤的檢測試劑或檢測設(shè)備領(lǐng)域的應(yīng)用。
[0011]上述單克隆抗體在制備β 2-微球蛋白檢測試劑或檢測設(shè)備領(lǐng)域的應(yīng)用。[0012]一種β 2-微球蛋白檢測試劑盒，包括上述單克隆抗體。[0013]在其中一個實施例中，所述β 2-微球蛋白檢測試劑盒包括第一試劑和第二試劑，其中，所述第一試劑包括200-220mol/L Tris緩沖液、5-10mmol/L聚乙二醇、l-5mmol/L疊氮鈉、l_5mmol/L乙二胺四乙酸鈉以及l(fā)_5mmol/L牛血清白蛋白；所述第二試劑包括200-220mmol/L Tris緩沖液、結(jié)合有所述單克隆抗體的膠乳顆粒、l-5mmol/L吐溫-20、0.5_3mmol/L疊氮鈉、l_5mmol/L乙二胺四乙酸鈉以及l(fā)_5mmol/L牛血清白蛋白。
[0014]上述雜交瘤細胞，命名為β2Μ_2Β1，于2013年8月28日保藏在湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學保藏中心(即中國典型培養(yǎng)物保藏中心)，保藏號是CCTCC No:C2013130。
[0015]上述雜交瘤細胞的分泌產(chǎn)量高，其分泌得到的抗β 2-微球蛋白單克隆抗體具有高親和力、高特異性等優(yōu)點，可廣泛應(yīng)用在β 2-微球蛋白檢測領(lǐng)域，如檢測試劑或檢測設(shè)備的制備領(lǐng)域等，在特異性、靈敏度和檢測率等方面較之傳統(tǒng)的檢測方法具有顯著的優(yōu)勢，易于實現(xiàn)高通量、自動化檢測。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]圖1為當檢測原β 2Μ天然抗原，包被濃度為2 μ g/mL時，β 2Μ單抗效價測定結(jié)果圖；
[0017]圖2為臨床定值樣品，實施例2的試劑盒測定值與實際值相關(guān)性圖。
【具體實施方式】
[0018]下面主要結(jié)合附圖及具體實施例對可分泌抗β 2-微球蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞及其應(yīng)用作進一步詳細的說明。
[0019]本實施方式的可分泌抗β 2-微球蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞保藏在湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學保藏中心(CCTCC)，保藏號是CCTCC No:C2013130。該雜交瘤細胞可分泌抗β 2-微球蛋白單克隆抗體。該雜交瘤細胞及其分泌的單克隆抗體可應(yīng)用在制備β 2-微球蛋白檢測試劑或檢測設(shè)備領(lǐng)域中，從而可廣泛應(yīng)用在制備診斷腎臟損傷疾病或腫瘤的檢測試劑或檢測設(shè)備領(lǐng)域中。
[0020]本實施方式還提供了一種β 2-微球蛋白檢測試劑盒，其含有上述雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體，具體是將該單克隆抗體包裹在乳膠顆粒上，使抗原抗體結(jié)合物的體積增大，校準品或待測樣品中的β 2-微球蛋白可與單克隆抗體乳膠顆粒發(fā)生凝聚反應(yīng)，形成抗原抗體復合物而產(chǎn)生濁度，其濁度高低在一定量抗體存在時與樣品中的β 2-微球蛋白成正比。通過測定特定波長的吸光度值，參照校準曲線即可計算出待測樣品中β 2-微球蛋白的含量。具體在本實施方式中，該β 2-微球蛋白檢測試劑盒包括第一試劑和第二試劑。其中，第一試劑包括200_220mol/L Tris緩沖液、5_10mmol/L聚乙二醇、l_5mmol/L疊氮鈉、l-5mmol/L乙二胺四乙酸鈉以及l(fā)-5mmol/L牛血清白蛋白。第二試劑包括200-220mmol/LTris緩沖液、上述結(jié)合有所述單克隆抗體的膠乳顆粒、l_5mmol/L吐溫_20、0.5_3mmol/L疊氮鈉、l-5mmol/L乙二胺四乙酸鈉以及l(fā)_5mmol/L牛血清白蛋白。其他所需的檢測試劑可以根據(jù)需要直接在實驗室制備。
[0021]該單克隆抗體除了應(yīng)用于上述檢測劑盒外，還可以用于其他β 2-微球蛋白檢測試劑盒或設(shè)備中。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，將本實施方式的單克隆抗體直接或間接結(jié)合其他信號基團(如磁性微球、辣根過氧化酶等)，或?qū)⒈緦嵤┓绞降膯慰寺】贵w作為包被抗體(例如ELISA)可用于其他形式的β 2-微球蛋白檢測試劑或設(shè)備中。
[0022]該雜交瘤細胞的分泌產(chǎn)量高，其分泌得到的抗β 2-微球蛋白單克隆抗體具有高親和力、高特異性等優(yōu)點，可廣泛應(yīng)用在β 2-微球蛋白檢測領(lǐng)域，如檢測試劑或檢測設(shè)備的制備領(lǐng)域等，在特異性、靈敏度和檢測率等方面較之傳統(tǒng)的檢測方法具有顯著的優(yōu)勢。
[0023]以下為具體實施例部分
[0024]實施例1雜交瘤細胞株的建立與抗β 2-微球蛋白單克隆抗體的制備
[0025]1.抗原免疫
[0026]將重組β2_微球蛋白抗原(深圳市菲鵬生物股份有限公司生產(chǎn)，貨號BA-PAB-MU0001)等量與弗氏完全佐劑(外觀:琥珀色細胞懸浮液；組份:Paraffin Oi 185%,Mannide Monooleatel5%,Mycobacterium smegmatislmg/mL)混合，得到油狀乳液。將該乳液以0.2mL的劑量皮下注射BALB/c小鼠(廣州省實驗動物中心，6周齡雌性，5只)背部位點，第一次免疫14天后腹腔增強免疫(等量抗原與弗氏不完全佐劑混合)，增強免疫到四針后，采尾血進行效價檢測，效價達到融合要求。
[0027]融合前3天，用相同劑量抗原腹腔注射追加免疫，免疫方法同上。
[0028]2.雜交瘤細胞株的制備
[0029](I)飼養(yǎng)細胞的制備
[0030]以BALB/c鼠腹腔巨噬細胞作飼養(yǎng)細胞。在融合前I天，BALB/c鼠拉頸處死，75%酒精全身浸泡，超凈臺內(nèi)，無菌操作下用剪刀剪開腹部皮膚，暴露腹膜，用注射器腹腔注入RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液5mL，反復沖洗，回收沖洗液，1000rpm,離心5分鐘，留沉淀，用RPMI1640篩選培養(yǎng)液(含HAT的RPMI1640完全培養(yǎng)液中)重懸，調(diào)整細胞濃度I X IO5個/mL,加入96孔板，150 μ L/孔，37°C，5%C02培養(yǎng)過夜。
[0031](2)免疫脾細胞的制備
[0032]小鼠末次免疫后三天，在無菌條件下取出脾臟，置于平皿中，RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液沖洗一次，放于小燒杯的尼龍網(wǎng)上磨碎過濾，制成細胞懸液。離心，棄上清，RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸，如此重復三次，得到免疫脾細胞，計數(shù)。
[0033](3)骨髓瘤細胞的制備
[0034]小鼠骨髓瘤細胞Sp2/0經(jīng)8-氮鳥嘌呤篩選后，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取兩大瓶制成細胞懸液，離心，棄上清，用RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸，如些重復三次，得到骨髓瘤細胞，計數(shù)。
[0035](4)細胞融合及HAT選擇雜交瘤
[0036]將骨髓瘤細胞與免疫脾細胞按1:10比例混合，在50mL塑膠離心管內(nèi)用RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液洗I次，1200rpm,離心8分鐘。棄上清，將細胞混勻，緩慢加入lmL50%的PEG1500融合，融合I分鐘后加入15mL的RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液終止細胞融合。lOOOrpm，離心5分鐘。棄上清，用50mL的RPMI1640篩選培養(yǎng)液輕輕重懸，平分于10塊96孔板，50 μ L/孔，37°C，5%C02培養(yǎng)。培養(yǎng)至第六天，換HAT培養(yǎng)液(含HAT的RPMI1640完全培養(yǎng)液)兩次。
[0037](5)抗體的檢測
[0038]用0.06M PH9.6碳酸緩沖溶液稀釋天然β2_微球蛋白(ADVY)，使其終濃度為5yg/mL。每孔0.lmL，加入96孔聚苯乙烯板，37°C 2小時或4°C過夜。次日，用含10%小牛血清或1%脫脂奶粉的0.02M pH7.2PBS, 0.15mL/孔，37 V封閉2小時，用于檢測。融合后第七天，取細胞上清0.1mL于上述96孔檢測板中，37 °C 30分鐘，水洗六次后加入2000倍稀釋的辣根過氧化酶標記的羊抗鼠IgG (深圳市菲鵬生物股份有限公司生產(chǎn)，貨號BA-PAB-MU0001),37°C 30 分鐘同上洗后，每孔加入 100 μ L 含 0.1%(M/V)鄰苯二胺，0.1%(V/V)雙氧水，pH5.0檸檬酸磷酸緩沖液，370C 15分鐘，加入稀硫酸溶液，每孔50 μ L，測450nm吸收值。RPMI1640完全培養(yǎng)液作為陰性對照，以測定值與對照值的比3 2.0為陽性細胞孔。
[0039]分泌抗體陽性細胞孔以I個細胞/孔在96孔培養(yǎng)板上用有限稀釋法克隆，篩選陽性孔依上法連續(xù)克隆三次，擴大培養(yǎng)后，用含10%DMS0的培養(yǎng)液凍存，細胞密度為IO6個/mL。細胞融合一次共獲得I株能穩(wěn)定分泌抗體的細胞株，命名為β2Μ-2Β1 (CCTCC No:C2013130)細胞株。
[0040]3.單克隆抗體的制備
[0041]選6-8周健壯的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5mL的降植烷；10天后腹腔注射I X IO6個雜交瘤細胞。接種細胞7-10天后可產(chǎn)生腹水，密切觀察動物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠頻于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲5-10mL腹水。收集腹水，離心取上清，放于-20 V冰箱保存。
[0042]取腹水上清，用3倍體積的PBS稀釋后濾紙過濾。將所得的濾液在lmL/min的流速下加到一個已用PBS平衡的蛋白G親和層析柱(購自Amersham Biosciences公司)。然后用PBS以lmL/min的流速洗滌未被蛋白G吸附的物質(zhì)直至在OD28tlnm下的吸收值達到基線為止。再用0.1M的甘氨酸洗脫液(pH2.5)洗脫并回收該抗體。所回收的溶液用0.1M Tris(pH8.8)中和，通過超濾將 抗體濃度調(diào)節(jié)到一個合適的濃度，_20°C分裝凍存。
[0043]4.效價測定
[0044]以間接ELISA法檢測，上述雜交瘤細胞培養(yǎng)上清效價2.18X103,腹水抗體效價
1.59X106。具體實驗步驟如下:
[0045](I)包被:將β 2天然抗原(ADVY)稀釋至2 μ g/mL, 100 μ L/孔加至酶標板，37°C 2小時或者4°C過夜；
[0046](2)用洗板機洗板5次，每次每孔注洗液350 μ L，停留20秒；最后拍干；
[0047](3)用洗滌液洗去包被液，用封閉液封閉，每孔150μ L，37°C放置1.5-2小時；
[0048](4)洗板機洗板5次，每次每孔注洗液350 μ L，停留20秒；最后拍干；
[0049](5)加樣品:分別將稀釋成不同梯度的細胞培養(yǎng)上清和腹水加入用β 2天然抗原包被好的酶標板，100 μ L/孔，37°C反應(yīng)I小時(同時做陰性對照孔和陽性對照孔)；
[0050](6)洗板機洗板5次，每次每孔注洗液350 μ L，停留20秒；最后拍干；
[0051](7)加辣根過氧化酶標記的羊抗鼠IgG酶標二抗(用封閉液稀釋6000倍)，100 μ L/孔，37°C反應(yīng)I小時；
[0052](8)洗板機洗板5次，每次每孔注洗液350 μ L，停留20秒；最后拍干；
[0053](9)加顯色液TMB:即用即配，100 μ L/孔，37°C避光反應(yīng)30分鐘；
[0054](10)終止反應(yīng):于各反應(yīng)孔中加入2M的硫酸，50 μ L/孔；
[0055](11)酶標儀讀數(shù):450nm，630nm波長測定，最終測定該雜交瘤細胞培養(yǎng)上清與β 2天然抗原的反應(yīng)效價為1.1 X 104，腹水抗體與β 2-天然抗原反應(yīng)效價為2.1XlO60
[0056]通過ELISA法，在450nm, 630nm波長測定吸光度，用抗體亞類鑒定試劑盒，對β 2-微球蛋白單抗類、亞類進行鑒定，表1為鑒定結(jié)果。
[0057]表1 β 2-微球蛋白單抗類型鑒定結(jié)果
[0058]
【權(quán)利要求】
1.一種可分泌抗β 2-微球蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞，保藏號為CCTCCN0:C2013130。
2.如權(quán)利要求1所述的可分泌抗β2-微球蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞在制備診斷腎臟損傷疾病或腫瘤的檢測試劑或檢測設(shè)備領(lǐng)域的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求1所述的可分泌抗β2-微球蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞在制備β 2-微球蛋白檢測試劑或檢測設(shè)備領(lǐng)域的應(yīng)用。
4.一種由如權(quán)利要求1所述的可分泌抗β 2-微球蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體。
5.如權(quán)利要求4所述的單克隆抗體在制備診斷腎臟損傷疾病或腫瘤的檢測試劑或檢測設(shè)備領(lǐng)域的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求4所述的單克隆抗體在制備β2-微球蛋白檢測試劑或檢測設(shè)備領(lǐng)域的應(yīng)用。
7.—種β 2-微球蛋白檢測試劑盒，其特征在于，包括如權(quán)利要求4所述的單克隆抗體。
8.如權(quán)利要求7所述的β2-微球蛋白檢測試劑盒，其特征在于，包括第一試劑和第二試劑，其中，所述第一試劑包括200-220mol/L Tris緩沖液、5-10mmol/L聚乙二醇、l-5mmol/L疊氮鈉、l_5mmol/L乙二胺四乙酸鈉以及l(fā)_5mmol/L牛血清白蛋白；所述第二試劑包括200-220mmol/L Tris緩沖液、結(jié)合有所述單克隆抗體的膠乳顆粒、l-5mmol/L吐溫-20、0.5-3mmol/L疊氮鈉、l_ 5mmol/L乙二胺四乙酸鈉以及l(fā)_5mmol/L牛血清白蛋白。
【文檔編號】C12N5/20GK103509760SQ201310470225
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年10月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月10日
【發(fā)明者】李泓彥, 彭亮, 王劉花 申請人:深圳市菲鵬生物股份有限公司