單增李斯特菌lamp檢測引物、檢測方法、試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種單增李斯特菌LAMP檢測引物、檢測方法、試劑盒及其制備方法，屬于生物【技術領域】，單李-FIP為上游內引物，單李-BIP為下游內引物，單李-F3為上游外引物，單李-B3為下游外引物；該試劑盒包括以下物質：（1）化學鍵偶聯有單增李斯特菌單克隆抗體的納米免疫磁珠；（2）環介導等溫擴增（LAMP）反應液，（3）BstDNA聚合酶：8U/μL；（4）陰性對照；（5）陽性對照；（6）顯色液。本發明所述的試劑盒用于檢測食品中的單增李斯特菌，靈敏度高、特異性強、成本低、操作簡便，適合于實驗室快速檢測和便攜式現場檢測，具有廣闊的推廣前景。
【專利說明】單增李斯特菌LAMP檢測引物、檢測方法、試劑盒及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種單增李斯特菌的LAMP檢測試劑盒及其檢測方法，屬生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]單核細胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes, LM)簡稱單增李斯特菌。單增李斯特菌可以感染許多食品，包括家畜肉、發酵香腸和海產品等。WHO將其與大腸桿菌0157:H7、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌并列為20世紀90年代四大食源性致病菌。它是李斯特菌屬中致病力最強的細菌。
[0003]目前單增李斯特菌的鑒定多采用傳統的生化反應實驗和溶血試驗等，其他方法如PCR方法、酶聯免疫吸附法等方法為快速檢測單增李斯特菌提供了關鍵性的技術手段。
[0004]傳統生物學分離培養與生化鑒定是病原菌檢測的金標準。在日常檢測中，首先要將檢測樣品在液體培養基中進行預增菌，之后在固體培養基上進行分離培養，最后進行生化鑒定。該方法所需時間長，一般情況下需要5-7天，很難滿足快速鑒定的需要。PCR技術依賴于傳統方法的前增菌步驟，增菌液中往往含有PCR抑制劑，因此靈敏度受限。酶聯免疫吸附法作為篩選方法快速、靈敏，但是使用的試劑盒是國外產品，價格昂貴，而且需要專門的儀器，推廣起來受限。環介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是基于檢測遺傳物質DNA的一種新的擴增技術。該技術依賴于能夠識別靶序列上6個特異區域的引物和一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在等溫條件下可高效、快速、高特異地擴增靶序列，不需要昂貴復雜的儀器，只需要一臺簡單的加熱器，如普通的水浴鍋即可，因此利于在食品檢測中推廣應用。
[0005]納米磁珠在分離食品中的病原微生物有著重要應用價值:高效富集；在外加磁場作用下能夠快速對其進行移動和分離；抗體易于標記。食品中的單增李斯特菌含量較低，且在食品的加工過程會對LM細胞造成不同程度的損傷，但即使細胞受損，也具有潛在的感染能力。
【發明內容】
[0006]本發明提供一種檢測食品中低含量單增李斯特菌的LAMP檢測試劑盒及其檢測方法。
[0007]為實現上述目的，本發明采用以下技術方案:
[0008]本發明提供了一組檢測單增李斯特菌的LAMP引物，該組引物是依據單增李斯特菌標準菌株ATCC19114溶血素基因(NCBI基因收錄號JN703915)而設計的。
[0009]單李-F3:5，-TAAACTTCGGCGCAATCA-3，，
[0010]單李-B3:5，-CAAATAAACTTGACGGCCAT-3，，
[0011]單李-FIP: 5’ -GGAAGGTCTTGTAGGTTCATTAACAGGAAAATGCAAGAAGAAGTCA-3’，[0012]單李-BIP:5’ -TCGGCAAAGCTGTTACTAAAGAGCTTGAGATATATGCAGGAGGA-3’，
[0013]本發明提供了一種單增李斯特菌的LAMP檢測試劑盒，其包括以下物質:
[0014](I)化學鍵偶聯有單增李斯特菌單克隆抗體的納米免疫磁珠；
[0015]其中，單增李斯特菌的單克隆抗體可以是現有技術中已經公開的單增李斯特菌單克隆抗體，納米磁珠可以是自己研制或者商品化的磁性納米顆粒；通過使用化學鍵偶聯制備單增李斯特菌單克隆抗體的納米免疫磁珠，可有效富集待檢食品中的單增李斯特菌，提高檢測的靈敏度。
[0016](2)環介導等溫擴增(LAMP)反應液:
[0017]其中包括IOXThermopol 反應緩沖液、1.0 ~2.0mmol/L dNTP、2 ~10mmol/L 硫酸鎂(MgS04)、0.5~2.0 μ mol/L上游內引物(單李_FIP)、0.5~2.0 μ mol/L下游內引物(單李-ΒΙΡ)、0.1~0.5 μ mol/L上游外引物(單李_F3)、0.1~0.5 μ mol/L下游外引物(單李-B3)和I~5mol/L甜菜堿；
[0018]其中所述的IOXThermopol 反應緩沖液中含有 200mmol/L Tris-HCl (pH8.8)、100mmol/LKCl、100mmol/L (NH4) 2S04、20mmol/L MgSO4 和 l%Triton X — 100 ;
[0019](3) Bst DNA 聚合酶:8U/ μ L ;
[0020](4)顯色劑:熒光染料SYBR Green I ；
[0021](5)陰性對照:滅菌蒸餾水；
[0022](6)陽性對照:由單增李斯特菌標準菌株ATCC19114提取的核酸作為陽性對照，采用革蘭氏陽性細菌基因組DNA提取試劑盒并按其操作說明提取ImL菌懸液基因組DNA。
[0023]本發明還提供了一種單增李斯特菌的檢測方法，該方法包括以下步驟:
[0024](I)納米免疫磁珠富集菌體:取Img納米免疫磁珠于離心管中，置于磁分離架吸附2min后，棄上清，免疫磁珠用100 μ L滅菌蒸餾水重懸；取ImL待檢食品或菌懸液加入納米免疫磁珠重懸液中，緩慢顛倒混勻，室溫孵育20min，然后置于磁力架上吸附3min，棄上清，納米免疫磁珠用滅菌蒸餾水洗滌兩次，每次10s，最后用100 μ L蒸餾水重懸磁珠，獲得富集后的囷體樣品；
[0025](2)提取步驟⑴獲得的菌體樣品的DNA，即模板DNA，可以利用現有技術中已知的方法或試劑盒提取，例如革蘭氏陽性細菌基因組DNA提取試劑盒或等效試劑盒。
[0026](3)進行LAMP反應，該LAMP反應體系見下表:
[0027]LAMP 反應體系(25 μ L):
[0028]
【權利要求】
1.一種檢測單增李斯特菌的LAMP引物，其特征在于，單李-FIP為上游內引物，單李-BIP為下游內引物，單李-F3為上游外引物，單李-B3為下游外引物； 具體引物為:
單李-FIP:5’ -GGAAGGTCTTGTAGGTTCATTAACAGGAAAATGCAAGAAGAAGTCA-3’ ；
單李-BIP:5’ -TCGGCAAAGCTGTTACTAAAGAGCTTGAGATATATGCAGGAGGA-3’ ；
單李-F3:5’ -TAAACTTCGGCGCAATCA-3’ ；
單李-B3:5’ -CAAATAAACTTGACGGCCAT-3’。
2.—種單增李斯特菌的LAMP檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括以下物質: (1)化學鍵偶聯有單增李斯特菌單克隆抗體的納米免疫磁珠； (2)環介導等溫擴增(LAMP)反應液， 其中包括IOXThermopol反應緩沖液、1.0~2.0mmoI/L dNTP、2~10mmol/L硫酸鎂(MgS04)、0.5~2.0ymol/L上游內引物(單李-FIP)、0.5~2.0 μ mol/L下游內引物(單李-ΒΙΡ)、0.1~0.5 μ mol/L上游外引物(單李_F3)、0.1~0.5 μ mol/L下游外引物(單李-B3)和I~5mol/L甜菜堿； 其中所述的IOXThermopol反應緩沖液中含有200mmol/L Tris-HCl (pH8.8)、100mmol/LKCl、100mmol/L (NH4) 2S04、20mmol/L MgSO4 和 l%Triton X — 100 ;
(3)Bst DNA 聚合酶:8υ/μ L ; (4)陰性對照:滅菌蒸餾水； (5)陽性對照:由單增李斯特菌標準菌株ATCC19114提取的核酸作為陽性對照，采用革蘭氏陽性細菌基因組DNA提取試劑盒并按其操作說明提取ImL菌懸液基因組DNA ； (6)顯色液:熒光染料SYBRGreen I。
3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述LAMP反應液中各種成分的使用終濃度為 IXThermoPol 緩沖液、1.4mmol/L dNTP、8.0mmol/L MgS04、0.2 μ mol/L 上游外引物單李_F3、0.2 μ mol/L下游外引物單李-B3、1.6 μ mol/L上游內引物單李-FIP、1.6 μ mol/L下游內引物單李-BIP。
4. 單增李斯特菌的LAMP檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，包括下列步驟: (O偶聯有單增李斯特菌單克隆抗體的納米免疫磁珠: 取2mg商品化的納米磁珠(粒徑為20~IOOnm)在6mL pH7.0的磷酸緩沖溶液(PBS)中通過磁分離的方法清洗磁珠兩次，加入兩種活化交聯劑:3mgl-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(縮寫為EDC.HCl)和2mg磺酸基琥珀酰亞胺(sulfo-NHS)到6mL含2mg商品化納米磁珠的磷酸緩沖溶液中，室溫旋轉反應30min ;通過磁分離的方法清洗磁珠兩次，用ImL pH7.0的磷酸緩沖溶液重懸磁珠，加入50 μ g單增李斯特菌單克隆抗體，室溫旋轉反應5h ;偶聯結束后通過磁分離的方法清洗磁珠兩次，加入ImL牛血清白蛋白(BSA)質量百分比為2%的磷酸緩沖溶液中，室溫旋轉反應Ih ;封閉后的納米免疫磁珠通過磁分離的方法清洗磁珠一次，加入到IOmL牛血清白蛋白(BSA)質量百分比為0.2%的磷酸緩沖溶液中4°C冷藏備用； (2)LAMP反應液: 含有2.5 μ LlO X Thermopol反應緩沖液、1.4 μ L25mmol/L dNTP (四種脫氧核糖核酸的混合物)、4.0 μ LlO μ mol/L上游內引物(單李-FIP)、4.0 μ LlO μ mol/L下游內引物(單李-ΒΙΡ)、0.5 μ LlO μ mol/L上游外引物(單李_F3)、0.5 μ LlO μ mol/L下游外引物(單李-Β3)、2 μ L100mmol/LMgS04、5 μ L5M 甜菜堿和 2.1 μ L Η20 (滅菌水)； 其中所述的上游內引物(單李-FIP):
5’-GGAAGGTCTTGTAGGTTCATTAACAGGAAAATGCAAGAAGAAGTCA-3， 下游內引物(單李-ΒΙΡ):
5’-TCGGCAAAGCTGTTACTAAAGAGCTTGAGATATATGCAGGAGGA-3， 上游外引物(單李-F3):
5，-TAAACTTCGGCGCAATCA-3， 下游外引物(單李-Β3):
5’-CAAATAAACTTGACGGCCAT-3’ (3)Bst DNA 聚合酶:100μ L(8U/y L):購自 NEB 公司； (4)陰性對照:滅菌水，Im L； (5)陽性對照:由單增李斯特菌標準菌株ATCC19114提取的基因組DNA(100 μ L)作為陽性對照，0D260/0D280能夠達到1.8，濃度達到20ng/μ L ； (6)顯色液:SYBRGreen I 染料(200 μ L),購自 Invitrogen 公司； (7)磁分離架I個，天津生物芯片有限公司。
5.一種單增李斯特菌的檢測方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: O納米免疫磁珠捕獲菌細胞:取Img納米免疫磁珠于離心管中，置于磁分離架吸附2min后，棄上清，免疫磁珠用100 μ L滅菌蒸餾水重懸；取ImL待檢食品或菌懸液加入納米免疫磁珠重懸液中，緩慢顛倒混勻，室溫孵育20min，然后置于磁力架上吸附3min，棄上清，納米免疫磁珠用滅菌蒸餾水洗滌兩次，每次10s，最后用100 μ L蒸餾水重懸磁珠，獲得富集后的囷體樣品； 2)富集菌體樣品DNA的提取； 3)LAMP反應體系(25 μ L)如下:
?I所加體積 I終濃度單李-FIP/ 單李 BIP 4μ L1.6 μ mol/L單李-F3/ 單李 -B30.5μ L0.2 μ mol/L
甜菜堿5μ?lmol/L
dNTP1.4μ L1.4mmol/L
MgSO42 μ L8mmol/L
IOXThermopol 反應緩沖液~2.5μ LTx
模板 DNA2 μ L/
Bst DNA 聚合酶TTl8U
【文檔編號】C12N15/11GK103468823SQ201310464599
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月30日 優先權日:2013年9月30日
【發明者】李正義, 賈俊濤, 梁成珠, 徐彪, 姜英輝, 趙麗青, 張曉梅, 馬云 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心