9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種制備9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺的方法，包括以下步驟：Ⅰ培養：采用補料分批培養方式培養具有產生戊二酰亞胺類抗生素的鏈霉菌屬的微生物，獲得發酵液；Ⅱ分離：將發酵液過濾心，然后以石油醚和丙酮的混合物為洗脫液層析濾液，得到9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺粗品；Ⅲ精制：將9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺粗品通過工業反向色譜柱，以甲醇溶液展開，得到洗脫液，洗脫液通過HPLC法檢測提純，得到9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺精品。本發明的方法采用兩步層析法，可使發酵液中的S632A2和S632A3完全分開，提高了S632A3的收率，采用補料分批培養方式可使發酵液中的產物濃度較高，并可提高培養基中營養物質的利用率。
【專利說明】9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及通過培養具有產生戊二酰亞胺類抗生素的鏈霉菌屬的微生物提純制備9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺的方法以及由此方法得到的9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺。
【背景技術】
[0002]現在已知微生物產物可產生具有廣泛結構特征和具有抗炎等藥理活性的多種物質。戊二酰亞胺類抗生素(S632A)是由鏈霉菌產生的一類具有多種生物學活性的酰亞胺類化合物，現已報道分離到的大約20多種該類抗生素中，結構差別主要在戊二酰亞胺六元環連接的側鏈不同，側鏈的另一端多以環狀結構結束。9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺(S632A3)是由鏈霉菌S632 (Streptomyces hygroscopicus S632)產生的一種具有多種生物學活性的戊二酰亞胺類化合物。研究表明，抗生素S632A3具有抗真菌、抗病毒、抗腫瘤以及抗炎等多種藥理活性。
[0003]通常采用對鏈霉菌S632的發酵液分離提純的方法獲得S632A3，S632發酵液中的S632A是具有S632A2 (9-甲基反霉戊二酰亞胺)和S632A3兩中同分異構體的混合體，現有的分離純化方法一般為一次層析法很難將S632A2和S632A3完全分開，獲得的主要組分為S632A2，致使S632A3的收率很低。因此有必要提供一種具有較高收率的制備S632A3的方法。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種工藝周期短、收率高的制備9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺的方法以及由此方法得到的9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺。
[0005]根據本發明的一個方面，提供了一種制備9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺的方法，該方法包括以下步驟:I培養:采用補料分批培養方式培養具有產生戊二酰亞胺類抗生素的鏈霉菌屬的微生物，獲得發酵液；II分離:將發酵液過濾，然后以石油醚和丙酮的混合物為洗脫液層析濾液，得到9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺粗品JII精制:將9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺粗品利用工業反向色譜柱，以甲醇溶液展開，得到洗脫液，洗脫液通過HPLC法(HighPerformance Liquid Chromatography高效液相色譜法)檢測提純,得到9_甲基反式鏈霉戊二酰亞胺精品。由此，步驟III中采用工業反相色譜柱、HPLC法檢測提純，兩次層析提純可使發酵液中的S632A2和S632A3完全分開，提高了 S632A3的收率，步驟I中采用補料分批培養方式培養微生物，可使發酵液中的產物濃度較高，并可提高培養基中營養物質的利用率，且補料分批培養方式操作工藝簡單。
[0006]在一些實施方式中，在步驟I中，補料分批培養的培養基的pH值為6.8，培養溫度為30~。C，培養時間為4~6天，在培養的第3天向培養基中添加補料培養基。由此，培養基PH值為6.8、培養溫度為30°C便于微生物大量產生代謝物，在培養的第3天補料有益于維持微生物產生代謝物，并可提高培養基的利用率。
[0007]在一些實施方式中，補料培養基包括以重量百分比計的甘油6.0%、葡萄糖5%、蛋白胨5%，余量為水。由此，補料培養基可補充原培養基中消耗量大的營養物質，并可促進微生物代謝。
[0008]在一些實施方式中，在步驟I中，補料分批培養的培養基包括以重量百分比計的甘油3.0%,葡萄糖0.8%, 土豆淀粉0.2%,黃豆餅粉2.0%,蛋白胨1%，NaCl0.5%, CaCO30.2%,余量為水。由此，培養基中的營養成分便于微生物大量繁殖，其中NaCl可維持培養基滲透壓，CaCO3可調節培養基pH。
[0009]在一些實施方式中,在步驟I中，在補料分批培養前還包括種子培養，種子培養基包括以重量百分比計的甘油4.0%，葡萄糖1%，土豆淀粉0.5%，黃豆餅粉2.0%，干酵母0.5%，NaCl0.5%，余量為水，種子培養基的pH值為6.8。由此，種子培養可使微生物由適應期進入對數期，便于在補料分批培養時快速繁殖。
[0010]在一些實施方式中，在步驟II中，濾液層析前還包括下述步驟:采用溶媒提取法、大孔樹脂吸附法或層析法將濾液提純。由此，濾液層析前的提純可提高層析的效率。
[0011]在一些實施方式中，在步驟III中，HPLC條件為:液相流速為4ml/min、液相溫度為18~22°C、檢測波長為560nm。由此，高效液相色譜法中利用檢測波可對S632A3進行有效的分析，液相流速為4ml/min可提聞提純的效率。
[0012]在一些實施方式中，在步驟III中，工業反向色譜柱的固相為粒度50 μ m的十八烷基硅烷鍵合硅膠，甲醇溶液為35%(體積百分比)甲醇溶液。由此，工業反相色譜柱可對9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺粗品進一步提純。
[0013]相應地，本發明還提供了一種根據上述方法得到的9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺，
其化學結構式為: [0014]
【權利要求】
1.制備9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: I培養:采用補料分批培養方式培養具有產生戊二酰亞胺類抗生素的鏈霉菌屬的微生物，獲得發酵液； II分離:將發酵液過濾，然后以石油醚和丙酮的混合物為洗脫液層析濾液，得到9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺粗品； III精制:將9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺粗品利用工業反向色譜柱，以甲醇溶液展開，得到洗脫液，洗脫液通過HPLC法檢測提純，得到9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺精品。
2.根據權利要求1所述的制備9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺的方法，其特征在于，在步驟I中，補料分批培養的培養基的PH值為6.8，培養溫度為30°C，培養時間為4~6天，在培養的第3天向培養基中添加補料培養基。
3.根據權利要求2所述的制備9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺的方法，其特征在于，所述補料培養基包括以重量百分比計的甘油6.0%、葡萄糖5%、蛋白胨5%，余量為水。
4.根據權利要求2述的制備9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺的方法，其特征在于，在步驟I中，補料分批培養的培養基包括以重量百分比計的甘油3.0%，葡萄糖0.8%，土豆淀粉0.2%，黃豆餅粉2.0%，蛋白胨1%，NaCl0.5%, CaCO30.2%，余量為水。
5.根據權利要求1所述的制備9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺的方法，其特征在于，在步驟I中，在補料分批培養前還包括種子培養，種子培養基包括以重量百分比計的甘油4.0%，葡萄糖1%，土豆淀粉0.5%，黃豆餅粉2.0%，干酵母0.5%，NaCl0.5%，余量為水，種子培養基的pH值為6.8。
6.根據權利要求1所述`的制備9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺的方法，其特征在于，在步驟II中，濾液層析前還包括下述步驟:采用溶媒提取法、大孔樹脂吸附法或層析法將濾液提純。
7.根據權利要求1所述的制備9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺的方法，其特征在于，在步驟III中，HPLC法的條件為:液相流速為4ml/min，液相溫度為18~22°C，檢測波長為560nm。
8.根據權利要求1所述的制備9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺的方法，其特征在于，在步驟III中，所述工業反向色譜柱的固相為粒度50ym的十八烷基硅烷鍵合硅膠，所述甲醇溶液為35% (體積百分比)甲醇溶液。
9.一種根據權利要求1所述的方法得到的9-甲基反式鏈霉戊二酰亞胺，其化學結構式為:
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OH、個
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【文檔編號】C12P17/12GK103525882SQ201310460498
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年9月30日 優先權日:2013年9月30日
【發明者】鄧洪斌 申請人:無錫華奈生物科技有限公司