一種用于肉毒桿菌lamp核酸檢測引物組和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種用于肉毒桿菌LAMP核酸檢測引物組和試劑盒，其特征在于，引物組包括：外側正向引物，其為SEQ?ID?No：1所示的多核苷酸序列；外側反向引物，其為SEQ?ID?No：2所示的多核苷酸序列；內側正向莖環引物，其為SEQ?ID?No：3所示的多核苷酸序列；內側反向莖環引物，其為SEQ?ID?No.4所示的多核苷酸序列。一種用于肉毒桿菌LAMP核酸檢測的試劑盒包括所述的引物組。本發明所述檢測試劑盒是將恒溫擴增技術與DNA顯色檢測相結合，靈敏度高、特異性強，結果準確，操作簡單快速，相關儀器設備要求低，適于基層人員操作。
【專利說明】—種用于肉毒桿菌LAMP核酸檢測引物組和試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及分子學和分類學領域，特別涉及用于肉毒桿菌LAMP核酸檢測引物組和試劑盒。
【背景技術】
[0002]肉毒梭狀芽孢桿菌(Clostridium, botulinum)是一種生長在缺氧環境下的革蘭氏陽性產孢子細菌，具有極強的生存能力。肉毒桿菌產生的毒素，肉毒毒素是已知的毒性最強的毒素之一。肉毒桿菌是一種致命病菌，人們食入和吸收這種毒素后，神經系統將遭到破壞，病情嚴重可能導致死亡。目前報道新西蘭恒天然濃縮乳清蛋白粉大批量被肉毒桿菌污染，多家產品被卷入其中。
[0003]傳統肉毒桿菌檢測技術為酶聯免疫吸附劑測定(ELISA)，ELISA檢測技術成本較低，但其受抗體批次和樣本影響比較大，極易出現假陰和假陽性，其靈敏度和特異性無法滿足檢測需要。目前，肉毒桿菌的檢測主要集中在熒光實時定量PCR方法。但是，熒光實時定量PCR方法需要昂貴的儀器設備和專業技術人員，且操作復雜，檢測耗時長，只有專業檢測機構和實驗室才能獨立操作，不利于技術推廣。
[0004]本發明所述用于肉毒桿菌LAMP核酸檢測引物組和試劑盒與傳統檢驗技術和熒光定量PCR技術產品相比靈敏度高、特異性好、儀器要求低、易于操作、適用于高通量篩選和污染易控制等獨到的優勢，市場前景廣闊。
【發明內容】
[0005]本發明目的之一在于提供用于肉毒桿菌LAMP核酸檢測的引物組。本發明的另一目的在于用于肉毒桿菌LAMP核酸檢測的試劑盒。本發明的總體目的是將LAMP核酸檢測與DNA顯色檢測相結合，開發出對儀器設備要求低，操作簡單，適于基層人員操作的肉毒桿菌檢測試劑盒。
[0006]為實現上述目的，本發明公開了一種用于肉毒桿菌LAMP核酸檢測引物組，其特征在于，包括:
[0007]外側正向引物，其為SEQ ID N0.1所示的多核苷酸序列；
[0008]外側反向引物，其為SEQ ID N0.2所示的多核苷酸序列；
[0009]內側正向莖環引物，其為SEQ ID N0.3所示的多核苷酸序列；
[0010]內側反向莖環引物，其為SEQ ID N0.4所示的多核苷酸序列。
[0011]一種用于肉毒桿菌LAMP核酸檢測的試劑盒，其特征在于，包括權利要求1所述的引物組。
[0012]優選的是,包括含有權利要求1所述的引物組的反應體系,25 μ I所述反應體系的配置為:8U/ μ I的鏈置換DNA活性聚合酶，2 μ I濃度為IOmM內側正向莖環引物，2 μ I濃度為1OmM的內側反向莖環引物，0.5μ I濃度為1OmM外側正向引物，0.5μ I濃度為IOmM外側反向引物，2.5μ 110XPCR緩沖液，1μ I濃度為1OmM的dNTPs，1μ I濃度為I~10 μ g/μ I的待檢測基因組DNA提取液，1.25 μ 120XDNA熒光染料和13.25 μ I雙蒸水。
[0013]優選的是，所述DNA熒光染料為10000XSYBR Green I。
[0014]優選的是，以待測肉毒桿菌DNA為模板作為檢測組，以肺炎球菌DNA、大腸桿菌DNA、金黃色葡萄球菌DNA、鼠傷寒沙門氏菌DNA、破傷風梭菌DNA和白色念珠菌DNA做為陰性對照組，用權利要求2所述試劑盒配制所述反應體系進行LAMP檢測，之后用紫外分析儀測量所述反應體系的熒光強度。
[0015]優選的是，與所述陰性對照組相比所述檢測組熒光強度增強說明檢測樣品為肉毒桿菌。
[0016]優選的是，所述試劑盒的檢測反應條件為:95°C預變性5min，65°C恒溫反應Ih和80°C孵育 IOmin。
[0017]本發明人使用本發明所述引物組和試劑盒，按照本發明的檢測方法對肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)、大腸桿菌(Escherichia, coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella Typhimurium)、破傷風梭菌(Clostridium tetani)、白色念珠菌(Candida albicans)等11種不攜帶NTNH基因的菌種進行LAMP核酸檢測，反應結束以后用紫外分析儀進行不開蓋熒光檢測，結果顯示陽性對照產生高強度DNA擴增熒光，而不攜帶NTNH基因的對照菌種不產生高于本底水平的熒光。從而證明對不攜帶NTNH基因的其他菌種的LAMP檢測不會產生假陽性的結果。
[0018]本發明的有益效果是本發明所述LAMP檢測技術30min即可擴增至109倍，于低至幾個拷貝的病毒模板也能有效擴增，與傳統的PCR擴增技術相比，LAMP反應簡單，反應效率大大提高，而且特異性高、儀器要求低，只需要水浴鍋即可，產物檢測用肉眼觀察或紫外分析儀檢測沉淀濁度即可判斷、易于`操作、適用于高通量篩選和污染易控制。本發明所述檢測試劑盒是將恒溫擴增技術與DNA顯色檢測相結合，開發出對儀器設備要求低，操作簡單，適于基層人員操作的肉毒桿菌檢測試劑盒。
[0019]總之，本發明的有益效果為:
[0020]1.本發明中引物組為特異性引物，是專門用于擴增一段肉毒桿菌的特異性保守序列，保證了檢測的特異性和準確性。
[0021]2.本發明試劑盒以LAMP代替熒光實時定量PCR，效率高，時間更短，特異性好靈敏度更高，檢測效果更加準確。
[0022]3.使用本發明所述試劑盒檢測肉毒桿菌無需采購昂貴儀器設備，無需專業技術人員，適于基層推廣。
[0023]4.本發明所述試劑盒檢測方法簡單快捷:反轉錄和擴增反應在恒溫統一環境中一步完成，省去了反轉錄步驟和改變溫度所需的時間。
[0024]5.使用本發明所述試劑盒對肉毒桿菌進行在65°C恒溫條件下高效、特異、快速的擴增目的基因，完成檢測過程，整個檢測過程只需I~2h就可完成。
[0025]6.檢測結果肉眼即可辨別。
[0026]本發明所涉及到的術語定義
[0027]除非另外定義，否則本文所用的所有技術及科學術語都具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常所了解相同的含義。雖然在本發明的實踐或測試中可使用與本文所述者類似或等效的任何方法、裝置和材料，但現在描述優選方法、裝置和材料。[0028]術語“多核苷酸”意指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸(DNA)、脫氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸(RNA)及其聚合物。除非特定限制，否則所述術語涵蓋含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，所述類似物具有類似于參考核酸的結合特性并以類似于天然產生的核苷酸的方式進行代謝。除非另外特定限制，否則所述術語也意指寡核苷酸類似物，其包括PNA (肽核酸)、在反義技術中所用的DNA類似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體(包括(但不限于)簡并密碼子取代)和互補序列以及明確指定的序列。
[0029]術語“PCR”意指聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction),簡稱PCR。聚合酶鏈反應(PCR)是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火(復性)及適溫延伸等幾步反應組成一個周期，循環進行，使目的DNA得以迅速擴增，具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時等特點。它不僅可用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎研究，還可用于疾病的診斷或任何有DNA、RNA的地方.聚合酶鏈反應(Polymerase ChainReaction，簡稱PCR)又稱無細胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增技術。
[0030]術語“環介導恒溫擴增技術”意指針對靶基因的6個區域設計4種特異引物，利用一種鏈置換DNA活性聚合酶在等溫條件60~63°C保溫30~60min，完成核酸擴增反應。
[0031]術語“引物”意指一小段單鏈DNA或RNA，作為DNA復制的起始點，除非特定限制，否則所述術語涵蓋自然中生物的DNA復制和聚合酶鏈式反應(PCR)中人工合成的引物(通常為DNA引物)。之所以需要引物是因為在DNA合成中DNA聚合酶僅僅可以把新的核苷酸加到已有的DNA鏈上。除非特定限制，否則上游引物為在DNA復制時，作為DNA模板3'端的復制起始點的引物，下游引物為在DNA復制時，作為DNA模板5'端的復制起始點的引物。
[0032]術語“鏈置換DNA活性聚合酶”意指一類在細胞復制DNA的過程中起重要作用的酶，以DNA為復制模板，從將DNA由5'端點開始復制到3'端的酶。鏈置換DNA活性聚合酶的主要活性是催化DNA的合成及其相輔的活性。
`[0033]術語“緩沖液”意指一類當往某些溶液中加入一定量的酸和堿時，有阻礙溶液pH變化作用的溶液。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0034]圖1為本發明所述肺炎球菌、大腸桿菌、腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門菌、白色念珠菌、痢疾志賀菌、破傷風梭菌和肉毒桿菌的LAMP核酸檢測結果中各反應管的熒光強度對比圖。
【具體實施方式】
[0035]下面結合附圖對本發明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據以實施。
[0036]實施例1:
[0037]引物設計:
[0038]所述引物組的四個引物使用Premier Biosoft公司的LAMP引物設計軟件LampDesignerl.10,根據肉毒桿菌NTNH結構域的保守序列來設計。
[0039]實施例2[0040]使用本發明所述試劑盒進行肉毒桿菌檢測
[0041]步驟一，提取檢測樣品的基因組DNA作為模板；
[0042]步驟二，將所述基因組DNA在95°C預變性5min，然后立即將所述預變性的基因組DNA置于冰上冷卻；
[0043]步驟三，取I μ I所述預變性的基因組DNA和所述試劑盒中試劑配制成所述LAMP檢測反應體系，輕輕混勻；
[0044]步驟四，將所述配制成的LAMP檢測反應體系65 °C反應Ih進行退火和延伸，之后將退火和延伸后的所述LAMP檢測反應體系80°C孵育IOmin ；
[0045]步驟五，所述孵育結束之后，將所述反應體系置于紫外分析儀中測量所述反應體系的熒光強度，根據所述熒光強度的變化確定檢測結果。
[0046]實施例3:
[0047]陰性對照
[0048]步驟一，提取肺炎球菌、大腸桿菌、腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門菌、白色念珠菌、痢疾志賀菌和破傷風梭菌11種細菌的基因組DNA作為模板；
[0049]步驟二，將所述基因組DNA在95°C預變性5min，然后立即將所述預變性的基因組DNA置于冰上冷卻；
[0050]步驟三，取I μ I所`述預變性的基因組DNA和所述試劑盒中試劑配制成所述LAMP檢測反應體系，輕輕混勻；
[0051]步驟四，將所述配制成的LAMP檢測反應體系65°C反應Ih進行退火和延伸，之后將退火和延伸后的所述LAMP檢測反應體系80°C孵育IOmin ；
[0052]步驟五，所述孵育結束之后，將所述反應體系置于紫外分析儀中測量所述反應體系的熒光強度，根據所述熒光強度的變化確定檢測結果。
[0053]如圖1所示，編號為I~12的反應管分別對應肺炎球菌、大腸桿菌、腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門菌、白色念珠菌、痢疾志賀菌、破傷風梭菌和肉毒桿菌。
[0054]所述實施例2與實施例3中各陰性對照組比較實施例2中產生高強度DNA擴增熒光，如圖1中12號反應管，而不攜帶NTNH基因的實施例3陰性對照菌種不產生高于本底水平的熒光，如圖1中I~11號反應管。從而證明對不攜帶NTNH基因的其他菌種的LAMP檢測不會產生假陽性的結果。
[0055]盡管本發明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發明的領域，對于熟悉本領域的人員而言，可容易地實現另外的修改，因此在不背離權利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發明并不限于特定的細節和這里示出的實施例。
【權利要求】
1.一種用于肉毒桿菌LAMP核酸檢測引物組，其特征在于，包括， 外側正向引物，其為SEQ ID N0.1所示的多核苷酸序列； 外側反向引物，其為SEQ ID N0.2所示的多核苷酸序列； 內側正向莖環引物，其為SEQ ID N0.3所示的多核苷酸序列； 內側反向莖環引物，其為SEQ ID N0.4所示的多核苷酸序列。
2.一種用于肉毒桿菌LAMP核酸檢測的試劑盒，其特征在于，包括權利要求1所述引物組。
3.如權利要求2所述的用于肉毒桿菌LAMP核酸檢測的試劑盒，其特征在于，包括含有權利要求1所述的引物組的反應體系，25 μ I所述反應體系的配置為:8υ/μ I的鏈置換DNA聚合酶，2 μ I濃度為IOmM內側正向莖環引物，2 μ I濃度為IOmM的內側反向莖環引物，0.5μ I濃度為I OmM外側正向引物，0.5μ I濃度為IOmM外側反向引物，2.5 μ 110XPCR緩沖液，I μ I濃度為IOmM的dNTPs，I μ I濃度為I~10 μ g/ μ I的待檢測基因組DNA提取液， 1.25 μ 120 X DNA熒光染料和13.25 μ I雙蒸水。
4.如權利要求3所述的用于肉毒桿菌LAMP核酸檢測的試劑盒，其特征在于，所述DNA熒光染料為 10000XSYBR Green I。
5.如權利要求2所述的用于肉毒桿菌LAMP核酸檢測的試劑盒，其特征在于，以待測肉毒桿菌DNA作為檢測組，以肺炎球菌DNA、大腸桿菌DNA、金黃色葡萄球菌DNA、鼠傷寒沙門氏菌DNA、破傷風梭菌DNA和白色念珠菌DNA做為陰性對照組，用權利要求2所述試劑盒配制所述反應體系進行LAMP檢測，之后用紫外分析儀測量所述反應體系的熒光強度。
6.如權利要求5所述的用于肉毒桿菌LAMP核酸檢測的試劑盒，其特征在于，與所述陰性對照組相比所述檢測組熒光強度增強說明待檢測樣品為肉毒桿菌。
7.如權利要求5所述的用于肉毒桿菌LAMP核酸檢測的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的檢測反應條件為:95°C預變性5min，65°C恒溫反應Ih和80°C孵育lOmin。
【文檔編號】C12N15/11GK103497999SQ201310456252
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年9月29日 優先權日:2013年9月29日
【發明者】楊波, 楊建新, 吳立峰, 郭春雨 申請人:楊波, 楊建新, 吳立峰, 郭春雨