一種綠潮藻滸苔酶解制備生物乙醇的方法
【專利摘要】本發明涉及一種制備生物乙醇的方法，特別涉及一種綠潮藻滸苔酶解制備生物乙醇的方法，制備方法為，首先將滸苔洗凈、干燥，粉碎至60-100目，加入檸檬酸緩沖液得到滸苔混合液；將釀酒酵母A和釀酒酵母B分別采用麥芽汁培養基培養成釀酒酵母A種子液和釀酒酵母B種子液；然后再滸苔混合液中加入纖維素酶和半纖維素酶，混合均勻，在45-55℃條件下酶解40-60小時得到水解液；按照體積比為5-10%的接種量，在水解液中加入釀酒酵母A種子液和釀酒酵母B種子液發酵。本發明采用纖維素酶和半纖維素酶協同作用，使得滸苔中的還原糖含量明顯上升，提高了生物乙醇的產率。本發明對設備要求不高、反應條件溫和、工藝簡單、對環境污染小。
【專利說明】一種綠潮藻滸苔酶解制備生物乙醇的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種制備生物乙醇的方法，特別涉及一種綠潮藻滸苔酶解制備生物乙醇的方法。
【背景技術】
[0002]目前，世界石油資源供應漸趨緊張、環境污染日益嚴重，能源問題也越來越受到人們的關注。能源不僅是資源更是經濟增長的重要投入要素，是人類生存和發展的物質基礎。近兩年來，各大能源消費國競先尋求替代石油的新能源，生物乙醇燃料以其突出的環保性和可再生性，受到許多國家的重視和積極扶持。生物乙醇作為可再生資源，可減少對石油的消耗，能直接作為液體燃料或者同汽油混合使用。
[0003]將苔(Enteromorpha prolifera)是一種常見的大型海洋綠藻,它屬于海藻中的綠藻門(Chlorophyta)、綠藻綱(Chlorophyceae)、石藥目(Ulvales)、石藥科(Ulvaceae)。我國野生滸苔資源十分豐富，僅在福建沿海年產量就10萬噸以上，養殖海域中一年四季均可發生。與其他海藻相比，滸苔生長繁殖快，無須購置種苗，是一種廉價的海洋生物質資源。近年來由于海水富營養化、全球變暖及海水中C02含量增多，滸苔呈爆發式生長，導致“綠潮”，造成海洋災害。自2007年至2013年，黃海連續7年爆發大規模漂浮滸苔“綠潮”，嚴重影響海洋生態及沿海旅游業發展。在2013年6月，僅青島附近海域每天打撈起的滸苔就達4000噸以上，對于清理上岸的數千噸滸苔，大多都被當做垃圾填埋或焚燒，大量的生物質資源被白白浪費了，十分可惜。
[0004]滸苔中總糖含量為39.50%、纖維素含量為13.3%、半纖維素含量為28.01%、淀粉含量為2.475%、水溶性多糖含量為11.503%、水溶性戊聚糖含量為11.25%。滸苔中的纖維素與半纖維素含量較高，是制備生物乙醇的主要組分。纖維素分子間通過大量的氫鍵連接形成纖維素晶體結構，這種結果使得纖維素的性質十分穩定，只有在催化劑作用下才能很好的水解反應。目前，選用的催化劑主要有纖維素酶或者酸，但酸解纖維素對反應容器要求較高，其環境污染性也較高。利用纖維素酶解是效果較好，反應溫和且污染小的一種選擇。但是，采用纖維素酶水解得到的還原糖得率低，直接影響了生物乙醇的產率。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種采用纖維素酶和半纖維素酶協同作用，共同降解滸苔，雙酵母共同發酵來制備生物乙醇的方法，該方法加大了滸苔的利用率，增加了生物乙醇的產率。
[0006]本發明的目的可以通過以下技術方案來實現:
[0007]—種綠潮藻滸苔酶解制備生物乙醇的方法，其步驟包括:
[0008](I)、將滸苔洗凈、干燥，粉碎至60-100目，加入pH=5~5.5的檸檬酸緩沖液得到滸苔混合液；
[0009](2)、在步驟(I)中的滸苔液中，加入纖維素酶和半纖維素酶，混合均勻，在45-55°C條件下酶解40-60小時得到水解液；在滅菌后的水解液中加入釀酒酵母A種子液和釀酒酵母B種子液；種子液總量與水解液體積比為5-10%;釀酒酵母A的保藏號為CICC1043，釀酒酵母B的保藏號為CICC32868 ;優選的酶解溫度為50°C，酶解時間為48小時；
[0010](3)、將步驟(2)中的發酵液在30-37°C下發酵2-3天。
[0011]所述步驟(I)中，滸苔的干燥溫度為55_65°C，干燥時間為12-24小時。
[0012]所述步驟(I)中，檸檬酸緩沖液的濃度為0.lmol/L, pH值為5.2。
[0013]所述步驟(I)中，干燥后的滸苔和檸檬酸緩沖液的用量比為0.04-0.08g/mL。優選的，干燥后的滸苔和檸檬酸緩沖液的用量比為0.05g/mL。
[0014] 所述步驟(2)中，纖維素酶與滸苔的用量比為120_160U/g，半纖維素酶與滸苔的用量比為120-160U/g。優選的，纖維素酶對滸苔底物的用量為150U/g，半纖維素酶對滸苔底物的用量為150U/g。
[0015]所述步驟(2)中，接種時釀酒酵母A和釀酒酵母B的種子液體積比為1:1，接種后發酵液中酵母菌總數為2000-3000萬個/mL。
[0016]所述步驟(2)中，將釀酒酵母A和釀酒酵母B分別采用麥芽汁培養基培養作為釀酒酵母A種子液和釀酒酵母B種子液。
[0017]所述步驟(2)中，將水解液用200目的濾網過濾，并在115°C條件下滅菌10分鐘。優選的，將水解液用兩層紗絹(200目)過濾。
[0018]釀酒酵母A和釀酒酵母B均購于中國工業微生物菌種保藏管理中心。
[0019]與現有技術相比，本發明的有益效果在于:
[0020]1、本發明采用纖維素酶和半纖維素酶協同作用，在較溫和的條件下降解滸苔，增加了滸苔的利用率，使得滸苔中的還原糖含量明顯上升，與單獨使用纖維素酶相比，滸苔中的還原糖含量提聞了 30%。
[0021]2、本發明采用兩種酵母菌共同發酵，加快了發酵時間，增加了最終產物生物乙醇的產率，與單獨使用一種釀酒酵母A相比，生物乙醇的產率提高了 25%。
[0022]3、本發明對設備要求不高、反應條件溫和、工藝簡單、對環境污染極小，而且以泛濫為災的綠潮藻滸苔為原料，變廢為寶，既解決了海洋生態問題又解決了能源緊張問題。
【具體實施方式】
[0023]下面結合實施例，對本發明作進一步說明:
[0024]滸苔:黃海暴發的綠潮藻，主要品種為滸苔；
[0025]纖維素酶:購于國藥集團化學試劑有限公司(編號64001132)；
[0026]半纖維素酶:購于鼎國生物技術有限公司(編號M0033)；
[0027]酵母菌:酵母菌種均購于中國工業微生物菌種保藏管理中心，釀酒酵母 ASaccharomyces cerevisiae (保藏編號 CICC1043)；釀酒酵 B Saccharomycescerevisiae (保藏編號 CICC32868)。
[0028]酵母菌培養基:麥芽汁瓊脂培養基。
[0029]實施例1
[0030]I)酵母菌A種子液的制備:[0031]麥芽汁瓊脂培養基的制備:5° Β?麥芽汁1.0L，瓊脂15.0g,自然pH ；
[0032]接一滿環釀酒酵母A于麥芽汁瓊脂斜面培養基28 °C活化培養24h ；
[0033]接種一滿環斜面培養的釀酒酵母A于裝有50mL麥芽汁培養基的三角瓶中，28°C，170r/min培養24h_48h，即得酵母菌A種子液。
[0034]2)酵母菌B種子液的制備方法同酵母菌A種子液的制備方法。
[0035]3)將滸苔除去貝殼、沙石等雜物后，用清水漂洗3-4遍，置于60°C烘箱中干燥12h，烘干后用粉碎機粉碎I分鐘，將干燥的滸苔粉碎至60-100目。
[0036]取5g上述滸苔粉置于三角瓶中，加入IOOmL檸檬酸緩沖液(檸檬酸緩沖液的pH值為5.2，濃度為0.lmol/L);在三角瓶中分別加入750U的纖維素酶與750U的半纖維素酶，混勻，將三角瓶放置于50°C的水浴鍋中，反應48小時得到水解液，將水解液用兩層紗絹(200目)過濾，在115°C滅菌IOmin ;按體積比為10%的接種量，在水解液中加入釀酒酵母A(CICC1043)種子液與釀酒酵母B (CICC32868)種子液，釀酒酵母A種子液與釀酒酵母B種子液的加入配比為1:1 (體積比)，170r/min振蕩培養60min，發酵液中釀酒酵母A和釀酒酵母B的數量為2500萬個/mL。
[0037]將反應容器密封，在37°C條件下靜置發酵50h，制得生物乙醇。
[0038]檢測結果:
[0039]上述實驗中，在三角瓶置于50°C的水浴鍋中，反應48小時后，水解液用DNS法測定還原糖含量，測定還原糖 得率為59.08% ;使用SBA-40E生物傳感分析儀檢測最終生物乙醇得率為:37.4%ο
[0040]對比例I
[0041]酵母菌種子液的制備方法同實施例1。
[0042]將滸苔除去貝殼、沙石等雜物后，用清水漂洗3-4遍，置于60°C烘箱中干燥12h，烘干后用粉碎機粉碎I分鐘，將干燥的滸苔粉碎至60-100目。
[0043]取5g上述滸苔粉置于三角瓶中，加入IOOmL檸檬酸緩沖液(檸檬酸緩沖液的pH值為5.2，濃度為0.lmol/L);在三角瓶中分別加入750U的纖維素酶，混勻，將三角瓶放置于50°C的水浴鍋中，反應48小時得到水解液；按10%的接種量，在水解液中加入釀酒酵母A(CICC1043)種子液，發酵液中釀酒酵母A的數量為2000萬個/mL，將反應容器密封，在37°C條件下靜置發酵50h，制得生物乙醇。
[0044]對比實驗中，在三角瓶置于50°C的水浴鍋中，反應48小時后，水解液用DNS法測定還原糖含量，測定還原糖得率為45.41% ;檢測最終生物乙醇得率為:22.5%。
[0045]以上所述為本發明的較佳實施例而已，但本發明不應該局限于該實施例所公開的內容。所以凡是不脫離本發明所公開的精神下完成的等效或修改，都落入本發明保護的范圍。
【權利要求】
1.一種綠潮藻滸苔酶解制備生物乙醇的方法，其步驟包括: (1)、將滸苔洗凈、干燥，粉碎至60-100目，加入pH=5~5.5的檸檬酸緩沖液得到滸苔混合液； (2)、在步驟(I)中的滸苔混合液中，加入纖維素酶和半纖維素酶，混合均勻，在45-55°C條件下酶解40-60小時得到水解液；在滅菌后的水解液中加入釀酒酵母A種子液和釀酒酵母B種子液；種子液總量與水解液體積比為5-10%;釀酒酵母A的保藏號為CICC1043，釀酒酵母B的保藏號為CICC32868 ； (3)、將步驟(2)中的發酵液在30-37°C下發酵2-3天。
2.根據權利要求1所述的綠潮藻滸苔酶解制備生物乙醇的方法，其特征在于:所述步驟(I)中，滸苔的干燥溫度為55-65°C，干燥時間為12-24小時。
3.根據權利要求1所述的綠潮藻滸苔酶解制備生物乙醇的方法，其特征在于:所述步驟(I)中，檸檬酸緩沖液的濃度為0.lmol/L, pH值為5.2。
4.根據權利要求1所述的綠潮藻滸苔酶解制備生物乙醇的方法，其特征在于:所述步驟(I)中，干燥后的滸苔和檸檬酸緩沖液的用量比為0.04-0.08g/mL。
5.根據權利要求1所述的綠潮藻滸苔酶解制備生物乙醇的方法，其特征在于:所述步驟(2)中，纖維素酶對滸苔底物的用量為120-160U/g，半纖維素酶對滸苔底物的用量為120-160U/g。
6.根據權利要求1所述的綠潮藻滸苔酶解制備生物乙醇的方法，其特征在于:所述步驟(2)中，酶解溫度為50°C，酶解時間為48小時。
7.根據權利要求1所述的綠潮藻滸苔酶解制備生物乙醇的方法，其特征在于:所述步驟(2)中，接種時釀酒酵母A和釀酒酵母B的種子液體積比為1:1，接種后發酵液中酵母菌總數為2000-3000萬個/mL。
8.根據權利要求1所述的綠潮藻滸苔酶解制備生物乙醇的方法，其特征在于:所述步驟(2)中，將釀酒酵母A和釀酒酵母B分別采用麥芽汁培養基培養作為釀酒酵母A種子液和釀酒酵母B種子液。
9.根據權利要求1所述的綠潮藻滸苔酶解制備生物乙醇的方法，其特征在于:所述步驟(2)中，將水解液用200目的濾網過濾，并在115°C條件下滅菌10分鐘。
【文檔編號】C12R1/865GK103468751SQ201310455653
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月29日 優先權日:2013年9月29日
【發明者】費嵐, 邵飛, 何培民, 賈睿, 胡樂琴, 黃希文, 李少香, 溫文科 申請人:上海海洋大學