一種pH穩定比酶活高的重組堿性果膠酶及其構建方法
【專利摘要】本發明公開了一種pH穩定性好、比酶活高的堿性果膠酶和編碼基因及其構建方法。采用定點誘變技術將枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis168的堿性果膠酶編碼基因pel168進行誘變，將457位的鳥嘌呤G變成胸腺嘧啶T，使得編碼的果膠酶的成熟肽第132位的纈氨酸V突變成苯丙氨酸F，突變基因pel168V132F在大腸桿菌RossetBlue(DE3)進行表達，經誘導表達、破菌、純化，再將純化的酶進行酶活測定，得到的果膠酶突變體PEL168V132F比原始的果膠酶PEL168在pH為3、5、6時，相對活性有顯著提高，同時比酶活也是原始酶的2.25倍。這為堿性果膠酶的廣泛應用奠定了良好的基礎。
【專利說明】一種pH穩定比酶活高的重組堿性果膠酶及其構建方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種pH穩定性、比酶活得到提高的重組堿性果膠酶和其編碼基因，及其構建方法，屬于生物遺傳工程【技術領域】。
【背景技術】
[0002]果膠酶是分解果膠質的多種酶的總稱。果膠酶按其作用最適pH分為酸性果膠酶和堿性果膠酶。酸性果膠酶的酶作用最適pH在偏酸性范圍，廣泛應用于果汁和酒類的提取以及飼料工業(部敏辰，2006)。堿性果膠酶的酶作用最適pH在8.0-10.0，目前在植物藥提取、茶和咖啡發酵、油提取，紡織、造紙、洗滌劑、植物纖維加工、含果膠工業廢水處理及生物技術等行業的應用越來越受到重視，所以成為人們研究的熱點(Jayani RS, et al.ProcessBiochemistry 40:2931-2944,2005)。
[0003]果膠酶可來源于植物和微生物，但植物天然來源的果膠酶產量低且提取困難，難以大規模制備；微生物具有生長速度快、生長條件簡單、代謝過程特殊和分布廣等特點(華寶玉等，2012)，易于進行基因改造，為果膠酶的廣泛工業化應用打下堅實基礎。
[0004]本發明前期研究的堿性果膠酶基因pell68來源于subtil is 168,含有1263bp的開放閱讀框,編碼420個氨基酸,通過SignalP分析,顯示該氨基酸序列含有21個氨基酸的信號肽。將該基因pell68在大腸桿菌中進行了表達，表達所得果膠酶PEL168經純化后進行酶學性質的研究表明，該酶的最適溫度為50° C，最適PH為9.4。但是，這種堿性果膠酶在pH為3~6時,相對活性降低40%,并且比酶活也較低(Chengjie Zhang et al,BMC Biotechnology,2013)。
[0005]在工業化應用中，酶的pH適應范圍窄將需要更多的技術來維持反應體系中pH的穩定，同時需要大量的酸或堿 來中和，就造成成本高、用水量大、能耗高、耗時長，廢液中COD值高等問題，同時果膠酶的高效性，多用性的研究也迫在眉睫。因此，獲得更加高效、多用、穩定的果膠酶，就成為更好的研究開發與應用果膠酶的關鍵。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提出一種pH穩定性、比酶活較高的重組堿性果膠酶及編碼基因，及其構建方法。.本發明是這樣實現的。在GenBank收錄號AL009126中含有的果膠酶基因pell68，對應果膠酶PEL168的氨基酸序列收錄號為CAB12585.1，設計點突變引物(FP和RP)進行定點誘變，將公布的基因457位的鳥嘌呤G變成胸腺嘧啶T，獲得pell68V132F，使得其編碼氨基酸序列成熟肽的第132位的纈氨酸V (GTC)突變成苯丙氨酸F (TTC)，獲得重組堿性果膠酶PEL168V132F。
[0007]V132F,氨基酸序列具體如下
I ADLGHQTLGS NDGffGAYSTG TTGGSKASSS NVYTVSNRNQ LVSALGKETN 51 TTPKIIYIKG TIDMNVDD NL KPLGLNDYKD PEYDLDKYLK AYDPSTffGKK
【權利要求】
1.一種pH穩定比酶活高的重組堿性果膠酶，其特征在于在GenBank收錄號AL009126中含有的果膠酶基因pel 168，對應果膠酶PEL168的氨基酸序列收錄號為CAB12585.1，設計點突變引物(FP和RP)進行定點誘變，將公布的基因的457位的鳥嘌呤G變成胸腺嘧啶T，獲得pell68V132F，使得其編碼氨基酸序列成熟肽的第132位的纈氨酸V (GTC)突變成苯丙氨酸F(TTC)，獲得重組堿性果膠酶PEL168V132F。
2.一種pH穩定比酶活高的重組堿性果膠酶及其構建方法，，其特征在于包括如下步驟: 1)采用化學全合成或PCR方法克隆氨基酸序列收錄號為AL009126的堿性果膠酶基因pell68 ； 2)將步驟I)獲得的堿性果膠酶基因pell68連接到大腸桿菌表達載體pET28a上，得到重組載體 pET28a-pell68 ； 3)設計將成熟肽的第132位氨基酸V突變成F的點突變引物FP和RP，
FP: 5' CACGACGATCTTCGGTTCAGGGACTAACG 3’
RP: 5’CCGAAGATCGTCGTGTTTGCAGGGATAT 3’ 將步驟2)獲得的重組載體pET28a-pell68作為模板進行全質粒PCR ； 4)將步驟3)獲得的PCR產物用DpnI進行去甲基化，37°C處理1_2h，70°C處理15min滅活后，直接轉化到大腸桿菌XL-GOLD克隆感受態細胞中，挑選兩個轉化子經測序得到點突變的重組載體pET28a-p ell68V132F ； 5)將步驟4)獲得的重組載體pET28a-pell68V132F轉化大腸桿菌Tfol5lSeiBlue (DE3),得到產果膠酶 PEL168V132F 的重組菌株 Rb (DE3)-pET28a_pell68V132F ； 6)將菌株Rb(DE3)-pET28a-pell 68V132F按照常規的大腸桿菌誘導表達重組蛋白方法，獲得重組蛋白PEL168V132F， 測定果膠酶的活性。
【文檔編號】C12R1/19GK103881996SQ201310453358
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2013年9月29日 優先權日:2013年9月29日
【發明者】張桂敏, 徐婷, 宋江寧, 馬延和 申請人:湖北大學