一種Clec3b基因敲除打靶載體的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種Clec3b基因敲除打靶載體及其構建方法，在Clec3b基因外顯子1的前后各引入一個loxP位點，其中，一個為獨立的loxP位點，另一個帶有Neomycin標記（Neo）；通過重組導入載體中。本發明所述載體通過敲除外顯子1以及其上游的啟動子，使整個TN蛋白無法表達，真正完全消除了TN的功能。這種小鼠模型的建立對研究TN的功能既提供了便捷性，同時又提供了研究準確性的保證。
【專利說明】—種Clec3b基因敲除打靶載體
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種條件基因敲除重組載體，尤其涉及一種用于構建敲除Clec3b基因小鼠模型的重組載體、以及所述載體的構建方法。
【背景技術】
[0002]四連接素(tetranectin，TN)于1986年在人類血漿中被發現，是凝集素家族C型成員之一，其分布十分廣泛，見于多種組織和細胞中。除了人類，在猴、馬、貓、豬、牛、狗、鼠、羊、魚、爬行動物、兩棲動物等動物中也發現TN蛋白的存在，說明TN在動物的生長發育過程中起重要的作用。
[0003]TN在血漿中被發現不久，即被發現與多種疾病、尤其是惡性腫瘤有關，如乳房癌、結腸癌、卵巢癌、冠心病、風濕性關節炎、多發性硬化、老年性癡呆、帕金森病等。研究顯示，在惡性腫瘤患者血清中，TN呈低水平表達，但是在腫瘤組織中卻高表達；還有研究證實，TN在帕金森病患者腦脊液中顯著下調，因此可能參與了帕金森病的發生，有可能成為帕金森病的生物標記物。
[0004]雖然關于TN的研究已展開30年，但是，至今為止，TN的生理作用并不清楚。根據目前研究，一般認為TN的作用是通過它與纖溶酶原的結合來完成的。TN編碼基因(Clec3b)含三個外顯子，二個內含子，每個外顯子都編碼其特有的功能區域，其中外顯子3編碼的CRD區可能是TN與纖溶酶原結 合的主要部位。但是，是否受其他區域影響則不清楚。目前TN領域的研究成果非常有限，因此深入研究TN的作用機理，對進一步研究腫瘤等疾病的發生機制和治療方法具有十分重要的意義。
[0005]但是目前研究TN 作 用機理的動物模型非常匱乏，國外文獻(至今總共發現2篇基因敲除的研究文獻，且為同一機構報道)有報道通過敲除外顯子3的方式獲得TN敲除的小鼠模型，但是，這種方法僅消除了 TN的部分功能，尚不能充分說明TN的功能是否完全消除。研究發現TN外顯子3敲除后，可引起小鼠的脊椎發育出現畸形以及傷口愈合出現延遲，可是，報道的2篇文獻均未能解釋、也無法確認是否通過影響TN與纖溶酶原結合而導致這些現象的出現。因此，仍然需要研發完全消除TN功能的動物模型，以更好的在TN領域展開研究。
【發明內容】
[0006]針對目前TN基因研究模型存在的缺陷，本發明提供了一種能夠構建敲除Clec3b基因小鼠模型的重組載體，所構建的小鼠模型克服了【背景技術】所述小鼠模型的缺點，通過敲除外顯子I以及其上游的啟動子，使整個TN蛋白無法表達，真正完全消除了 TN的功能。這種小鼠模型的建立對研究TN的功能既提供了便捷又提供了保證。
[0007]本發明第一個方面是提供一種Clec3b基因敲除打靶載體的構建方法，所述方法包括:
[0008]在Clec3b基因外顯子I的前后各引入一個1xP位點，其中，一個為獨立的1xP位點，另一個帶有Neomycin標記(Neo);通過重組導入載體中。
[0009]本發明第一個方面所述的方法的一種優選實施例中，設計5’同源臂(5’arm)和3’同源臂(3’ arm)弓丨物P1-P 4如下:[0010]Pl:5，-GGGCGGTGCTCTTTCCATTAGTT-3’
[0011]P2:5，-CTGAGCCCAGAAAGCGAAGGA-3’
[0012]P3:5’ -GTGCCACTCCCACTGTCCTTTCC-3’
[0013]P4:5， -TTCCTCTGTGACTGGCCCGACTCC-3’
[0014]其中，Pl和P2擴增2.7kb的5，同源臂，P3和P4擴增3.8kb的3，同源臂。
[0015]本發明第一個方面所述的方法的一種優選實施例中，所述方法步驟為:
[0016]PCR擴增5’和3’同源臂，BAC轉化至EL350，進行同源重組；
[0017]在第一個位置插入f1xP-Neo-1oxP片段；然后切除1xP位點的floxed Neo標記，余下一個1xP ；
[0018]在第二個1xP位置插入ΙοχΡ/FRT-NeFRT片段，構建完成。
[0019]本發明第二個方面是提供一種上述方法構建的Clec3b基因敲除打靶載體。
[0020]本發明提供的重組載體，通過小鼠胚胎干細胞基因打靶、藥物篩選、挑取陽性克隆、PCR鑒定獲得同源重組克隆，將正確同源重組的胚胎干細胞通過囊腔注射獲得嵌合體子代，嵌合體子代通過與野生型雜交后獲得雜合子，雜合子之間進行雜交繁育即獲得純合子。
[0021]本發明所述載體通過敲除外顯子I以及其上游的啟動子，使整個TN蛋白無法表達，真正完全消除了 TN的功能。這種小鼠模型的建立對研究TN的功能既提供了便捷性，同時又提供了研究準確性的保證。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]圖1為本發明Clec3b基因條件敲除打靶載體構建策略示意圖；
[0023]圖2為本發明Clec3b基因條件敲除打靶載體質粒圖譜；
[0024]圖3為本發明Clec3b基因條件敲除打靶載體的DNA酶切電泳照片；
[0025]圖4 為 ES 細胞克隆 PCR 電泳照片，其中，1:5’arm5’PCR B4 ;2:5，arm5，PCR B5 ；3:5’arm5’PCR C7 ；4:3’arm3’PCR B4 ；5:3’arm3’PCR B5 ；6:3’arm3’PCR C7 ；M =GeneRulerlkbDNA Ladder Ferments (Cat No:SM0311)。
【具體實施方式】
[0026]Clec3b 基因(EnsemblGene ID:ENSMUSG00000025784 ；BAC:BMQ193ml7)外顯子(Exon)和內含子(Intron)如表1所示。
[0027]表1，Clec3b基因的外顯子和內含子
[0028]
Exon/Intron 長度起始位置終止位置
Exonl (ATG) 159 10001 10159
Intronl-2 3264~10160 13423
【權利要求】
1.一種Clec3b基因敲除打靶載體的構建方法，其特征在于，所述方法包括: 在Clec3b基因外顯子I的前后各引入一個1xP位點,其中，一個為獨立的1xP位點，另一個帶有Neomycin標記(Neo);通過重組導入載體中。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法步驟為: PCR擴增5’和3’同源臂，BAC轉化至EL350，進行同源重組； 在第一個位置插入f1xP-Neo-1oxP片段；然后切除1xP位點的floxed Neo標記,余下一個1xP ； 在第二個1xP位置插入ΙοχΡ/FRT-NeFRT片段，構建完成。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所設計的5’同源臂(5’arm)和3’同源臂(3’ arm)引物P1-P4如下:
Pl:5’ -GGGCGGTGCTCTTTCCATTAGTT-3’
P2:5， -CTGAGCCCAGAAAGCGAAGGA-3，
P3:5’ -GTGCCACTCCCACTGTCCTTTCC-3’
P4:5’ -TTCCTCTGTGACTGGCCCGACTCC-3’ 其中，Pl和P2擴增2.7kb的5’同源臂，P3和P4擴增3.8kb的3’同源臂。
4.一種如權利要求1所述`的方法制備的Clec3b基因敲除打靶載體。
【文檔編號】C12N15/63GK103525850SQ201310451259
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年9月27日 優先權日:2013年9月27日
【發明者】王爾松, 田恒利 申請人:上海市第六人民醫院