一種維生素c混合菌的保藏方法
【專利摘要】本發明涉及一種維生素C混合菌的保藏方法，該方法將大、小菌搭配培養的維生素C混合菌種之斜面，用體積濃度為50%的甘油制備成懸浮液，再封裝于無菌凍存管中，置于-70±2℃溫度下保存。采用本發明方法保藏的VC二步菌菌種，其菌種死亡率在1%以下，變異率為零，其菌種的特性和穩定性可保持五年以上，且需用時操作方法簡單易行，活化后的二步菌發酵水平都基本保持在115-125mg/ml的水平，二步轉化率在94%以上，生產得到了穩定，避免了因頻繁傳代帶來的風險。
【專利說明】一種維生素C混合菌的保藏方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物發酵【技術領域】，特別是涉及一種維生素C混合菌的保藏方法。
【背景技術】
[0002]維生素C (VitanunC, Vc)是人體營養必需的維生素，其不僅作為重要的醫藥產品用于治療多種疾病，也廣泛用于食品、飼料及化妝品中。隨著維生素C應用范圍的增加，市場需求量日益增大，使人們對VC生產技術不斷地進行研究、改進。現行技術中維生素C的發酵生產通常采用的都是二步法，其中古龍酸的合成:采用巨大芽孢桿菌(俗稱大菌，大菌為革蘭氏陽性芽孢桿菌，可染噬菌體，較易分化，)和氧化葡萄糖酸桿菌(俗稱小菌，小菌為革蘭氏陰性無芽孢桿菌，菌體呈短桿，近呈球體)兩者混合發酵，因為小菌適宜在中性條件下生長，可以氧化山梨糖成古龍酸，但小菌單獨培養生長欠佳，且產酸甚微，需與大菌混合培養，其與小菌共同發酵有明顯促進小菌產酸的作用，大菌為小菌的伴生菌，在整個發酵中小菌起到關鍵的作用，且需要掌握大小菌的合適比例。
[0003]原有古龍酸生產技術環節中，一般不進行常規的菌種保藏，其保藏方式是制備的種子液一部分進罐發酵生產，一部分經過分離制備成斜面，再制備種子液，制備的種子液一部分進罐生產，一部分經過分離制備成斜面，通過對產生菌采用反復循環、活化、傳代的方式為生產提供種子液。由于頻繁傳代、活化，菌種很容易出現大小菌比例失調，產酸能力下降，甚至因為反復移種、傳代極易造成大面積染菌現象，從而使生產的穩定性不能得到有效的控制和保障，因為發酵生產水平的波動，給后工序生產同時帶來了技術難度，為產品的質量問題也埋下了隱患。
【發明內容】
[0004]本發明的目的就在于`克服上述現有技術的缺陷，提供一種維生素C混合菌的保藏方法，利用該方法可保證菌種的相對穩定性，防止因菌種質量的不穩定性給生產造成波動。
[0005]為實現上述發明目的所采取的技術方案為:
[0006]一種維生素C混合菌的保藏方法，其特征是:將大、小菌搭配培養的維生素C混合菌種之斜面，用體積濃度為50%的甘油制備成懸浮液，再封裝于無菌凍存管中，置于_70±2°C溫度下保存。
[0007]上述大、小菌搭配培養的過程為:
[0008]a.將經過搖瓶篩選，且生產性能優良的原始菌菌株的種子液分離于平板，涂布均勻，置29.5±1°C培養箱培養60~72小時；
[0009]b.在無菌條件下挑外觀生長良好，半透明，分布均勻，無雜菌的小菌放入無菌水中，使小菌水呈乳白色，接種至茄形瓶斜面上，放入29.5±1°C恒溫室培養22~24小時，觀察無雜菌生長后，接入生長良好，大小適中，邊緣齊整的大菌，在同等溫度條件下繼續培養46~50小時。
[0010]上述冷凍的菌體經過三代活化培養后用于大生產。[0011]本發明將優質的菌株增殖培養，用甘油制成懸浮液后進行批量的冷凍保藏，保證每個周期的菌種質量都是一致的，且只使用一個生產周期，并且每個生產周期使用的菌種是獨立包裝保存的，生產過程不需常年依靠轉種的方式保留菌種，有效防止染菌或種液質量退化現象，使發酵過程更趨于穩定，為提煉工序打下良好基礎，產品質量得到保障。
[0012]采用本發明方法保藏的VC 二步菌菌種，其菌種死亡率在1%以下，變異率為零，其菌種的特性和穩定性可保持五年以上，且需用時操作方法簡單易行。
[0013]采用凍存管活化三代種液進罐生產以來，無論是從試驗罐到大生產，二步菌發酵水平都基本保持在115-125mg/ml的水平，二步轉化率在94%以上，生產得到了穩定，也避免了因頻繁傳代帶來的風險。
[0014]按照此菌種保藏方法，經過近四年的保藏，維生素C混合菌菌種的性能絲毫未減，生產各項指數穩定，避免了反復傳代帶來的波動及染菌的風險對生產的影響。應用本發明的方法，既簡化了操作工藝，又穩定了生產，且在種子制備環節，減少了人員操作，降低了人工成本。
[0015]
【權利要求】
1.一種維生素C混合菌的保藏方法，其特征是:將大、小菌搭配培養的維生素C混合菌種之斜面，用體積濃度為50%的甘油制備成懸浮液，再封裝于無菌凍存管中，置于-70±2°c溫度下保存。
2.按照權利要求1所述的維生素C混合菌的保藏方法，其特征在于上述大、小菌搭配培養的過程為: a.將經過搖瓶篩選，且生產性能優良的原始菌菌株的種子液分離于平板，涂布均勻，置29.5±1°C培養箱培養48~72小時； b.在無菌條件下挑外觀生長良好,半透明，分布均勻，無雜菌的小菌放入無菌水中，使小菌水呈乳白色，接種至茄形瓶斜面上，放入29.5± I°C恒溫室培養22~24小時，觀察無雜菌生長后，接入生長良好，大小適中，邊緣齊整的大菌，在同等溫度條件下繼續培養46~50小時。
3.按照權利要求1所述的維生素C混合菌的保藏方法，其特征是:冷凍的菌體經過三代活化培養后用于大生產。
【文檔編號】C12N1/04GK103497895SQ201310443256
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年9月26日 優先權日:2013年9月26日
【發明者】李學兵, 于新燕, 胡繼紅, 陳惠琴 申請人:寧夏啟元藥業有限公司