一種在分子生物學領域快速鑒別全蝎藥材的方法
【專利摘要】本發(fā)明在分子生物學領域公開了一種快速鑒別全蝎藥材（東亞鉗蝎）品種的方法。該法采用標準的苯酚-氯仿法或者動物DNA抽提試劑盒提取全蝎DNA；利用一段線粒體基因COⅠ作為擴增引物進行PCR擴增；對得出的序列特征進行分析比對，合并NCBI中下載的東亞鉗蝎序列（KC141981.1-KC142024.1，JF700145.1-JF700146.1，DQ340065.1，NC009738.1）共同建立全蝎藥材DNA序列本地blast數(shù)據(jù)庫，并確定變異位點。通過與未知蝎類樣品序列進行比較，若未知樣品的變異位點均在本發(fā)明所確認的變異位點范圍內，即可確認為東亞鉗蝎，從而進行鑒別。本發(fā)明能對全蝎藥材（東亞鉗蝎）的不同生物型以及其幼體或殘缺個體進行鑒定，具有迅速、簡捷的特點。本發(fā)明用于鑒定的DNA序列作為現(xiàn)有區(qū)分個體最可靠的方法之一，使得其比傳統(tǒng)的鑒定方法更準確。
【專利說明】一種在分子生物學領域快速鑒別全蝎藥材的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明是在分子生物學領域發(fā)明的一種可以快速鑒別全蝎藥材(東亞鉗蝎)品種的方法。
【背景技術】
[0002]全蝎為鉗蝎科動物東亞鉗蝎Buthus martensii Karsch的干燥體,食用、藥用歷史悠久，其主要藥用成分為蝎毒素(Buthotoxin)，據(jù)《本草綱目》和《中國藥典》載，全蝎具有“熄風鎮(zhèn)痙、消炎攻毒、通絡止痛”功能；主治“小兒-(風、抽搐痙攣、皮膚病、心腦血管病、炎癥、乙肝、腫瘤”等病。
[0003]鉗蝎的藥用精華主要在于蝎毒，其具有兩大毒素，即神經毒素和細胞毒素，它在神經分子，分子免疫，分子進化，蛋白質的結構與功能等方面有著廣闊的應用前景；對神經系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)、癌癥、等多種疾病，以及對人類危害極大的各種病毒均有預防和抑制作用?？梢灶A料蝎毒將會為人類醫(yī)療保健事業(yè)發(fā)揮巨大作用。因而準確的物種鑒定是物種分布調查及種群發(fā)生動態(tài)研究的前提，也是全蝎進行深入研究的基礎。
[0004]在傳統(tǒng)的鑒定方法下，對全蝎的鑒別主要依賴于其形態(tài)特征，但存在較大的局限性。眾所周知，近緣種之間的區(qū)別特征少且不夠明顯，傳統(tǒng)的鑒定方法容易造成錯誤鑒別；傳統(tǒng)的鑒定方法幾乎無法準確鑒定同種全蝎的不同生物型；傳統(tǒng)的鑒定方法難以提供針對全蝎幼體或殘缺個體的鑒別。綜上，傳統(tǒng)的鑒定方法在全蝎的鑒定工作中存在的較大的局限性，費時費力，且易混淆。
[0005]隨著分子生物學領域的迅速發(fā)展和PCR技術的日臻完善，將其用于鑒定物種的方法應運而生，并具有快速、準確、可自動化及全球通用的分類鑒定工具等優(yōu)點，在一定程度上可以滿足相關行業(yè)對物種鑒定的迫切需求。
[0006]DNA條形碼技術是一種分子生物學研究手段，根據(jù)DNA條形碼技術在動物物種區(qū)分中的作用和可行性，以基因序列變異適中，序列差異程度較明顯的細胞色素C氧化酶亞基I (CO I)區(qū)域作為保守區(qū)用以提取動物DNA已成為動物物種鑒定的通用方法之一，因為CO I能夠在保證足夠變異的同時又很容易被通用引物擴增，而且其DNA序列本身很少存在插入和缺失，且適用于東亞鉗蝎。該方法可以彌補傳統(tǒng)形態(tài)鑒定的一些不足。目前國內外尚無東亞鉗蝎序列完整的變異位點和由此鑒別全蝎藥材種類的報道。
【發(fā)明內容】
[0007]本發(fā)明的目的是針對全蝎形態(tài)鑒定的不精確，科學鑒定手段缺乏的現(xiàn)狀，提供的一種科學有效、快捷準確的分子生物學鑒定方法，該法包括下列順序的步驟:
A.在山東臨沂、山東濟南、山西忻州、山西大同、河北保定、河南洛陽、陜西西安、湖北十堰8個產地共計獲得600份東亞鉗蝎樣品，75%乙醇浸泡消毒；
B:采用標準的苯酚-氯仿法或者動物DNA抽提試劑盒提取全蝎藥材總DNA ；
要求取材過程中，避免真菌等的污染，因而舍去全蝎的腹部，僅從其頭部、胸部、腿部及尾部取材；
所采用的儀器為DNA樣品粉碎研磨儀(Retsch，MM400，Germany)，水浴鍋(上海申光，雙列四孔，中國)，梯度 PCR 擴增儀(Eppendorf, Mastercycler gradient, Germany),離心機(Thermo, LEGEND MICRO 21, America),移液器(Thermo, Scientific FinnpipetteFl, America),電泳儀(BIO-RAD, Power pac 300, America),紫外凝膠成像儀(Syngene, England);所采用的試劑為血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(Tian-genBiotech C0., China),2XTaq PCR Master Mix (Tian-gen Biotech C0., China),100 bpDNA Ladder Marker (Tian-gen Biotech C0.，China),溴化乙,定(EB, ethidium bromide)試劑盒為TIANGEN的血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)；
C:利用DNA擴增引物——一段線粒體基因COI序列標記并進行PCR擴增；
PCR 反應體系為 25μ 1，其中全蝎 DNA 模板 2μ l，2XTaq PCR Master Mix 12.5μ I,HCO I和LCO I引物分別I μ l，ddH20 8.5 μ I ;以封口膜封蓋體系；PCR反應條件為:94°C預變性5分鐘，94 V變性I分鐘，45 V退火I.5分鐘,72 °C延伸I.5分鐘，5個循環(huán)；94 V變性I分鐘，50°C退火1.5分鐘，72°C延伸I分鐘，35個循環(huán)；72°C再延伸5分鐘；測序反應；所用儀器為 Applied Biosyste ms 公司的 ABI 3730XL ；
其中，HCO I 引物為 TGA TTT TTT GGT CAC CCT GAA GTT TA LCO I 引物為 CCA ATA TCT TTA TGA TTT GTT GAC C ；
D:取適量PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳,并以溴化乙錠(EB, ethidium bromide)染色后置于紫外燈下觀察，以100 bp DNA Ladder Marker為DNA Marker作參照,得到特異性的單一明亮條帶，測序；
E:測序后序列進行拼接并分析,合并NCBI中下載的東亞鉗蝎序列(KC141981.1-KC142024.1, JF700145.1- JF700146.1, DQ340065.1, NC009738.1)共同建立全蝎 DNA 序列本地blast數(shù)據(jù)庫,并確定變異位點。
[0008]F:獲得未知全蝎樣品時，重復A-D步驟，拼接序列后通過分析未知樣品序列與數(shù)據(jù)庫的位點匹配程度來確認樣品全蝎種類，若樣品序列的變異位點均存在于本專利所列出的變異位點列表內，即可確定為東亞鉗蝎。
[0009]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下突出的優(yōu)點:
1、全蝎的分子生物學鑒定方法能對各品種的不同生物型、幼體或殘缺個體進行鑒定，具有快速、準確的特點，即使在大樣本量情況下，通常可2天內完成，省時省力。
[0010]本發(fā)明所使用的儀器設備要求較低，費用較少，且準確度更高。
[0011]本發(fā)明所采用的方法，很大程度上解決了當前全蝎藥材較難快速準確鑒定的難題，填補了行業(yè)空白，具有重要意義。
【具體實施方式】
[0012]實施例
為了更簡易的描述本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點，結合【具體實施方式】闡述如下:
1、在山東濟南藥材市場購得一份全蝎藥材，經山東中醫(yī)藥大學鑒定學教授張永清教授鑒定后，確定為東亞鉗蝎。
[0013]2、以75%酒精擦拭樣品消毒，取消毒后的全蝎個體，用解剖針將全蝎腹部切除，保留其他部分標號留存。
[0014]3、制備全蝎樣品DNA模板。
[0015]I)將樣品分為五份，每份取20_30mg進行液氮研磨或球磨儀破壁；
2)步驟I)樣品加入200μ I緩沖液GA，振蕩至徹底懸??；
3)步驟2)的產物中加入20μ I蛋白酶，56°C水浴2-3小時；
4)步驟3)產物中加入200μ I緩沖液GB，70°C水浴10分鐘；
5)步驟4)產物中加入200μ I無水乙醇，充分振蕩；
6)將步驟5)中所得的全部溶液及絮狀沉淀均轉移至吸附柱GB3中，12000rpm離心30
秒；
7)步驟6)產物中加入500μ I緩沖液GD, 12000rpm離心30秒，棄廢液；
8)步驟7)產物中加入700μ I漂洗液Pff, 12000rpm離心30秒，棄廢液；
9)重復步驟8)；
10)12000rpm離心30秒，棄廢液，室溫放置15分鐘；
11)將步驟10)所得產物轉移至干凈離心管中，懸空滴加50-200μ I洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5分鐘，12000rpm離心2分`鐘。
[0016]4、將3中所得產物以6X比例加入染色劑，Loading Buffer緩沖液,測試樣品的OD值，以確認樣品DNA模板的純度。
[0017]5、制備PCR反應體系(25 μ I)
1)PCR反應體系為 25 μ I，其中全蝎 DNA 模板 2 μ 1，2 X Taq PCR Master Mix 12.5μ I,HCO I 和 LCO I 引物分別 I μ I, ddH20 8.5 μ I ；
2)以封口膜封蓋體系；
3)PCR反應條件為:94°C預變性5分鐘，94°C變性I分鐘，45°C退火1.5分鐘，72°C延伸
1.5分鐘，5個循環(huán)；94°C變性I分鐘，50°C退火1.5分鐘，72°C延伸I分鐘，35個循環(huán)；72°C再延伸5分鐘，4°C保存；
本實施例所用引物為:HC0 I引物為TGA TTT TTT GGT CAC CCT GAA GTT TA LCO I 引物為 CCA ATA TCT TTA TGA TTT GTT GAC C。
[0018]所用儀器為Applied Biosystems 公司的 2720 Thermal Cyler0
[0019]6、瓊脂糖凝膠電泳檢測
1)以瓊脂糖制備凝膠，并加入染色劑溴化乙錠(EB,ethidium bromide)；
2)將DNAMarker參照染色劑100 bp DNA Ladder Marker和步驟5中得到的全蝎樣品DNA全部點樣于瓊脂糖凝膠；
3)以120V電壓電泳45分鐘；
4)得到特異性的單一明亮條帶。
[0020]7、測序
8、將測序反饋的五條序列經CodenCode Aligner軟件拼接在一起，得到樣品序列如
下:
Itttggggttt gagcttctat ggtggggacg gccttgagtt tgttgattcg aggggagat
61 ggaatgcctg gggctttgat gggggatgat caggtttata atgttgtggt gactgctcat
121 gcttttgtga tgattttctt tatggtaata cctattataa ttggtggatt tgggaattga
【權利要求】
1.一種在分子生物學領域快速鑒別全蝎藥材(東亞鉗蝎)的方法，其特征在于，包含步驟如下: .1)采用標準的苯酚-氯仿法或者動物DNA抽提試劑盒提取待鑒別全蝎個體的總DNA； .2)利用DNA條形碼引物一一段線粒體基因COI序列標記并進行PCR擴增； .3)取適量的步驟2)所得的PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳進行，并以溴化乙錠(EB，ethidium bromide)染色后置于紫外燈下觀察，以 100 bp DNA Ladder Marker 為 DNAMarker做參照,得到特異性的單一明亮條帶,送生物公司測序； .4)對步驟3)中測序公司測得的序列進行拼接并去除低質量區(qū)域，與全蝎藥材(東亞鉗蝎)變異位點表進行比對，若樣品的變異位點在變異位點表內可以全部找到，則確定樣品為東亞鉗蝎。
2.根據(jù)權利要求1所述的快速鑒別方法，其特征在于: .1)在取材過程中，避免真菌等的污染，因而舍去全蝎的腹部，僅從其頭部、胸部、腿部及尾部取材，并需經過75%乙醇消毒； .2)所采用的儀器為DNA樣品粉碎研磨儀(Retsch，MM400,Germany),水浴鍋(上海申光，雙列四孔，中國)，梯度 PCR 擴增儀(Eppendorf, Mastercycler gradient, Germany),離心機(Thermo, LEGEND MICRO 21，America),移液器(Thermo, Scientific FinnpipetteFl, America),電泳儀(BIO-RAD, Power pac 300, Ameri ca),紫外凝膠成像儀(Syngene, England)； 3)所采用的試劑為血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(Tian-genBiotechC0., China),2XTaq PCR Master Mix(Tian-gen Biotech C0., China),100 bp DNA LadderMarker (Tian-gen Biotech C0.，China),溴化乙,定(EB, ethidium bromide)?
3.根據(jù)權利要求1所述的快速鑒別方法，其特征在于，所述步驟2)的PCR反應體系為25 μ 1，其中待鑒定全蝎DNA模板2 μ 1，2XTaq PCR Master Mix 12.5 μ I,HCO I 和LCO I 引物分另Ij I μ l，ddH20 8.5μ I ;以封口膜封蓋體系；PCR反應條件為:94°C預變性5分鐘，94°C變性1分鐘，45°C退火1.5分鐘，72°C延伸1.5分鐘，5個循環(huán)；94°C變性I分鐘，50°C退火1.5分鐘，72°C延伸I分鐘，35個循環(huán)；72°C再延伸5分鐘；測序反應；所用儀器為AppliedBiosystems 公司的 ABI 3730XL 測序儀；HCO I 引物為 TGA TTT TTT GGT CAC CCT GAA GTTTA, LCO I 引物為 CCA ATA TCT TTA TGA TTT GTT GAC C。
4.一種全蝎鑒別體系建立方法，其特征在于， .1)將采自山東臨沂、山東濟南、山西忻州、山西大同、河北保定、河南洛陽、陜西西安、湖北十堰八個產地共計600份蝎類樣品，經鑒定學鑒定確為東亞鉗蝎樣品后，分別經過權利要求I中步驟I) -3)所述擴增并獲取擴增后序列，獲得600份東亞鉗蝎序列； .2)在NCBI中搜索并下載現(xiàn)有的全部東亞鉗蝎序列(KC141981.1-KC142024.1,JF700145.1-JF700146.1, DQ340065.1, NC009738.1)； .3)合并步驟I)和2)的全部序列，在CodenCodeAligner批量合并并修飾序列，使各序列長度均為575bp，記錄所有的變異位點，并建立本地blast數(shù)據(jù)庫； .4)將步驟3)得到的全部變異位點制成全蝎藥材(東亞鉗蝎)序列變異位點表。
5.一種全蝎鑒別試劑盒，其特征在于，包括消毒用75%乙醇，血液/細胞/組織基因組 DNA 提取試劑盒(Tian-gen Biotech C0., China), 2 X Taq PCR Master Mix (Tian-genBiotech C0.，China)，100 bp DNA Ladder MarkerCTian-gen Biotech C0.，China)，HCO I弓丨物，LCO I引物，ddH20，全蝎藥材(東亞鉗蝎)序列變異位點列表；其中HCO I引物序列為為 TGA TTT TTT GGT CAC CCT GAA GTT TA，,LCO I 引物序列為 CCA ATA TCT TTA TGA TTTGTT GAC C ;全蝎藥材(東亞鉗蝎)序列變異位點列表為:
6.一種全蝎鑒別系統(tǒng)，其特征在于，包括試劑、儀器和全蝎藥材(東亞鉗蝎)序列變異位點列表，其中試劑為權利要求5所述試劑盒中的試劑；儀器為DNA樣品粉碎研磨儀(Retsch，MM400，Germany)，水浴鍋(上海申光，雙列四孔，中國)，梯度PCR擴增儀(Eppendorf, Mastercycler gradient, Germany),離心機(Thermo, LEGEND MICRO21，America),移液器(Thermo, Scientific Finnpipette Fl, America),電泳儀(BIO-RAD, Power pac 300，America),紫外凝膠成像儀(Syngene, England);全蝎藥材(東亞鉗蝎)序列變異位點列表為:
【文檔編號】C12M1/34GK103451312SQ201310440284
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月25日 優(yōu)先權日:2013年9月25日
【發(fā)明者】張龍霏 申請人:張龍霏