提高植物轉化效率的多個轉化增強子序列的應用的制作方法

提高植物轉化效率的多個轉化增強子序列的應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及提高農桿菌(Agrobacterium)和根瘤菌(Rhizobium)介導的植物細胞轉化效率的方法和組合物，通過使用可操作地連接到包含T-DNA的重組構建體上的T-DNA邊界序列上的附加轉化增強子序列例如超驅動序列或者TSS序列可實現上述轉化效率提高。
【專利說明】提高植物轉化效率的多個轉化增強子序列的應用
[0001]本申請是申請日為2007年07月18日和發明名稱為“提高植物轉化效率的多個轉化增強子序列的應用”的200780034442.6號發明專利申請的分案申請。
[0002]發明背景
[0003]本申請要求獲得于2006年7月19日提交的美國臨時專利申請60/831，814的優先權，其公開通過引用全文結合到本文中。
[0004]1.發明領域
[0005]本發明主要涉及植物生物技術。更具體地說，本發明涉及提高細菌介導的植物轉化效率的方法和組合物。
[0006]2.相關技術描述
[0007]在天然的農桿菌(Agrobacterium)介導的植物細胞的轉化中，來自根瘤農桿菌(A.tumefaciens)的Ti質粒或者發根農桿菌(A.rhizogenes)的Ri質粒的一段DNA被轉移到植物細胞中(例如Gelvin，2003)。該被轉移的DNA (T-DNA)片段側翼是不完全的24bp正向重復序列，該重復序列可被農桿菌核酸內切酶VirD2識別，通過在每一重復序列的一條鏈上的特定位點上形成切口而產生單鏈的T鏈。引發單鏈的T鏈形成的重復序列稱為“右邊界”(RB)，而終止單鏈的T鏈形成的重復序列被稱為“左邊界”(LB)。形成切口后，VirD2蛋白粘附在所述鏈的5’端，并引導T鏈進入植物細胞，在其他農桿菌和植物編碼蛋白的幫助下T鏈被整合到植物基因組中。包含載體骨架序列在內的T-DNA區域的序列下游(從5’到3’方向)也可能被轉移(例如Kononov等，1997)。這有可能是由于在轉移到植物細胞之前農桿菌中至少一個邊界不能形成缺口所致。
[0008]通過比較多種農桿菌菌株的RB和LB序列，表明RB和LB享有共同的基序(Canaday等，1992)，這表明可能有其他元件參與RB加工效率的調節。鄰近RB的順式作用序列存在于許多農桿菌菌株中，包括根瘤農桿菌和發根農桿菌。這些序列對野生型侵入性而言是必需的(Veluthambi 等，1988 ；Shurvington 和 Reaml991 ；Toro 等，1989 ；Toro 等，1988 ；Hansen等，1992)。在根瘤農桿菌中該序列被Peralta等(1986)稱為“超驅動(overdrive) ”或者“T-DNA傳遞增強子”。在發根農桿菌中該序列被Hansen等(1992)稱為“T-DNA轉移激活序列(TSS) ”。超驅動(“0D”)序列起始被定義為直接存在于章魚堿Ti TL-DNA的RB重復序列之前的特定24bp基序(Peralta等，1986)。類似的序列存在于章魚堿Ti TR-DNA的RB重復序列之前，并且也存在于胭脂堿Ti RB和農桿堿Ri TL右邊界之前(Peralta等，1986、Shaw等，1984、Barker等，1983、Slighton等，1985)。進一步比較不同根瘤農桿菌顯示8bp的超驅動核心序列存在于所有右邊界序列之前，那些菌株包括胭脂堿菌株pTiT37、章魚堿菌株pTiA6和發根農桿菌pRiA4 (Peralta等，1986)。
[0009]章魚堿超驅動序列的存在增強農桿菌細胞中單鏈T-DNA的形成，促進T-DNA轉移到植物細胞中，并且對野生型侵入性是必需的(Peralta等，1986, Shurvinton和Reaml991)。當將pTiT37 (產生胭脂堿的Ti質粒)RB近端的順式作用序列放置在pTiT37的LB重復序列之前時，后者能夠產生高效的單鏈T-DNA，這表明類似超驅動的序列確實也存在于胭脂喊 Ti 質粒上(Culianez-Macia 和 Hepburn 1988, Peralta 等，1986),正如其在其他鑒定的(產生章魚堿的)Ti質粒中一樣。使異源的章魚堿超驅動序列整合到胭脂堿pTiT37RB之前，導致比僅包含一個合成pTiT37RB重復序列的親本菌株更大的侵入性(Peralta 等，1986)。
[0010]VirCl蛋白結合到超驅動序列并且被認為可促進VirD2產生切口(Toro等，1988，1989)，而VirC突變導致了在植物中侵入性減弱(Close等，1987)和加工的單鏈T-DNA序列產量減少。根瘤農桿菌的章魚堿和胭脂堿Ti質粒皆包含VirC并且可以與VirC突變反式互補以使減弱的侵入性恢復到野生型水平(Close等，1987)。
[0011]在發根農桿菌菌株8196、A4和2659中發現的TSS與根瘤農桿菌中的超驅動序列起著相似的作用。每一種發根農桿菌菌株具有不同但相關的序列(Hansen等，1992)。8bp的TSS核心序列在pRiA4重復5次、在pRi8196中重復6次而在pRi2659 (Genbank登錄號AJ271050)中重復17次(而不是Hansen等，1992中的16次)。除這些重復外pRiA4還具有保守的8bp超驅動核心序列。在pRiA4和pRi8196中更短的核心序列重復對于野生型侵入性而言是不足夠的(Hansen等，1992)。
[0012]Depicker等(美國專利公開2003/0140376和相應的國際公開W001/44482)描述了具有修改的T-DNA邊界以減少或者阻止載體骨架序列的轉移的重組構建體。Conner等(W0 05/121346)描述了 T-DNA邊界類似區域的序列的產生和應用，該區域包含來自植物的序列。Heim等(美國公開2003/0188345)描述了具有修飾的邊界區的載體用于農桿菌介導的植物轉化。Lassner等(美國公開2006/0041956)描述了對T-DNA邊界區域進行修飾以能夠鑒定不包含非T-DNA序列的轉基因事件。
[0013]雖然前述的研究增加了對現有技術的理解，但是仍需要的是一種方法來提高農桿菌介導的植物轉化效率。盡管與缺少這些序列的質粒相比，超驅動或者TSS序列的存在增加了野生型農桿菌的侵入性并且促進T-DNA轉移到植物細胞中，但是如何進一步提高轉化效率(包括通過使用超驅動或者TSS序列在內)仍是不清楚的。
`[0014]發明概述
[0015]一方面，本發明提供了增加細菌介導的植物轉化效率的方法，其包含如下步驟:a)將至少一個附加的轉化增強子序列引入到包含至少一個T-DNA邊界區域的植物轉化載體中；b)通過細菌介導的轉化用上述載體轉化植物細胞，其中所述細菌能夠對植物細胞進行轉化。該方法任選可包括從植物細胞再生轉基因植株。在一個實施方案中，所述附加的轉化增強子序列包含TGTWTGTK(SEQ ID NO:20)的共有核心序列。在其他實施方案中，所述附加的轉化增強子序列選自:SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO: 13，和與 SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO:9 或者 SEQ ID NO:13中的任意一個互補的序列。在具體的實施方案中，本發明提供了包含SEQ ID NO: 14,SEQID NO:15或者SEQ ID NO:16的重組DNA構建體。
[0016]本發明所用的轉化增強子序列可位于T-DNA邊界區或序列(例如右邊界(RB)序列)的近端，即在側翼序列例如載體序列和邊界序列之間。轉化增強子序列可來自根瘤農桿菌的Ti質粒例如胭脂堿或章魚堿質粒，或者可來自發根農桿菌的Ri質粒。在某些實施方案中，細菌介導的轉化可利用選自農桿菌介導的轉化、根瘤菌(Rhizobium)介導的轉化和中華根瘤菌(Sinorhizobium)、中間根瘤菌(Mesorhizobium)或者慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)介導的轉化的技術來實現。在某些實施方案中，轉化增強子序列可包含SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:1U SEQ ID NO:17 或者 SEQ ID NO:180 在進一步的實施方案中，T-DAN邊界區可能包含1-約18個拷貝的轉化增強子序列，包括從約2或約4到約18個拷貝的轉化增強子序列。
[0017]本發明的植物細胞可以是任何植物細胞。在某些實施方案中，所述植物細胞來自選自以下的植物:大豆、玉米、棉花、油菜、水稻、小麥、苜蓿、菜豆、花生、煙草、向日葵、大麥、甜菜、青花椰菜、甘藍、胡蘿卜、花椰菜、芹菜、大白菜、黃瓜、茄子、韭蔥、萵苣、甜瓜、燕麥、洋蔥、豌豆、胡椒、花生、馬鈴薯、西葫蘆、蘿卜、高粱、菠菜、南瓜、糖蘿卜、西紅柿和西瓜。在具體的實施方案中，所述植物細胞是玉米細胞或大豆細胞。
[0018]在另一方面，本發明提供重組DNA構建體，其包含可操作地連接到轉化增強子序列上的Ti或Ri質粒T-DNA邊界序列，所述轉化增強子序列包含選自以下序列的兩個或更多個拷貝:SEQ ID NO:6,SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:13、與 SEQID NO:6,SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9 或 SEQ ID NO: 13 中的任意一個互補的序列及它們的組合。在具體的實施方案中，本發明提供了包含SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的重組DNA構建體。
[0019]在這樣的構建體中，增強子序列可包含該序列的至少約四個拷貝。邊界序列可為右邊界(RB)或者左邊界(LB)序列。在某些實施方案中，所述構建體可包含SEQ ID N0:10和/或SEQ ID NO=Il0 RB序列可來自胭脂堿Ti質粒或者農桿堿、甘露堿、琥珀堿、黃瓜堿或者章魚堿Ti或Ri質粒并且可包含SEQ ID NO:12。
[0020]在另一個方面，本發明提供了用本文所提供構建體轉化的細胞。該細胞可能是植物或者細菌細胞，包括農桿菌細胞或者根瘤菌細胞。在一個實施方案中，所述植物細胞來自選自以下的植物:大豆、玉米、棉花、油菜、水稻、大麥、苜蓿、菜豆、花生、煙草和向日葵。本發明還提供了由本發明的構建體轉化的轉基因植株。在具體的實施方案中，所述轉基因植株可選自:大豆、玉米、棉花、油菜、水稻、大麥、苜蓿、菜豆、花生、煙草和向日葵。
[0021]特別地，本發明涉及以下各項:
[0022]1.提高細菌介導的植物轉化效率的方法，其包括如下步驟:
[0023]a)將至少一個附加的轉化增強子序列引入到包含至少一個T-DNA邊界區的植物轉化載體中，所述T-DNA邊界區包含轉化增強序列；和
[0024]b)通過細菌介導的轉化用所述載體轉化植物細胞，其中所述細菌能夠轉化植物細胞。
[0025]2.第I項的方法，其中附加的轉化增強子序列包含SEQ IDNO:20的共有核心序列。
[0026]3.第2項的方法，其中所述附加的轉化增強子序列包含選自以下的序列:SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13、和與 SEQ ID NO:6、SEQID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO:9 或 SEQ ID NO: 13 中的任一個互補的序列。
[0027]4.第I項的方法，其中所述轉化增強子序列位于T-DNA右邊界(RB)序列的近端。
[0028]5.第4項的方法,其中所述轉化增強子序列來自根瘤農桿菌(A.tumefaciens)的胭脂堿或章魚堿Ti質粒。
[0029]6.第4項的方法,其中所述轉化增強子序列來自發根農桿菌(A.rhizogenes)的Ri質粒。
[0030]7.第I項的方法，其中所述細菌介導的轉化是農桿菌介導的轉化。[0031]8.第I項的方法，其中所述細菌介導的轉化是根瘤菌介導的轉化。
[0032]9.第8項的方法,其中所述根瘤菌介導的轉化是農桿菌(Agrobacterium)、根瘤菌(Rhizobium)、中華根瘤菌(Sinorhizobium)、中間根瘤菌(Mesorhizobium)或慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)介導的轉化。
[0033]10.第I項的方法，其中所述植物細胞來自選自以下的植物:大豆、玉米、棉花、油菜、水稻、小麥、苜蓿、菜豆、花生、煙草、向日葵、大麥、甜菜、青花椰菜、甘藍、胡蘿卜、花椰菜、芹菜、大白菜、黃瓜、茄子、韭蔥、萵苣、甜瓜、燕麥、洋蔥、豌豆、胡椒、花生、馬鈴薯、西葫蘆、蘿卜、高粱、菠菜、南瓜、糖蘿卜、西紅柿和西瓜。
[0034]11.第I項的方法，其中所述轉化增強子序列包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、或與SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO:11互補的序列。
[0035]12.第I項的方法，其中所述植物細胞是玉米或者大豆細胞。
[0036]13.第I項的方法，其中所述T-DNA邊界區域包含1-約18個拷貝的所述轉化增強子序列。
[0037]14.第I項的方法，進一步包含以下步驟:
[0038]c)從所述植物細胞再生轉基因植株。
[0039]15.包含T-DNA邊界序列的重組DNA構建體，所述邊界序列可操作地連接到轉化增強子序列，后者包含選自以下序列的兩個或更多個拷貝:SEQ ID N0:6、SEQ ID NO:7、SEQID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13、與 SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9和SEQ ID NO:13中的任一個互補的序列、及它們的組合。
[0040]16.第15項的構建體，其中所述增強子序列包含所述序列的至少約四個拷貝。
[0041]17.第15項的構建體，其中所述邊界序列是右邊界(RB)序列。
[0042]18.第15項的構建體，其中所述邊界序列是左邊界(LB)序列。
[0043]19.第15項的構建體，其中所述構建體包含SEQ ID NO:10。
[0044]20.第15項的構建體，其中所述構建體包含SEQ ID NO:11。
[0045]21.第17項的構建體，其中所述RB序列來自胭脂堿Ti質粒。
[0046]22.第17項的構建體，其中所述RB序列來自章魚堿Ti質粒。
[0047]23.用第15項的構建體轉化的轉基因細胞。
[0048]24.第23項的細胞，限定為植物或者細菌細胞。
[0049]25.第24項的細胞，其中所述細胞是農桿菌細胞。
[0050]26.第24項的細胞，其中所述細胞是根瘤菌細胞。
[0051]27.第24項的細胞，其中植物細胞來自選自以下的植物:
[0052]大豆、玉米、棉花、油菜、水稻、小麥、苜猜、菜豆、花生、煙草、向日葵、大麥、甜菜、青花椰菜、甘藍、胡蘿卜、花椰菜、芹菜、大白菜、黃瓜、茄子、韭蔥、萵苣、甜瓜、燕麥、洋蔥、豌豆、胡椒、花生、馬鈴薯、西葫蘆、蘿卜、高粱、菠菜、南瓜、糖蘿卜、西紅柿和西瓜。
[0053]28.用第15項的構建體轉化的轉基因植株。
[0054]29.第28項的轉基因植株,限定為選自:大豆、玉米、棉花、油菜、水稻、小麥、苜猜、菜豆、花生、煙草、向日葵、大麥、甜菜、青花椰菜、甘藍、胡蘿卜、花椰菜、芹菜、大白菜、黃瓜、茄子、韭蔥、萵苣、甜瓜、燕麥、洋蔥、豌豆、胡椒、花生、馬鈴薯、西葫蘆、蘿卜、高粱、菠菜、南瓜、糖蘿卜、西紅柿和西瓜。[0055]附圖簡述
[0056]后面的附圖是本說明的一部分，其被包括以進一步說明本發明的某些方面。通過參考這些圖并結合本文提出的具體實施方案的詳細描述可以更好地理解本發明。
[0057]圖1:用以提高轉化效率的不同轉化增強子序列的略圖。
[0058]圖2:pM0N87464 的簡圖。
[0059]圖3:pM0N87465 的簡圖。
[0060]圖4:改造的RB序列；超驅動序列用黑體標出，而24bpRB核心序列用下劃線標出。(A)胭脂堿RB序列+Ix超驅動序列(SEQ ID NO:14) ； (B)胭脂堿RB序列+4x超驅動序列(SEQ ID NO:15) ； (C)胭脂堿 RB 序列 +18x TSS 序列(SEQ ID NO:16)。
[0061]序列表描述
[0062]SEQ ID N0:1用以制備2X OD序列的正向引物Xd463。
[0063]SEQ ID N0:2用以制備2X OD序列的反向引物Xd464。
[0064]SEQ ID N0:3用以制備6X TSS序列的正向引物Xd465。
[0065]SEQ ID N0:4用以制備6X TSS序列的反向引物Xd466。
[0066]SEQ ID NO:5pTiA6 的 24bp 核心 OD 序列。
[0067]SEQ ID NO:68bplx TSS 序列。
[0068]SEQ ID NO:7pTiA6 的 30bplx OD 序列；SEQ ID NO:17 的反向互補序列。
[0069]SEQ ID NO:8 來自 pTiAB3 的 IX OD 序列。
[0070]SEQ ID NO:9 來自 pTi 15955 的 IX OD 序列。
[0071]SEQ ID NO:104X 疊加 OD 序列。
[0072]SEQ ID NO:1118X 疊加 TSS。
[0073]SEQ ID NO:12具有IX OD序列的邊界區。
[0074]SEQ ID NO:13 部分 OD 序列。 [0075]SEQ ID NO:14 具有 IX OD 的胭脂堿 RB 區。
[0076]SEQ ID NO:15 具有 4X OD 的胭脂堿 RB 區。
[0077]SEQ ID NO:16 具有 18X TSS 的胭脂堿 RB 區。
[0078]SEQ ID NO: 17IX OD:SEQ ID NO:7 的反向互補序列。
[0079]SEQ ID NO:184X 疊加 OD ；SEQ ID NO:10 的反向互補序列。
[0080]SEQ ID NO:19 共有的 OD 序列(Toro 等，1988)。
[0081]SEQ ID NO:20 共有的 8bp 核心 OD 序列。
[0082]發明詳述
[0083]以下是本發明的詳細描述，供以幫助本領域技術人員實踐本發明。在不脫離本發明的精神和范圍下本領域一般技術人員可對本文中描述的實施方案做出修改和變更。
[0084]本發明提供用于提高農桿菌介導的植物細胞轉化效率的方法和組合物。對發根農桿菌K599 (一種大豆超侵入性菌株)的20kb T-DNA區的測序，從而認識到發根農桿菌K599中的PRi質粒等同于發根農桿菌NCPBB2659菌株。因此K599菌株的超級侵入性可能與存在于RB附近的TSS序列的數目相關。因此，在雙元載體中對多個超驅動和TSS重復的疊加(stacking)與胭脂堿RB (例如來自pTiT37)進行測試，以提高轉化效率。來自pTiA6以4拷貝存在的章魚堿Ti質粒的30bp超驅動序列(Shurvinton和Reaml991)和以18拷貝存在的發根農桿菌NCPBB2659的TSS8bp核心序列，被用以提高T-DNA傳遞效率。
[0085]對包含不同數目超驅動或者TSS序列的構建體效用進行比較的轉化研究表明，通過提聞轉化頻率和提聞所廣生的轉基因事件的質量，這些序列附加的“置加”拷貝的存在提高了轉化效率。例如，具有單拷貝插入并且還缺少載體骨架序列(例如oriV)的轉基因事件的比例增加。通過減少為進一步商業開發而進行的選擇事件所需來源的數量，增加轉化頻率和優質事件(qualityevent),使轉化過程整體效率得以提高。
[0086]因此本發明提供了改進方法，用于獲得可育的轉基因植株，以及用于轉化植物細胞或組織和使經轉化的細胞或組織再生成為可育的轉基因植株。為了起始本發明所述的轉化過程，首先要選擇需要插入到植物細胞或者組織中的遺傳組分。遺傳組分可以包括任何通過本發明方法引入到植物細胞或者組織中的核酸。遺傳組分可以包括非植物DNA、植物DNA或者合成DNA。
[0087]在本發明的某些實施方案中，遺傳組分被并入到例如重組體、雙鏈質粒或者載體分子的DNA組合物中，所述DNA組合物包括遺傳組分例如:(a)在植物細胞中起產生RNA序列作用的啟動子，(b)產生編碼所需蛋白或多肽的RNA序列的結構DNA序列和(c)在植物細胞中起到使RNA序列3’端聚腺苷酸化作用的3’端非翻譯DNA序列。所述載體也可包含促進轉化和調節所要基因的表達的遺傳組分。
[0088]所述遺傳組分通常被定向以表達mRNA,該mRNA在一個實施方案中可以翻譯成蛋白。以雙鏈形式存在的植物結構編碼序列(基因、cDNA、合成DNA或者其他DNA)的表達包括:通過RNA聚合酶將一條DNA鏈轉錄成信使RNA (mRNA)以及接著在細胞核中加工mRNA初級轉錄物。這樣的加工包括mRNA3’端的聚腺苷酸化，涉及3’非翻譯區。
[0089]制備包含所需遺傳組分并可用于轉化植物的質粒或載體的一般方法、以及構建這些載體的方法為現有技術所已知。載體通常由許多遺傳組分組成，包括但不限于，調節元件例如啟動子、前導序列、內含子和終止序列。調節元件也稱為反式或順式調節元件，視與該元件與其所控制序列或者基因的接近程度而定。所述啟動子區包含一段堿基序列，轉導信號使RNA聚合酶與DNA締合并且以DNA鏈中的一條作為模板起始mRNA轉錄，形成相應的RNA互補鏈。
[0090]構建體還可包含在細菌細胞中提供復制功能和抗生素篩選的質粒骨架DNA區段，例如大腸桿菌復制起點如ori322、廣譜宿主性復制起點例如oriV或者oriRi和選擇標記的編碼區域例如Spec/Strp選擇標記基因(其編碼賦予壯觀霉素或鏈霉素耐受性的Tn7氨基糖苷腺苷酸轉移酶(aadA))或慶大霉素(Gm，Gent)選擇標記基因。對植物轉化而言，宿主細菌菌株常常是攜帶對于表達單元具有轉移功能的質粒的根瘤農桿菌AB1、C58、LBA4404、EHAlOl或者EHA105。植物轉化領域中技術人員所知的其他細菌菌株可以用于本發明，包括發根農桿菌、中華根瘤菌、中間根瘤菌、慢生根瘤菌和根瘤菌菌株。
[0091]在文獻中已經描述了許多在植物中具有活性的啟動子。這樣的啟動子包括但不限于，胭脂堿合成酶(NOS)啟動子和章魚堿合成酶(OCS)啟動子，它們攜帶在根瘤農桿菌的根瘤誘導質粒中；花椰菜花葉病毒啟動子例如花椰菜花葉病毒(CaMV) 19S和35S以及玄參花葉病毒(FMV)35S啟動子，加強的CaMV35S啟動子(e35S);以及來自核酮糖二磷酸羧化酶的小亞基(ssRUBISCO，一種非常豐富的植物多肽)的光誘導啟動子。所有這些啟動子已經被用于構建已在植物中表達的不同類型的DNA構建體。也可構建雜合啟動子以增加轉錄活性或者聯合所需的轉錄活性、可誘導性和組織或發育特異性。
[0092]因此，在植物中起作用的啟動子可為所描述的可誘導的、病毒性的、合成的、組成性的，時間調節的、空間調節的、和/或者時空調節的。組織增強的、組織特異的或者發育調節的其他啟動子也在現有技術中所知并且被考慮在本發明實踐中可用。可以從多種來源例如植物和植物DNA病毒中獲得有用的啟動子。優選所選的特定啟動子應該能夠造成充分表達，以產生有效數量的目標基因產物。
[0093]若有需要，在本發明DNA構建體(即嵌合/重組的植物基因)中所用的啟動子可以經過修改以影響其控制特性。可以通過與操縱區連接、進行隨機或受控誘變等方法獲得啟動子。此外，啟動子可經改造以包含多種“增強子序列”以協助促進基因表達。
[0094]由本發明的DNA構建體產生的mRNA也可包含5’非翻譯前導序列。該序列可以來自選以表達基因的啟動子并且也可經特定修飾以增加mRNA的翻譯。5’非翻譯區域也可以從病毒RNA、從合適的真核基因或者從合成的基因序列獲得。這樣的“增強子”序列可以合乎需要地增加或者改變產生的mRNA的翻譯效率并且常稱為翻譯增強子。其他用于增強表達或者影響基因轉錄或翻譯的遺傳組分也被考慮作為遺傳組分。嵌合構建體的3，非翻譯區域優選包含轉錄終止子、或具有等價功能的元件以及聚腺苷酸信號位點，其在植物中起聚腺苷酸化RNA的3’端的作用。合適的3’區的實例為(1)3’轉錄非翻譯區域，其包含農桿菌根瘤誘導(Ti)質粒基因例如胭脂堿合成酶(nos)基因的聚腺苷酸信號，和(2)植物基因例如大豆貯藏蛋白基因和核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)小亞基基因。優選的3’區的實例來自于豌豆的ssRUBISCO E9基因。
[0095]典型地，位于聚腺苷酸位點下游幾百個堿基對的DNA序列用作終止轉錄。這些DNA序列在本文中被稱為轉錄終止區。這些區域為轉錄信使RNA(mRNA)的有效聚腺苷酸化所需并且稱為3’非轉錄區。RNA聚合酶通過聚腺苷酸化發生的位點轉錄編碼DNA序列。
[0096]在許多轉化體系中，優選包含可選擇的、可篩選的或可選的(scoreable)標記基因的轉化載體。這些遺傳組分在本文`中也稱為功能性遺傳組分，因為其產生可用于鑒定轉化植株的產物或有所需效用的產物。
[0097]用作篩選工具的DNA可在再生植物組織中起作用，以產生可賦予植物組織對另外的毒性化合物耐受的化合物。可作為可選擇的、可篩選的或可選的標記使用的目標基因可以包括但不限于:葡萄糖醛酸酶(gus)、綠色熒光蛋白(gfp)、熒光素酶(lux)、抗生素例如卡那霉素(Dekeyser等，1989),給予對除草劑耐受的基因如對草甘膦(Della-Cioppa等，1987)，例如CP4EPSPS (美國專利5，627，061 ;美國專利5，633，435 ;美國專利6，040，497 ;美國專利 5，094，945 ；W004/074443 ；W004/009761);如對草胺膦的(美國專利 5，646，024，美國專利5，561，236，美國專利5，276，268 ;美國專利5，637，489 ;美國專利5，273，894);如對2,4-D (W005/107437)和麥草畏，例如DMO(美國專利7，022，896)耐受。也可實行其他篩選方法，包括但不限于對草丁膦、雙丙氨磷耐受和陽性篩選機制(Joersbo等，1998)并且也將落入本發明的范圍內。在Miki和McHugh (2004)中公開了各種可選擇的/可篩選的/可選的標記的實例和編碼它們的基因。
[0098]本發明可與任何合適的植物轉化質粒或載體一起使用，這些質粒或載體包含上述可選擇或可篩選標記和相關的調節元件、連同一種或多種以足以賦予個別所需特征的方式表達的核酸(目標結構基因)。本發明所考慮的合適目標結構基因的實例包括但不限于:昆蟲或者害蟲耐受性基因，除草劑耐受性基因，品質改良基因例如產量提高、營養加強、環境或者脅迫耐受性，或者在植物生理、生長、發育、形態或者植物產物上有任何想要的改變的基因。
[0099]備選地，上述DNA編碼序列可以通過編碼非翻譯RNA分子來影響這些表型，這些非翻譯RNA分子例如通過包括反義介導和共抑制介導的機制在內的雙鏈RNA介導機制(參見例如Bird等，1991)，造成內源基因表達受到靶向性抑制。所述RNA還可以是一種被加工以切割所需內源mRNA產物的催化性RNA分子(即核酶)(參見例如Gibson和Shillitoe，1997)。更具體地說，關于反義調節植物細胞中基因表達的詳述參見美國專利第5，107，065號，而關于通過轉錄dsRNA實現植物中基因阻抑的詳述參見美國專利第6，506，559號、美國專利申請公開第2002/0168707號Al和美國專利申請系列第09/423，143 (參見W098/53083) ,09/127, 735 (參見 W099/53050)和 09/084，942 號(參見 W099/61631)，以上所有通過引用全文結合到本文中。
[0100]還考慮造成其他內源基因沉默(例如包括miRNA的RNAi技術)以獲得一種表型的序列的使用。例如RNAi可用于沉默一種或多種引起可選表型的基因。一個實施方案是組裝轉錄反向重復序列的DNA盒，以產生雙鏈RNA (dsRNA)，該雙鏈RNA通常至少長約19_21bp并且與一個或者多個待靶向沉默基因的一部分對應。因此任何產生表達感興趣的表型或者形態變化的蛋白或mRNA的基因對本發明的實踐都是有用的。
[0101]可通過本發明所包含的方法引入的例示性核酸包括:例如外源DNA序列(即來自另一個種的序列或者基因)，或者甚至是起源于或者存在于相同種中但通過遺傳工程方法而非傳統的繁殖或者育種技術并入到受體細胞中的基因或者序列。然而術語外源的也意指通常在待轉化細胞中不存在的基因；或指不以如在轉化DNA區段中發現的形式或者結構等存在的基因；或指正常存在但希望有不同的表達的基因。因此，術語“外源的”基因或者DNA意指引入到受體細胞中的任何基因或者DNA區段，而無論是否可能已有類似的基因存在于這樣的細胞中。包括在外源的DNA中的DNA類型可以包括已經存在在植物細胞中的DNA、另一種植物中的DNA、不同的生物體`的DNA或外部產生的DNA，例如包含基因反義信息的DNA序列、或基因或者序列的合成或修飾型的DNA編碼序列。
[0102]根據本公開，很多其他可能的可選擇的或可篩選的標記基因、調控元件和其他目標序列對本領域的技術人員將是顯而易見的。因此，前述討論旨在是示范的而并非無遺漏的。
[0103]構建植物轉化載體或構建體之后，通常使在體外制成DNA組合物的核酸分子引入合適的宿主例如大腸桿菌中并配入另一個合適的宿主例如農桿菌或者根瘤菌；或直接轉化到感受態農桿菌或者根瘤菌中。這些技術為本領域技術人員所熟知并且已經對許多植物體系作出描述，包括大豆、棉花和小麥(參見例如美國專利第5，569，834和5，159，135號以及W097/48814)。本領域技術人員將認識到農桿菌介導的轉化方法的效用。菌株可包括但不限于:根瘤農桿菌菌株C58的卸甲衍生物、用以介導DNA轉移入植物細胞的胭脂堿菌株；章魚堿菌株例如LBA4404 ;或農桿堿菌株例如EHAlOl、EHA105或具有Ti或Ri質粒的豌豆根瘤菌(R.leguminosarum)USDA2370。已經報道了這些菌株在植物轉化上的用途而且本領域技術人員熟悉這些方法。
[0104]通常用包含重組構建體的根瘤農桿菌或發根農桿菌接種待轉化的植物組織，使兩者共培養，并在適合的條件下進行篩選，所述重組構建體包含至少一個外源超驅動或者TSS序列、待轉移的目標序列和至少一個用以限定待轉移DNA的RB序列。在某些實施方案中，還有至少一個LB序列存在于重組構建體中。在某些其他實施方案中，邊界序列可以是“植物來源類似邊界序列”。在Rommens等，2005、Rommens 2004a、Rommens等，2004b中描述了鑒定和使用這樣的序列的方法。
[0105]本發明可以與任何可轉化的細胞或者組織一起使用。本領域內技術人員認識到可轉化的植物組織通常指那些具有外源DNA插入到其基因組并在適合的培養條件下可以形成分化植株的組織。這些組織可以包括但是不限于細胞懸浮物、愈傷組織、下胚軸組織、子葉組織、胚、分生組織、根和葉。例如，可轉化的組織可包括:來自花藥愈傷或者胚狀體、小孢子、花序和葉組織。其他組織也被考慮在本發明的實踐中有效，并且對于特定植物品種需要特定的外植體這已為現有技術所知或者可以通過常規的篩選和測試實驗確定，由此在轉化過程使用了不同的外植體并且鑒定出了那些在產生轉基因植物中更成功的。
[0106]已經公開了對許多作物包括棉花、大豆、蕓苔(Brassica)和花生利用根瘤農桿菌或者發根農桿菌轉化雙子葉植物并獲得轉基因植株的方法。也已經報道了通過基于根瘤農桿菌或者發根農桿菌的方法實現對單子葉植物的成功轉化。至少在蘆筍、大麥、玉米、燕麥、水稻、甘蔗、葦狀羊茅和小麥中已經實現并報道了轉化和植物的再生。在美國專利第5，846.797,5, 159，135,5, 004，863和6，624，344號中公開了可以特別用于棉花轉化背景的技術。在例如美國專利5，750，871中公開了具體用于轉化蕓苔屬植物的技術。在例如Zhang等(1999)和美國專利6，384，301中公開了轉化大豆的技術；而在例如美國專利5，981，840、美國專利7，060，876、美國專利5，591，616、W095/06722和美國專利公開2004/244075中公開了轉化玉米的技術。
[0107]在一個實施方案中，在包含抑制農桿菌和根瘤菌生長的抗生素且沒有篩選劑的培養基(延遲培養基)上進行培養之后，使外植體在選擇生長培養基上培養，所述生長培養基包括但不限于包含植物細胞篩選劑的愈傷誘導培養基。已經描述了典型的篩選劑，其包括但不限于抗生素例如G418、巴龍霉素、卡那霉素或者其他化學物質例如草甘膦、麥草畏和草胺膦。接著將在篩選培養基上存活的植物組織培養物轉移到適于產生轉化植株的再生培養基上。再生可以通過幾個步驟執行。本領域技術人員知道可以使用的不同類型的培養基和轉移所需條件，并可根據每一種植物體系為植株轉化和再生來對它們進行優化。
[0108]接著分析產生的轉化株以確定是否存在包含在轉化載體上的特定的目標核酸。分子分析可以包括但不限于DNA印跡或者PCR(聚合酶鏈式反應)分析。可執行這些或者其他熟知的方法，以確認通過公開方法產生的轉化植株的穩定性、插入的拷貝數以及T-DNA側翼的載體骨架序列的存在情況。這些方法為本領域技術人員所熟知并且已被報導過(參見例如 Sambrook 等，1989)。
[0109]前述討論僅僅是對標準的轉化和再生實驗方案的粗略描述。本領域技術人員知道具體作物和具體方案可以與粗略描述稍微有所不同。每一種體系也可使用多種培養基。本領域的技術人員熟悉當適合地進行補充時支持植物組織生長和發育的組織培養培養基種類。這些組織培養培養基可以作為商業制劑而購得或者也可以由本領域的技術人員定制和修改。這樣的培養基的實例包括但不限于由Murashige和Skoog(1962)、Chu等(1975)、Linsmaier 和 Skoog (1965)、Uchimiya 和 Murashige (1962)、Gamborg 等(1968)、Duncan 等(1985)、McCown 和 Lloyd (1981)、Nitsch 和 Nitsch (1969)以及 Schenk 和Hildebrandt (1972)描述的培養基或者根據需要進行補充的這些培養基的衍生。本領域技術人員知道用于轉化和再生的培養基和培養基補充物(例如營養和生長調節劑)通常根據特定的目標作物或者感興趣的品種進行優化。試劑是市售的并且可從許多供應商處購得(參見例如 Sigma Chemical C0., St.Louis, M0.)
[0110]在許多Ti質粒中鑒定有“超驅動”序列，其中包括pTiA6、pTiAB3和ptil5955。例如使用Wis.53711,麥迪遜,威斯康辛大學生物技術中心,遺傳計算機組,序列分析軟件包的“BestFit”、“Gap” 或“FASTA” 程序，或者使用 “BLAST” 程序(Altschul 等，1990)，或者另一個可獲得的DNA序列分析包，可以鑒定出與超驅動或者TSS具有高度同源性的其他序列。當這樣的序列以多拷貝于RB序列附近存在時，可以測定其轉化提高活性，這與下文對增強子活性進行描述的序列相似。
[0111]本文中所用的“轉化的頻率”或者“轉化頻率”指所產生的轉基因事件/外植體的百分比或所產生轉基因植株/外植體的百分比。
[0112]“邊界序列”，例如右邊界(RB)或者左邊界(LB)，指限定轉移DNA (T-DNA)區域末端的直接重復核酸序列，通常約24bp長。邊界序列可來自農桿菌的Ti或者Ri質粒，或者可為功能相似的植物來源的序列。
[0113]"T-DNA邊界序列”指RB或者LB序列和相關的側翼序列，通常約IOObp長，并且如在自然中發現的，可以包括轉錄增強子序列。
[0114]本文中所用“轉化效率”，指任何改進，例如通過減少為進一步商業開發而進行的選擇事件所需來源的數量，實現影響轉化過程整體效率的轉化頻率和優質事件的增加。
[0115]本文所使用的“轉化增強子”指超驅動和TSS序列。
[0116]當第一核酸序列與第二核酸序列經過排列(arrange)致使前者影響后者功能時，則第一核酸序列與第二核酸序列“可操作連接”。優選兩個核酸序列是單個鄰接的核酸分子的一部分。超驅動或者TSS增強子序列可直接位于鄰近邊界序列例如RB序列。可供選擇地，在某些實施方案中，超驅動或者TSS序列位于邊界序列末端約1、10、25、50、100、250、500、1000或者更多核酸處，包括所有中間范圍。超驅動序列可位于相應于邊界的每一個方向。
實施例
[0117]本領域技術人員將理解本發明提供的方法和組合物的許多優點。下述實施例被包括在內以證明本發明的優選實施方案。本領域技術人員應當理解下述實施例中公開的技術代表
【發明者】發現的在本發明實踐中作用良好的技術，因此可以考慮為構成本發明實踐的優選模式。然而，根據本公開本領域技術人員應當理解，在不脫離本發明的精神和范圍下，在公開的具體實施方案中可以作出很多改變并仍獲得類似或者相似的結果。本文所引用的全部參考文獻到作為補充、解釋、提供背景或教導本文所用方法、技術或者組合物的程度下，通過參考合并到本文中。
[0118]實施例1
[0119]轉化增強子序列的合成
[0120]I) 4x超驅動序列的合成[0121]將2x30bp超驅動引物對5’ caaacaaacatacacagcgacttattcacacaaacaaacatacacagcgacttattcaca3’(Xd463 ；SEQ ID NO:1)和5’tgtgaataagtcgctgtgtatgtttgtttgtgtgaataagtcgctgtgtatgtttgtttg3’(Xd464 ;SEQ ID NO:2)合成、混合并且在Stratagene(La Jolla,CA)高保真PfuTurbo?.聚合酶存在下PCR擴增20個循環，以合成4x 30 bp超驅動(OD)序列(5，caaacaaacatacacagcgacttattcacacaaacaaacatacacagcgacttattcacacaaacaaacatacacagcgacttattcacacaaacaaacatacacagcgacttattcaca3> ；SEQID N0:18)o 在 1% 瓊月旨糖凝膠上PCR產物分成幾部分，將對應的大小范圍在100-300bp之間的凝膠部分切下、經純化并連接到Invitrogen (Carlsbad, CA)的TOPO Zero平端PCR載體上。通過測序確定重復疊加。盡管在隨后的多拷貝超驅動構建體的克隆中只用了 4x30bp超驅動插入，但是PCR后觀察到至多6x的超驅動序列，。 [0122]2)18x TSS序列的合成
[0123]將6x8bp TSS重復引物對:
[0124]5，ctgacgaactgacgaactgacgaactgacgaactgacgaactgacgaa3， (Xd465 ;SEQ ID NO:3)和5’ttcgtcagttcgtcagttcgtcagttcgtcagttcgtcagttcgtcagS’(Xd466 ；SEQ IDNO:4)合成、等份混合并且在Stratagene (La Jolla, CA)的Pfu Turbo?聚合酶存在下擴增5個循環。切下100_300bp大小的凝膠薄片、經純化并連接到Invitrogen的Τ0Ρ0 Zero平端PCR載體中。通過測序確認至多35x TSS重復，但只保留18x TSS重復作進一步克隆用。超驅動和TSS的大小取決于PCR循環和切下的凝膠位置。
[0125]實施例2
[0126]具有RB連同超驅動、附加的超驅動或18xTSS的的載體的構建
[0127]為了將超驅動或者TSS序列置于24bpRB之前,將EcoRI位點引入到胭脂堿RB中，其位于RB(pM0N83900的)上游Ilbp處。從被EcoRI消化的相應的Τ0Ρ0克隆載體上切下4x超驅動序列或者18xTSS序列，將其插入到被EcoRI切開的pM0N83900中，分別得到PM0N83903 和 pM0N83909。
[0128]用HindIII/Spel 消化 pM0N83903 或pM0N83909 的包含 4x 超驅動序列或者 18xTSS序列的經修飾的RB，用此包含4x超驅動或者18xTSS增強子序列的Hindlll/Spel區段置換PM0N83902的Ix超驅動RB序列，分別得到pM0N87462和pM0N83864用于大豆轉化。可供選擇的是，通過插入PM0N83903或pM0N83909的Spel/Sall片段，來對pM0N80105的RB進行修飾從而使4x超驅動或者18xTSS序列被包含，以分別獲得pM0N87465和pM0N87466用于玉米轉化。在圖1和4以及SEQ ID NO:14-16中展示了具有lx、4x和18x轉化增強子序列的經修飾的RB。
[0129]通過首先根據標準實驗方案組裝包含30bp超驅動序列的寡核苷酸，然后將其克隆到pBlueScript? II (Stratagene Inc., La Jolla, CA)來合成包含 Ix 超驅動序列(SEQID NO:17)的構建體，得到pM0N80088。接著將來自pM0N80088的SpeI和NotI (用聚合酶補平)片段插入到用SpeI和SmaI消化的pM0N80105中，得到pM0N80121用于棉花轉化。對于大豆轉化，通過利用Pmel/Ndel限制性內切酶位點用來自pM0N80121的Ix超驅動RB片段替代PM0N83898中的RB，得到Ix超驅動RB構建體pM0N83902。
[0130]實施例3
[0131]超驅動或者TSS增強型RB序列對玉米的轉化[0132]如在美國專利申請公開2004/244075所描述的，用包含oriV的載體pM0N80105、PM0N80121、pM0N87465或pM0N87466轉化玉米(Zea mays)細胞，以評價附加的超驅動和TSS增強子序列的疊加提高轉化頻率的能力，以及評價包含低拷貝數目T-DNA插入和缺少載體骨架序列的事件的比例(例如來自大腸桿菌的oriV)。對照處理包括用缺少超驅動或者TSS序列的pM0N80105的轉化。如表1所示，包含疊加的增強子序列的構建體的使用導致了轉化頻率在統計學上顯著增加。用這些構建體也獲得了更高百分比的優質TF(轉化頻率)。優質TF結合了 TF和具有一個或兩個拷貝的事件。同樣，具有一個或者兩個拷貝的事件百分比也增加了。
[0133]表1:轉化增強子序列對玉米中轉化頻率和事件質量的影響
【權利要求】
1.用包含T-DNA邊界序列的重組DNA構建體轉化的轉基因植物細胞，所述邊界序列可操作地連接到轉化增強子序列，后者包含選自以下序列的兩個或更多個拷貝:SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 13、與 SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:13中的任一個互補的序列、及它們的組合。
2.權利要求1的轉基因植物細胞，其中所述增強子序列包含所述序列的至少約四個拷貝。
3.權利要求1的轉基因植物細胞，其中所述邊界序列是右邊界(RB)序列。
4.權利要求1的轉基因植物細胞，其中所述邊界序列是左邊界(LB)序列。
5.權利要求1的轉基因植物細胞，其中所述構建體包含SEQID NO:10。
6.權利要求1的轉基因植物細胞，其中所述構建體包含SEQID NO:11。
7. 權利要求3的轉基因植物細胞，其中所述RB序列來自胭脂堿Ti質粒。
8.權利要求3的轉基因植物細胞，其中所述RB序列來自章魚堿Ti質粒。
9.權利要求1的轉基因植物細胞，其中植物細胞來自選自以下的植物:大豆、玉米、棉花、油菜、水稻、小麥、苜蓿、菜豆、花生、煙草、向日葵、大麥、甜菜、青花椰菜、甘藍、胡蘿卜、花椰菜、芹菜、大白菜、黃瓜、茄子、韭蔥、萵苣、甜瓜、燕麥、洋蔥、豌豆、胡椒、花生、馬鈴薯、西葫蘆、蘿卜、高粱、菠菜、南瓜、糖蘿卜、西紅柿和西瓜。
10.用包含T-DNA邊界序列的重組DNA構建體轉化的轉基因植株的細胞，所述邊界序列可操作地連接到轉化增強子序列，后者包含選自以下序列的兩個或更多個拷貝:SEQ IDNO:7, SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13、與 SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9和SEQ ID NO:13中的任一個互補的序列、及它們的組合。
11.權利要求10的轉基因植株的細胞，其中，所述的植株選自:大豆、玉米、棉花、油菜、水稻、小麥、苜蓿、菜豆、花生、煙草、向日葵、大麥、甜菜、青花椰菜、甘藍、胡蘿卜、花椰菜、芹菜、大白菜、黃瓜、茄子、韭蔥、萵苣、甜瓜、燕麥、洋蔥、豌豆、胡椒、花生、馬鈴薯、西葫蘆、蘿卜、高粱、菠菜、南瓜、糖蘿卜、西紅柿和西瓜。
【文檔編號】C12N5/10GK103484433SQ201310438280
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2007年7月18日 優先權日:2006年7月19日
【發明者】X·葉, L·吉爾伯森 申請人:孟山都技術有限公司