一株兼具抗病和促生效果的生防芽孢桿菌及其應用的制作方法
【專利摘要】一株兼具抗病和促生效果的生防芽孢桿菌及其應用，菌株為Bacillussp.RS-1，2013年01月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏編號為CGMCCNo.7170。將該生防芽孢桿菌用于土傳病害病原菌如煙草赤星病菌、黃瓜枯萎病菌、甜瓜枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、油菜菌核菌、石斛黑腐病菌和石斛枯萎病菌的抑制。還可將該生防芽孢桿菌在土壤植物根際和烤煙葉面有效定殖。本發明的生防芽孢桿菌RS-1不僅對多種土傳病害病原菌具有較好的拮抗效果，而且還能在根際和葉面有效定殖。
【專利說明】一株兼具抗病和促生效果的生防芽孢桿菌及其應用【技術領域】[0001]本發明涉及一株兼具抗病和促生效果的生防芽孢桿菌及其應用，屬農業生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]近年來，隨著農藥、化肥的大量施用及土地的高復種指數，連作障礙和土傳病害的爆發等諸多問題對土壤的可持續供給、農產品的產量、質量和安全性造成了威脅。目前，我國存在連作現象的植物種類多且廣，糧食作物、經濟作物、蔬菜、林木及園藝作物都存在不同程度的連作障礙和“茬口”問題。有關連作障礙機理的研究雖已取得很大進展，但是結論不一。歸納起來主要有:(I)土壤理化性質惡化。由于同一作物對土壤單一養分的消耗，造成土壤養分供應比例失調，土壤理化性狀惡化，土壤酶活性變化。有研究發現，連作可使土壤中磷酸酶和脲酶活性降低，脲酶與磷酸酶活性的降低導致尿素水解反應及有機磷化合物分解反應減弱，為作物提供有效氮、磷養分減少。(2)植物化感自毒作用。即由根系分泌物和殘茬分解物等引起的自毒作用。(3) 土壤微生物區系的變化。連作擾亂了土壤微生態平衡，有益微生物種類和數量的減少，如農藥的使用會抑制土壤中的固氮微生物、根瘤菌以及有機質降解菌等的生長繁殖，引起微生物選擇性富集，細菌總體數量減少，真菌總體數量顯著上升，特別是病原菌數量急劇增大，土壤微生物由細菌主導型轉為真菌主導型，病原菌更容易侵染植物并引發植物各種病害。上述三大因素均與土壤存在密切關系，土壤內部的變化又是一個復雜而緊密相聯系的過程，土壤微生物在此過程中扮演著重要的角色，解決連作障礙和土傳病害問題的關鍵就是維持土壤中病原菌和有益生物的平衡。目前針對連作障礙和土傳病害問題，向土壤中施入可拮抗并控制土壤有害病原菌，維持土壤微生態平衡，促進作物生長的植物根系促生菌是一種綠色、可行、有效的手段和途徑。
【發明內容】
[0003]本發明的目的是針對目前化學肥料和農藥的大量施用從而導致土壤微生態失衡、 土傳病害爆發等問題，從自然環境中篩選出一株能在根際和葉際有效定殖并兼具防治多種土傳病害病原菌和促生作用的生防芽孢桿菌。本發明還提供這種生防芽孢桿菌的應用。[0004]本發明的目的通過如下技術方案實現:一株兼具抗病和促生效果的生防芽孢桿菌，菌株為feci77心sp.RS-1，2013年01 月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏編號為CGMCC N0.7170。[0005]本發明所述生防芽孢桿菌菌株sp.RS-1是從云南本土栽培的烤煙葉表分離所得。所述生防芽孢桿菌RS-1在LB培養基上培養24h后的菌落特征為乳白色，邊緣不規則，表面干燥，革蘭氏染色陽性，產芽孢，芽孢橢圓形，中生，不膨大；所述LB培養基為蛋白胨 10g、酵母粉 5g、NaCl 10g、瓊脂 18g、H2OlOOOmL, pH 7.0o[0006]本發明所述的一株兼具抗病和促生效果的生防芽孢桿菌的應用，可用于土傳病害病原菌如煙草赤星病菌al terna ta (Fries) Λ?9Υ.5576?τ)、黃瓜枯萎病菌 iFusarium oxy sporum f.sp.cucumerinum ) > Stflif iFusarium oxysporum (Schl.)f.sp.me I on is (Leach et Curr enee) Snyder et Hansen ) > 西瓜 ?古萎病 1^iFusarium oxysporum Schlechtendahl ex Fries f.sp.nweum CE.F.Smith) Snyder et Hansen)> 油菜菌核菌(sclerotiorum (Lib.) de ife/y)、石斛黑腐病菌 palmivora取Pythium w7ii皿》)和石斛枯萎病菌的抑制。還可在土壤植物根際和烤煙葉面有效定殖。可采用在烤煙葉面噴施方式防治煙草白粉病。還可采用灌根方式促生烤煙和油麥菜。[0007] 與現有技術相比，本發明的積極效果是:1、本發明的生防芽孢桿菌RS-1不僅對多種土傳病害病原菌具有較好的拮抗效果，而且還能在根際和葉面有效定殖；2、本發明的生防芽孢桿菌RS-1通過灌根方式對烤煙和油麥菜具有明顯的促生效果；3、本發明的生防芽孢桿菌RS-1通過葉面噴施方式對白粉病的防治效果可達60.54%。【專利附圖】
【附圖說明】[0008]圖1A)是本發明生防芽孢桿菌RS-1的菌落圖；圖1B)是本發明生防芽孢桿菌RS-1的菌體特征圖；圖2是本發明生防芽孢桿菌RS-1的生長曲線圖；圖3A廣H)分別是菌株RS-1對黃瓜枯萎病菌ifusarium oxy sporum f.sp.cucumerinum)、舌甘瓜才古萎病菌 iFusarium oxysporum (Schl.) f.sp.me I on is (Leach et Currenee)Snyder et Hansen )>HfiFusarium oxysporum Schlechtendahl ex Fries f.sp.nweum (E.F.Smith) Snyder et Hansen)、土豆立才古病菌 solani煙草赤星病菌 047 temaria a I terna ta (Fries)石斛黑腐病菌{Phytophthora palmivora 熱 Pythium-口^'角斗_古,_胃oxysporum)平板拮抗效果圖。[0009]圖4是菌株RS-1在烤煙根際的定殖情況圖；圖5是菌株RS-1在烤煙葉表的定殖情況圖。【具體實施方式】[0010]在下面的實施例中， 申請人:研究了生防芽孢桿菌RS-1的菌落和菌體特征、生長曲線、對多種土傳病害病原菌的平板對峙效果、在烤煙根際和葉表的定殖效果、通過葉面噴施方式對煙草白粉病的防治效果及通過灌根方式對烤煙和油麥菜的促生效果，確定該生防芽孢桿菌RS-1的抗病和促生效果。[0011]以下是本發明的實施例，但本發明的內容并不局限于此。[0012]生防芽孢桿菌RS-1的分離篩選:本發明的一株兼具抗病和促生效果的生防芽孢桿菌sp.RS-1分離自云南本土栽培的烤煙葉表所得。該菌株已于2013年01 月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏編號為CGMCC N0.7170。本發明提供的生防芽孢桿菌菌株RS-1在LB培養基上培養24h后的菌落特征為乳白色，邊緣不規則，表面干燥，革蘭氏染色陽性，產芽孢，芽孢橢圓形，中生，不膨大；所述LB培養基為蛋白胨log、酵母粉5g、NaCl 10g、瓊脂18g、H2O 1000mL, pH 7.0。圖ΙΑ)、圖1B) 分別顯示了生防芽孢桿菌菌株Bacillus sp.RS-1的菌落和菌體特征，圖2顯示了生防芽孢桿菌菌株RS-1的生長曲線。[0013]將本發明的生防芽孢桿菌菌株RS-1在LB液體培養基(LB液體培養基為蛋白胨 10g、酵母粉 5g、NaCl 10g、H2O 1000mL, pH 7.0)、37°C、200rpm 條件下培養 8h，接種量為0.5%,分別在 0、l、2、3、4、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、36、42、48、54、72h 進行取樣， 然后測定OD6c?值。結果發現0-7h為遲滯期，8-20h為對數生長期，20-42h為穩定期，42_72h 為衰退期，在22h時95%以上的菌體均形成了芽孢，并且在24h時菌體數量達到6.77X IO8 cfu /mT,η[0014]本發明的生防芽孢桿菌RS-1對多種土傳病害病原菌的平板對峙效果如下:先將多種土傳病害病原菌在PDA平板(PDA平板為采用去皮土豆200g切塊100°C煮沸30min后過濾得到的濾液、蔗糖20g、瓊脂18g、H20 1000mL)上進行活化，然后用打孔器打孔同心圓瓊脂餅接種于新的PDA平板上，每種土傳病害病原菌共設3個重復，28°C培養箱倒置培養2-3d 直至病原菌直徑為2-3cm，然后在該PDA平板上接種活化后的菌株RS-1，28°C培養箱繼續倒置培養3-5d，然后觀察菌株RS-1對各種土傳病害病原菌的對峙效果，室內平板對峙試驗顯示,菌株RS-1對多種土傳病害病原菌如煙草赤星病菌al terna ta (Fries) Keissler)、黃瓜枯萎病菌 Q7Usarium oxy sporum f.sp.cucumerinum)、舌甘瓜枯萎病菌 (Fusarium oxysporum (Schl.) f.sp.me1nis (Leach et Currenee)Snyder et Hansen )、西瓜?古萎病菌應 oxysporum Schlech tendahl ex Fries f.sp.nweum (E.F.Smith) Snyder et Hansen)、油菜菌核菌sclerotiorum (Lib.) de Bary)> 石斛黑腐病菌palmi vora 取 Pythium和石斛枯萎病菌 oxysporum)等均具有較好的抑制效果。[0015]本發明生防芽孢桿菌RS-1在烤煙根際的定殖效果如下:將活化后的生防芽孢桿菌RS-1接種至液體LB培養基中37°C、200rpm培養24h，5000rpm離心lOmin，沉淀用同體積的0.9%生理鹽水重懸，測定菌體濃度后待用(測定結果為重懸液的菌體濃度為2.93X 108cfu/mL)o本試驗所用土壤為紅壤摻混10%有機肥(有機肥由云南瑞升埃比特生物科技有限公司提供，總養分為6.0%)。本試驗共24盆，其中菌液處理12盆，空白對照12 盆，每盆土重 1.0kg,基肥分別按 N 0.15 g/kg 土、P2O5 0.15 g/kg 土、K2O 0.15 g/kg 土施入。選擇長勢、葉數基本一致的烤煙煙苗進行移栽，每盆移栽一棵煙苗，煙苗移栽后第2d，菌液處理灌入每盆IOmL重懸后菌液，空白處理灌入IOmL無菌水，在整個試驗階段每天定量澆水管理。然后分別于灌根后0d、10d、20d、30d分別采集菌液處理和空白處理的3盆煙苗的根際土樣進行測定土壤中芽孢桿菌的數量，根據菌株RS-1的菌落形態特征及空白對照中的芽孢桿菌數量，最終確定菌液處理中的菌株RS-1在烤煙根際的定殖情況。結果顯示，在 30d內，菌液處理的RS-1菌體數量基本維持在107cfu/g 土，詳見圖 4。[0016]本發明生防芽孢桿菌RS-1在烤煙葉面的定殖效果如下:將活化后的菌株RS-1接種至液體LB培養基中37°C、200rpm培養24h，5000rpm離心lOmin，沉淀用同體積的0.9%生理鹽水重懸，測定菌體濃度(測定結果為重懸液的RS-1菌體濃度為3.25X 108cfu/mL)。分別在無菌水、RS-1菌液濃度107cfu/mL、RS-l菌液濃度106cfu/mL、RS_l菌液濃度105cfu/mL 加入吐溫20使得加入吐溫20的終濃度為0.1%，待用。本試驗所用土壤為紅壤摻混10%有機肥(有機肥由云南瑞升埃比特生物科技有限公司提供，總養分為6.0%)。選擇長勢、葉數基本一致的烤煙煙苗進行移栽，每盆移栽一棵煙苗，待煙苗長至7-8片真葉，將所有煙苗的真葉數修剪為一致，然后進行試驗處理。本試驗共設4個處理，處理1:每盆噴施5mL無菌水， 處理2:每盆噴施5mL107cfu/mL的RS-1菌液濃度,處理3:每盆噴施5mL106cfu/mL的RS-1 菌液濃度，處理4:每盆噴施5mL 105cfu/mL的RS-1菌液濃度，每個處理共設3個重復。噴施后15d，取每處理3個重復的相同部位的2片煙葉，用直徑Icm的打孔器共取60個小圓片，稱重后置于加有少量石英砂和IOmL無菌水的研缽中進行充分勻漿，取勻漿液進行稀釋涂布測定每克葉片芽孢桿菌數量，根據菌株RS-1的菌落形態特征及空白對照中的芽孢桿菌數量，最終確定各稀釋濃度的RS-1在烤煙葉表的定殖情況。結果顯示，隨著稀釋濃度的增加，葉表的RS-1菌體數量不斷下降，其中噴施菌液濃度107cfu/mL處理15d后的定殖結果為 3.22 X IO6 cfu/mL，詳見圖 5。[0017]本發明生防芽孢桿菌RS-1在烤煙白粉病的防治效果如下:將活化后的菌株 RS-1接種至液體LB培養基中37°C、200rpm培養24h，5000rpm離心lOmin，沉淀用同體積的0.9%生理鹽水重懸，測定菌體濃度后待用(測定結果為重懸液的RS-1菌體濃度分別為3.73X 108cfu/mL)o重懸后分別按10倍、100倍稀釋后連同對照樣即無菌生理鹽水一起分別加入吐溫20使得加入吐溫20的終濃度為0.1%，待用。本試驗共設4個處理:處理1，噴施無菌水；處理2，噴施RS-1 108cfu/mL菌液；處理3，噴施RS-1 107cfu/mL菌液；處理4， 噴施RS-1 106cfu/mL菌液。本試驗所用土壤為紅壤摻混10%有機肥(有機肥由云南瑞升埃比特生物科技有限公司提供，總養分為6.0%)。每處理設20盆重復，每盆土重5kg，基肥分別按 N 0.15 g/kg 土、P2O5 0.15 g/kg 土、K2O 0.15 g/kg 土施入。選擇長勢、葉數基本一致的烤煙煙苗進行移栽，每盆移栽一棵煙苗。從發病的白粉病煙株上收集白粉病分生孢子于0.9%的生理鹽水中，并調整分生孢子濃度為IO5個/mL，并于煙苗移栽后IOd均勻噴施于煙苗葉表，噴施7d后煙苗開始出現白粉病癥狀，然后開始噴施菌液處理，處理2、3和4每盆噴施5mL，對照噴施每盆噴施5mL無菌生理鹽水，15d后按照煙草白粉病病害分級及調查方法進行調查每個處理所有重復的白粉病發病情況。[0018]煙草白粉病病害分級及調查方法如下:以葉片為單位分級調查，O級為全葉無病，I級為病斑面積占葉片面積的5%以下，3級為病斑面積占葉片面積的6%~10%，5級為病斑面積占葉片面積的11%~20%，7級為病斑面積占葉片面積的21%~40%，9級為病斑面積占葉片面積的41%以上。[0019]病情指數=Σ〔各級病葉數X該病級值〕/ (調查總葉數X最高級值)X100。[0020]防治效果=(對照發病指數一處理發病指數)/對照發病指數X 100%。[0021]各處理的白粉病病情指數和防治效果見表1，噴施.RS-1 108cfu/mL處理的防治效果達到60.54%ο[0022]表1.菌株RS`-1對煙草白粉病的防治效果處理名稱I發病指數I防治效果(％)—CK_57.25 -_RS-1 IO8Cfu/mL ~22.57 —60.54 RS-1107cfu/mL — 35.81 — 37.40 RS-1106cfu/mL 丨45.59 丨20.30本發明生防芽孢桿菌RS-1在烤煙上的促生效果如下:將活化后的菌株RS-1接種至液體LB培養基中37°C、200rpm培養24h，5000rpm離心lOmin，沉淀用同體積的0.9%生理鹽水重懸，測定菌體濃度后待用(測定結果為重懸液的RS-1菌體濃度分別為3.53X 108cfu/mL)o 本試驗共設4個處理:處理1，0.9%無菌生理鹽水；處理2，RS-1菌液濃度108cfu/mL ;處理 3，RS-1菌液濃度10\血/1^;處理4，1?-1菌液濃度106cfu/mL。本試驗所用土壤為云南紅壤摻混10%云南瑞升埃比特生物科技有限公司的有機肥(有機肥總養分為6.0%)。每處理設 5 盆重復，每盆土重 5kg，基肥分別按 N 0.15 g/kg 土、P2O50.15 g/kg 土、K2O 0.15 g/kg 土施入。選擇長勢、葉數基本一致的烤煙煙苗進行移栽，每盆移栽一棵煙苗。移栽后l-2d待煙苗成活后，處理2、3、4的每盆分別進行相應濃度菌液進行灌根(為了使灌根的菌液能夠與根充分接觸IOmL兌入90mL水中進行灌根)。期間分別于移栽后15d和30d進行追肥，每盆追施復合肥(復合肥的重量配比為N =P2O5 =K2O=IO:10:25)lg，整個試驗期間，所有處理每天定量澆水管理。移栽后60d調查有效葉片數、莖高、莖圍直徑、最大葉寬、最大葉長、節距、 地上部分干重和地下部分干重。詳細數據結果見表2，從表2可知，菌株RS-1通過灌根方式能夠促進烤煙的生長，主要體現在地上部分各種農藝性狀和根系的干重方面，其中菌株 RS-1 108cfu/mL的促生效果最明顯，與對照樣相比，各部分漲幅為:莖高增長8.26%，最大葉長增長8.97%，最大葉寬增長7.97%，節距增長13.23%，總生物量增長11.80% (其中地上部分和地下部分生物量漲幅分別為11.29%和14.01%)ο
[0023]表2.菌株RS-1在烤煙上的促生情況
【權利要求】
1.一株兼具抗病和促生效果的生防芽孢桿菌，其特征在于，菌株為sp.RS-1, 2013年Ol月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏編號為 CGMCC N0.7170。
2.如權利要求1所述的一株兼具抗病和促生效果的生防芽孢桿菌，其特征在于，所述生防芽孢桿菌菌株sp.RS-1是從云南本土栽培的烤煙葉表分離所得。
3.如權利要求1所述的一株兼具抗病和促生效果的生防芽孢桿菌，其特征在于，所述生防芽孢桿菌RS-1在LB培養基上培養24h后的菌落特征為乳白色，邊緣不規則，表面干燥，革蘭氏染色陽性，產芽孢，芽孢橢圓形，中生，不膨大；所述LB培養基為蛋白胨10g、酵母粉 5g、NaCl 10g、瓊脂 18g、H2OlOOOmL, pH 7.0。
4.如權利要求1或2或3所述的一株兼具抗病和促生效果的生防芽孢桿菌的應用，其特征在于，將該生防芽孢桿菌用于土傳病害病原菌如煙草赤星病菌 (Alternaria a I terna ta (Fries) ifeissyer )、黃瓜才古萎病菌(Fusarium oxy sporum f.sp.cucumerinum)、舌甘瓜 ?古萎病菌 QFusarium oxysporum (Schl.) f.sp.me I on is (Leach et Currenee)Snyder et Hansen)>HfiFusarium oxysporum Schlechtendahl ex Fries f.sp.nweum (E.F.Smith) Snyder et油菜菌核菌 sclerotiorum (Lib.) de Bary、、石斛黑腐病菌 iPhytophthora palmivora 和 Pythium ul timum )和石斛枯萎病菌iFusarium oxysporum )的抑制。
5.如權利要求1或2或3所述的一株兼具抗病和促生效果的生防芽孢桿菌的應用，其特征在于，將該生防芽孢桿菌在土壤植物根際和烤煙葉面有效定殖。
6.如權利要求5所述的一株兼具抗病和促生效果的生防芽孢桿菌的應用，其特征在于，將該生防芽孢桿菌采用在烤煙葉面噴施方式防治煙草白粉病。
7.如權利要求5所述的一株兼具抗病和促生效果的生防芽孢桿菌的應用，其特征在于，將該生防芽孢桿菌采用灌根方式促生烤煙和油麥菜。
【文檔編號】C12N1/20GK103555609SQ201310434741
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年9月23日 優先權日:2013年9月23日
【發明者】胡曉峰, 岳寧, 盤文政, 陳曉華, 陳俊秋, 弓新國, 肖渝 申請人:云南瑞升埃比特生物科技有限公司