一種豬偽狂犬病病毒株、疫苗組合物及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種疫苗組合物，該疫苗組合物包括免疫量的豬偽狂犬病病毒抗原和獸醫(yī)學上接受的佐劑。該疫苗組合物可以在豬、犬體內(nèi)誘導有效的免疫反應，且免疫該疫苗組合物的仔豬體溫升高時間更短，食欲基本正常，并且基本沒有臨床癥狀，顯示出很好的免疫保護。
CCTCC NO：V201335
2013.08.26
【專利說明】一種豬偽狂犬病病毒株、疫苗組合物及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種疫苗組合物，屬于動物病毒學領域。
【背景技術】
[0002]偽狂犬病，又稱Aujeszky氏病，是由皰疹病毒科（Herpesviridae)a亞科中的豬 皰疫病毒I型（Suidherpesviruslstrain)所引起的豬、牛、羊等多種家畜、家禽和野生動 物的一種以發(fā)熱、奇癢（除豬外）及腦脊髓炎為主癥的急性傳染病。豬的偽狂犬病在我國 廣泛存在，危害嚴重，是制約規(guī)模化豬場生產(chǎn)的主要疫病之一。它能引起妊娠母豬流產(chǎn)、死 胎或木乃伊胎和仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀、麻痹，死亡率高。PRV具有較強的泛嗜性、神經(jīng)嗜性及潛 伏感染特性，在外周神經(jīng)系統(tǒng)可以長期潛伏感染，當潛伏病毒被激活變成有感染力的病毒， 被潛伏感染的宿主就會發(fā)病。
[0003] 研究表明亞單位疫苗能夠給免疫動物提供相應的保護，亞單位疫苗是利用基因工 程方法將病原保護性抗原基因克隆到原核或真核表達系統(tǒng)中，使其高效表達而制成的疫 苗。目前發(fā)現(xiàn)偽狂犬病毒糖蛋白中的gB、gC、gD均能使機體產(chǎn)生中和抗體，這些抗體無論是 在體內(nèi)、體外，還是在有無補體存在的情況下都有中和PRV的能力。"偽狂犬病亞單位疫苗 研究進展"（楊承槐，婁高明，諶南輝《江西畜牧獸醫(yī)雜志》2004年第3期）公開了在偽狂犬 病病毒目前已發(fā)現(xiàn)的11種糖蛋白中，gB、gC、gD均能誘導機體產(chǎn)生中和抗體。在沒有補體 的參與下，gB、gC、gD的單克隆抗體能中和PRV。豬和小鼠注射抗gB、gC、gD的單克隆抗體 均能抵抗PRV強毒的攻擊。因此，gB、gC、gD是研制PRV亞單位疫苗的首選蛋白。糖蛋白gD 是一種重要的中和抗原，也是保護性抗體的主要目標，能誘導較好的保護反應。US6858385 和US6521231公開了利用豬偽狂犬病病毒gD蛋白可以制備疫苗用于豬偽狂犬病的預防。
[0004] 豬PRV只有一個血清型，通常認為毒株的交叉保護力很強，但目前仍存在仔豬注 射商品化疫苗后發(fā)生典型豬偽狂犬病，例如長時間體溫升高，精神沉郁，食欲減退，出現(xiàn)呼 吸道和/或神經(jīng)癥狀。
[0005] 伴隨著偽狂犬毒株的變異，犬感染偽狂犬病毒引起的發(fā)病和死亡屢有發(fā)生，例如 劉蕾等人在"關注偽狂犬病患犬，它就在你面前，中國畜牧獸醫(yī)學會小動物醫(yī)學分會第六 次學術研討會暨獸醫(yī)外科學分會第十八次學術研討會論文集第一部分，小動物醫(yī)學文集， 56-59,2011。"報道了犬因為食用患偽狂犬的豬肉而發(fā)生偽狂犬病，并且利用PCR方法從犬 腦組織中擴增出了PRV基因片段。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 為解決現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的主要目的是提供一種豬偽狂犬病病毒株，其中， 所述豬偽狂犬病病毒株具有序列表SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列編碼的gD糖蛋白。
[0007]本發(fā)明術語"gD糖蛋白"，是豬偽狂犬病病毒進行感染必需的結(jié)構蛋白，是成熟的 病毒粒子囊膜表面的主要糖蛋白之一，也稱為gp50蛋白。
[0008]本發(fā)明術語"同源性"在本申請中是指兩條氨基酸序列或兩條核苷酸序列的相 似程度。氨基酸序列或核苷酸序列的同源性可以通過本領域公知的任何適當?shù)姆椒ㄓ?算得到，例如，可以將目標氨基酸（或核苷酸）序列與參比氨基酸（或核苷酸）序列進行 序列比對，必要時可以引入空缺，使得兩條比對的序列間相同的氨基酸（或核苷酸）數(shù)目 達到最優(yōu)化，并在此基礎上計算兩條氨基酸（或核苷酸）序列之間相同氨基酸（或核苷 酸）的百分比。氨基酸（或核苷酸）序列的比對和同源性的計算可以通過本領域公知的 軟件實現(xiàn)，例如，但不限于，BLAST軟件（在美國國立生物技術信息中心（NCBI)的網(wǎng)址上 可獲得：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，或者見，例如，AltschulS.F.et al,J.Mol.Biol. , 215 ：403-410(1990)；StephenF.etal,NucleicAcidsRes. ,25： 3389-3402(1997))，ClustalW2軟件（在歐洲生物信息研究所網(wǎng)址上可獲得：http://www. eji.ac.uk/Toolsa/clustalw2/,另見，例如，HigginsD.G.etal,MethodsinEnzymology, 266:383-402(1996)；LarkinM.A.etal,Bioinformatics(Oxford,England),23(21)： 2947-8(2007));和TCoffee軟件等（在瑞典生物信息學研究所的網(wǎng)站上可以獲得： http://tcofTee.vital-it.ch/cgi_bin/TcofTee/tcofTee_cgi/index.cgi，另見，例如，Poirot0.etal,NucleicAcidsRes. ,31(13) ：3503-6(2003)；NotredameC.etal,J.Mol. Boil.，302 (1) :205-17 (2000))。使用軟件進行序列比對時，可以使用軟件提供的默認參數(shù)， 或者也可以根據(jù)實際情況對軟件提供的參數(shù)進行調(diào)整，這些都在本領域技術人員的知識范 圍內(nèi)。
[0009] "編碼序列"在本申請中是指一種DNA序列，其能夠被轉(zhuǎn)錄得到相應的RNA序列。
[0010] 本發(fā)明的主要目的在于提供一種豬偽狂犬病病毒株，所述豬偽狂犬病病毒株基因 組包含編碼SEQ.NO. 1的gD蛋白的基因。
[0011] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種豬偽狂犬病毒HN1202株（Pseudorabiesvirus, strainHN1202)，所述豬偽狂犬病毒株保藏號為V201335,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中 心，地址為中國武漢?武漢大學，保藏日期為2013年8月26日。
[0012] 所述豬偽狂犬病毒HN1202 株（Pseudorabiesvirus，strainHN1202)保藏號為 CCTCCNO.V201335 ;保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏地址為中國武漢市?武漢大學， 保藏日期為2013年8月26日。
[0013] 本發(fā)明提供了一種DNA序列，所述DNA序列實質(zhì)上編碼SEQ.NO. 1的gD蛋白。
[0014] 本發(fā)明的再一目的在于提供一種疫苗組合物，所述疫苗組合物包括免疫量的所述 的豬偽狂犬病病毒抗原和獸醫(yī)學上接受的佐劑。
[0015] 優(yōu)選地，所述豬偽狂犬病病毒抗原為所述豬偽狂犬病病毒或其培養(yǎng)物的減毒全病 毒抗原、滅活全病毒抗原、亞單位抗原、合成肽抗原或基因工程抗原。
[0016] 優(yōu)選地，所述豬偽狂犬病病毒抗原為含有序列表SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列 編碼的gD糖蛋白毒株的抗原。
[0017] 所述術語"培養(yǎng)物"是病毒的不同代次傳代培養(yǎng)物，本領域技術人員知曉不同代 次之間其基因序列僅可能會發(fā)生微小的變異，優(yōu)選地，所述培養(yǎng)物是5-35代以內(nèi)的培養(yǎng) 物。
[0018] 本發(fā)明所用的術語"活疫苗"指的是以毒力已經(jīng)減弱但仍可在宿主體內(nèi)或細胞上 復制的病毒制備的疫苗。本發(fā)明所用的術語"減毒"用于指以使病原喪失致病性、但保持免 疫原性的方式對基因進行突變來人工降低病原體毒性。通常，通過UV輻射、化學處理或體 外連續(xù)高階繼代培養(yǎng)實現(xiàn)減毒。人工的基因改變，例如將已知序列中的特定核苷酸缺失以 使毒力減弱。
[0019] 所用的術語"滅活疫苗"，也稱作失活疫苗，指的是用作抗原以產(chǎn)生免疫力的滅活 病毒的混懸液。滅活疫苗的例子包括全病毒疫苗和裂解型疫苗。使用已知方法可以很容易 地產(chǎn)生滅活疫苗。例如，通過用甲醛溶液處理病毒可獲得全病毒滅活疫苗。裂解型疫苗可 在用醚處理后由病毒包膜制備得到。
[0020] 術語"亞單位疫苗"指的是利用基因工程方法將病原體的保護性抗原基因克隆到 原核或真核表達系統(tǒng)中，使其高效表達而制成的疫苗。它比全病毒疫苗引起副反應的可能 性小。例如，表達的豬偽狂犬病病毒的gD蛋白可用于制備亞單位疫苗。
[0021] 術語"合成肽疫苗"指的是一種僅含免疫決定簇組分的小肽，即用人工方法按天 然蛋白質(zhì)的氨基酸順序合成保護性短肽，與載體連接后加佐劑所制成的疫苗。
[0022] 更優(yōu)選地，所述豬偽狂犬病病毒抗原為所述豬偽狂犬病病毒HN1202株或其培養(yǎng) 物的減毒全病毒抗原、滅活全病毒抗原、亞單位抗原、合成肽抗原或基因工程抗原；優(yōu)選地， 所述培養(yǎng)物為培養(yǎng)5-35代以內(nèi)的培養(yǎng)物。
[0023] 進一步優(yōu)選地，所述豬偽狂犬病病毒抗原為所述豬偽狂犬病病毒HN1202株或其 培養(yǎng)物的滅活全病毒抗原或gD重組蛋白抗原。
[0024] 本發(fā)明的疫苗組合物可以包含所述豬偽狂犬病病毒或其抗原作為活性成分。用于 疫苗的組合物的豬偽狂犬病病毒具有SEQIDNO. 1的氨基酸序列或與其共有98%以上同源 性的氨基酸序列表示的gD糖蛋白。
[0025] 用于本發(fā)明的抗原是指病毒組分的抗原部分，它引起免疫應答，并可包含具有SEQ ID NO. 1的氨基酸序列。
[0026] 優(yōu)選地，所述豬偽狂犬病病毒或其培養(yǎng)物含量為彡106_°TCID5(l/ml。
[0027] 優(yōu)選地，所述疫苗組合物包括> 106_°TCID5(l/ml的豬偽狂犬病病毒株HN1202株或 其培養(yǎng)物滅活疫苗。
[0028] 優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗組合物可包含每頭份106_°TCID5(I量的豬偽狂犬病病毒。當 豬偽狂犬病病毒以少于l〇6_°TCID5(l的量使用時，疫苗不能有效刺激抗體產(chǎn)生。另一方面，超 過的量可能是不經(jīng)濟的。
[0029] 此外，本發(fā)明的豬偽狂犬疫苗可與其他失活病原體或抗原組合使用以制備抵抗包 括豬偽狂犬病的各種疾病的聯(lián)合疫苗或復合疫苗。本發(fā)明所用的術語"聯(lián)合疫苗"指利用 本發(fā)明的豬偽狂犬病病毒與至少一種不同病毒的病毒混合物制備的疫苗。術語"復合疫苗" 指的是從病毒和細菌制備的疫苗。例如，本發(fā)明的豬偽狂犬病毒可與豬瘟病毒、豬繁殖與呼 吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒和/或副豬嗜血桿菌、支原體混合或組合。
[0030] 優(yōu)選地，所述疫苗組合物進一步包括介質(zhì)、佐劑、賦形劑。
[0031] 本發(fā)明的疫苗組合物還可包含介質(zhì)、佐劑和/或賦形劑。生理鹽水或蒸餾水可用 作介質(zhì)。用于疫苗組合物的佐劑的例子包括弗氏的不完全佐劑或完全佐劑、氫氧化鋁凝膠、 植物油或礦物油等。賦形劑的例子包括磷酸鋁、氫氧化鋁和硫酸鋁鉀，但不限于此。在實踐 中，本領域技術人員已知的用于疫苗制備的所有物質(zhì)均可適用于本發(fā)明的疫苗組合物。
[0032] 本發(fā)明的又一目的在于提供一種制備所述疫苗組合物的方法，所述方法包括： (1)培養(yǎng)增殖所述豬偽狂犬病病毒；（2)滅活所述增殖的豬偽狂犬病病毒；（3)加入佐劑，乳 化。
[0033] 具體地，所述方法為：（1)將豬偽狂犬病病毒疫苗株接種于易感細胞，并培養(yǎng)所述 接種后的易感細胞；收獲細胞培養(yǎng)物；
[0034] (2)用甲醛溶液、BPL(@-丙內(nèi)酯）或BEI(二乙烯亞胺）處理來自步驟（1)的病 毒；
[0035] 所述易感細胞可以是傳代細胞系，也可以是原代細胞。適合于豬偽狂犬病病毒的 易感細胞包括但不限于，ST細胞系（ATCC編號：CRL-1746)、PK-15細胞系（ATCC編號： CCL-33)、非洲綠猴腎細胞Marc-145細胞系（ATCC編號：CRL-12219)、牛腎細胞MDBK細胞系 (ATCC編號：CCL-22)、牛睪丸傳代細胞BT細胞系（ATCC編號：CRL-1390)、Vero細胞系（ATCC 編號：CCL-81)、BHK-21細胞系（ATCC編號：CCL-10)、豬腎傳代細胞系（如：IBRS-2,見例 如，DECASTRO,M.P.1964.Behavioroffootandmouthdiseasevirusincellculture： susceptibilityoftheIB-RS_2swinecellline.ArquivosInstitutoBiologica31 ： 63-78)、兔腎傳代細胞系（RK，如：ATCC編號：CCL-106)等傳代細胞系，或者雞胚成纖維細胞 和豬腎細胞等原代細胞。原代細胞可以通過本領域公知的方法，用動物體內(nèi)的組織進行分 離和制備。
[0036] 本發(fā)明的提供了一種制備所述疫苗組合物的方法，所述方法包括：（1)表達所述 豬偽狂犬病病毒gD抗原；（2)加入佐劑，乳化。
[0037] 可將根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物制備成口服劑型或非口服劑型。優(yōu)選的是可通過皮 內(nèi)、肌肉、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)或硬腦膜外途徑給予的非口服劑型。
[0038] 本發(fā)明的還一目的在于提供所述的疫苗組合物在制備預防和/或治療偽狂犬病 病毒相關疾病的藥物中的應用。
[0039] 本文所用的術語"豬偽狂犬病病毒相關疾病"用于指由豬偽狂犬病病毒感染引起 的疾病。它的例子包括發(fā)病仔豬表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)癥狀、昏睡、嗚叫、嘔吐、拉稀、體溫升高， 一旦發(fā)病，懷孕母豬可發(fā)生流產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎兒或死胎或繁殖障礙，但不限于此。
[0040] 本文所用的術語"預防"指通過給予根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物抑制豬偽狂犬感染 或推遲疾病發(fā)作的所有行為。術語"治療"指通過給予根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物使豬偽狂 犬病病毒感染引起的癥狀減輕或轉(zhuǎn)好的所有行為。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0041] 圖1為HN1202株gD抗原氨基酸序列與豬偽狂犬病毒BarthaK-61株gD抗原氨 基酸序列同源分析結(jié)果。
[0042] 序列表中：
[0043] 序列1為豬偽狂犬病病毒HN1202株gD蛋白氨基酸序列；
[0044] 序列2為豬偽狂犬病病毒HN1202株gD基因核苷酸序列。
【具體實施方式】
[0045] 下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述更 為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術人 員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進 行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0046] 本發(fā)明中的術語"頭份"是指每頭豬注射的疫苗量。
[0047] 本發(fā)明中所述的 "TCID5(I"（50%tissuecultureinfectivedose)是指半數(shù)細胞 培養(yǎng)物感染量，是表不病毒感染力的一種表不方式。
[0048] MEM液體培養(yǎng)基(液)用購自美國LifeTechnologies公司的MEM干粉培養(yǎng)基按照 其說明書配制。
[0049] 本發(fā)明的DMEM培養(yǎng)基參照GB/T18641-2002附錄A配制方法配制。
[0050] 本發(fā)明中所述的"PBS"是指磷酸鹽緩沖液（PhosphateBufferSaline)的英文縮 寫，本發(fā)明中使用的是0.OlmM的PH7. 4的PBS，按《分子克隆》第三版所述配制。
[0051] 實施例1、病毒的采集分離
[0052] 從來自河南的疑似豬偽狂犬感染的樣本中分離樣本無菌采集豬腦組織，以1 : 10 (體積比)加入MEM培養(yǎng)液，研磨，制備組織懸液，經(jīng)反復3次凍融后，2000r/min離心15min， 收集上清液，再經(jīng)〇.211111濾膜濾器過濾，在？1(-15細胞上接種371：培養(yǎng)111，換加含2%犢 牛血清的MEM培養(yǎng)液，37°C培養(yǎng)5日。收獲含毒培養(yǎng)液，經(jīng)2次凍融后，收毒，換加含2%犢 牛血清的MEM培養(yǎng)液。采用豬偽狂犬病病毒PCR檢測試劑盒（北京世紀元亨動物防疫技 術有限公司）檢測豬偽狂犬病病毒，結(jié)果為陽性；對分離的病毒利用利用PCR試劑盒進行外 源病毒的檢測（豬藍耳病病毒RT-PCR檢測試劑盒、豬細小病毒PCR檢測試劑盒豬瘟病毒 RT-PCR檢測試劑盒均為北京世紀元亨動物防疫技術有限公產(chǎn)品)，PCR檢測結(jié)果均為陰性， 表明毒種純凈。
[0053] 將分離到的偽狂犬病毒提交保藏，所述豬偽狂犬病病毒株為HN1202株 (Pseudorabiesvirus，strainHN1201)，保藏號為CCTCCNO.V201335;保藏于中國典型培 養(yǎng)物保藏中心；保藏地址為湖北省武漢?武漢大學，保藏日期為2013年8月26日。
[0054] 實施例2、分離病毒的遺傳特性
[0055] 通過基因分析來確定實施例1中分離的病毒的遺傳特性。利用在PK15細胞上分 離的豬偽狂犬病病毒基因組DNA做模板，使用表1所示的引物進行PCR。分別使用Primer Premier5. 0來設計用于擴增gD基因的引物序列。
[0056] 以提取的基因組DNA為模板，制備PCR擴增體系如下：模板DNAlOOiig，PrimerSTAR HSDNAPolymerase(2.5U/iil)0.5iil，2XPrimerSTARGCBuffer25iil，上下游引物各 1111(1(^111〇1/111)，(11'0131^(2.5111163(311)4111，并用蒸饋水將體積補足5〇111。進行兩 步PCR反應：在98°C變性10sec，然后在68°C退火和延伸lminl5sec，共30個循環(huán)。在4°C 終止PCR反應。通過在含有溴化乙錠的1%的瓊脂糖凝膠上進行電泳分析所得的PCR產(chǎn)物。 PCR產(chǎn)物進行序列測定。用Lasergene軟件分析所得到的序列數(shù)據(jù)。
[0057] 表1PCR引物序列
【權利要求】
1. 一種豬偽狂犬病病毒株，所述豬偽狂犬病病毒株基因組包含編碼SEQ. NO. 1的gD蛋 白的基因。
2. -種豬偽狂犬病病毒株HN1202,所述豬偽狂犬病病毒株保藏號為V201335,保藏于 中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為中國武漢?武漢大學，保藏日期為2013年8月26日。
3. -種DNA序列，所述DNA序列實質(zhì)上編碼SEQ. NO. 1的gD蛋白。
4. 一種疫苗組合物，所述疫苗組合物包括免疫量的權利要求1所述的豬偽狂犬病病毒 抗原和獸醫(yī)學上接受的佐劑。
5. 根據(jù)權利要求4所述的疫苗組合物，其中，所述豬偽狂犬病病毒抗原為所述豬偽狂 犬病病毒或其培養(yǎng)物的減毒全病毒抗原、滅活全病毒抗原、亞單位抗原、合成肽抗原或基因 工程抗原。
6. 根據(jù)權利要求5所述的疫苗組合物，其中，所述豬偽狂犬病病毒抗原為所述豬偽狂 犬病病毒HN1202株或其培養(yǎng)物的減毒全病毒抗原、滅活全病毒抗原、亞單位抗原、合成肽 抗原或基因工程抗原；優(yōu)選地，所述培養(yǎng)物為培養(yǎng)5-35代以內(nèi)的培養(yǎng)物。
7. 根據(jù)權利要求6所述的疫苗組合物，其中，所述豬偽狂犬病病毒抗原為所述豬偽狂 犬病病毒HN1202株或其培養(yǎng)物的滅活全病毒抗原或gD重組蛋白抗原。
8. 根據(jù)權利要求4所述的疫苗組合物，其中，所述豬偽狂犬病病毒或其培養(yǎng)物含量為 彡 106°TCID5(l/ml。
9. 一種制備所述疫苗組合物的方法，所述方法包括： (1) 培養(yǎng)增殖所述豬偽狂犬病病毒； (2) 滅活所述增殖的豬偽狂犬病病毒； (3) 加入佐劑，乳化。
10. 根據(jù)權利要求4?8所述疫苗組合物在制備預防和/或治療偽狂犬病病毒相關疾 病的藥物中的應用。
【文檔編號】C12N7/00GK104328090SQ201310433485
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2013年9月22日 優(yōu)先權日:2013年9月22日
【發(fā)明者】張許科, 孫進忠, 田克恭 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司