抗svcv單克隆抗體3e1及其制備與應(yīng)用的制作方法

抗svcv單克隆抗體3e1及其制備與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本申請公開了一種抗鯉春病毒血癥病毒單克隆抗體3E1，及其制備與應(yīng)用。該單克隆抗體3E1由雜交瘤細(xì)胞株SVCV-3E1分泌，該細(xì)胞株的保藏號為CCTCC?C201366。該雜交瘤細(xì)胞株SVCV-3E1能穩(wěn)定產(chǎn)生單克隆抗體3E1，該抗體具有抗體效價高、靈敏度高、特異性強(qiáng)、與天然抗原的親和力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。本申請還提供了一種包含該單克隆抗體的快速檢測試紙條及其試劑盒，其采用熒光納米微球免疫層析檢測技術(shù)，具有良好的靈敏度、特異性，穩(wěn)定性、重復(fù)性和再現(xiàn)性等特點(diǎn)。同時，該試紙條和試劑盒使用簡單方便、檢測速度快、可滿足食品安全、屠宰、檢測機(jī)構(gòu)等的檢測要求，適用于現(xiàn)場檢測。
【專利說明】抗SVCV單克隆抗體3E1及其制備與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本申請涉及鯉春病毒血癥病毒檢測領(lǐng)域，特別涉及一種抗鯉春病毒血癥病毒(SVCV)單克隆抗體3E1及其制備與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]鯉春病毒血癥(Spring viraemia of carp, SVC)屬于彈狀病毒科水皰病毒屬,含有I個線狀、反義、單鏈的RNA，包含有5個結(jié)構(gòu)蛋白，分別為核蛋白(N)、磷蛋白(P)、膜蛋白(M)、糖蛋白(G)和依賴RNA的RNA聚合酶(L-蛋白)。SVCV是嚴(yán)重影響鯉科魚類的一種嚴(yán)重的傳染性疾病，過去主要流行于歐洲一些國家(奧地利、比利時、法國、德過、英國、匈牙利、意大利、西班牙和前斯洛伐克、蘇聯(lián)和南斯拉夫的部分地區(qū))，并對這些國家的養(yǎng)殖鯉魚造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。病魚體色發(fā)黑、呼吸困難、運(yùn)動失調(diào)(側(cè)游，順?biāo)骰蛴蝿赢惓?、腹部膨大、眼球突出、肛門紅腫、皮膚和鰓滲血。SVC所引起的巨大危害，已被列入世界動物衛(wèi)生組織(OIE)疫病名錄，同時在我國，也將其列為一類動物疫病。
[0003]SVC檢測和確診方法目前主要根據(jù)OIE所推薦的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。對SVC的病原學(xué)診斷需要用電鏡鏡檢、免疫熒光觀察組織切片或分離病原等方法進(jìn)行。OIE推薦用FHM和EPC細(xì)胞系來分離病毒。然后用血清學(xué)方法如中和實(shí)驗(yàn)、免疫熒光或ELISA技術(shù)或熒光定量PCR可對分離出的病毒進(jìn)行鑒定。如CN102876810A采用RT-PCR的方法檢測鯉春病毒血癥病毒；CN102876811A專利也公布了一種RT-LAMP檢測試劑盒，以上檢測方法均需要一定的條件和技術(shù)，此外，也需要特殊儀器，操作費(fèi)用大，其現(xiàn)場檢測推廣及多次重復(fù)追蹤復(fù)查受到限制。
[0004]20世紀(jì)80年代興起的熒光納米微球免疫層析檢測，基于血清學(xué)檢測原理，操作簡單快捷、結(jié)果清晰易于判斷、無需復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)技能和特殊設(shè)備，特別適于現(xiàn)場檢測。因此，研究開發(fā)適合于快速檢測用的抗SVCV單克隆抗體具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本申請的一個目的是提供一種適用于快速檢測的抗鯉春病毒血癥病毒(SVCV)單克隆抗體。
[0006]本申請的另一個目的是提供該單克隆抗體在鯉春病毒血癥病毒(SVCV)檢測領(lǐng)域的應(yīng)用，具體的，提供了一種特異性高、靈敏度高的鯉春病毒血癥病毒(SVCV)快速檢測試紙條及其試劑盒。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本申請采用了以下技術(shù)方案:
[0008]本申請公開了一種可產(chǎn)生抗鯉春病毒血癥病毒(SVCV)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株SVCV-3E1，該細(xì)胞株已于2013年6月6日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號為 CCTCC C201366。
[0009]本申請公開了一種由上述保藏號CCTCC C201366的雜交瘤細(xì)胞株SVCV-3E1產(chǎn)生的抗SVCV單克隆抗體，在本申請中也將該抗體稱為抗SVCV單克隆抗體3E1 (或簡稱為單克隆抗體3E1)。[0010]本申請同時公開了保藏號CCTCC C201366的雜交瘤細(xì)胞株SVCV-3E1在制備SVCV檢測試劑或設(shè)備中的應(yīng)用。
[0011]本申請還公開了上述抗SVCV單克隆抗體3E1在制備SVCV檢測試劑或設(shè)備中的應(yīng)用。
[0012]本申請?zhí)峁┝艘环NSVCV快速檢測試紙條，該檢測試紙條包含上述抗SVCV單克隆抗體3E1。
[0013]進(jìn)一步的，上述SVCV快速檢測試紙條中，抗SVCV單克隆抗體3E1包附熒光納米微球。
[0014]本申請還提供了一種SVCV檢測試劑盒，該試劑盒包括上述SVCV快速檢測試紙條，例如可由上述SVCV快速檢測試紙條組裝而成。
[0015]本申請還提供 了上述SVCV快速檢測試紙條或SVCV檢測試劑盒在SVCV檢測中的應(yīng)用。
[0016]此外，本申請還提供了一種用于制備上述保藏號為CCTCC C201366的雜交瘤細(xì)胞株SVCV-3E1的蛋白，該蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID N0.1所示的序列。
[0017]由于采用了上述技術(shù)方案，本申請的有益效果在于:
[0018]本申請?zhí)峁┑碾s交瘤細(xì)胞株SVCV-3E1能穩(wěn)定產(chǎn)生抗SVCV單克隆抗體3E1，該抗體特異性好、效價高，可應(yīng)用于SVCV快速檢測領(lǐng)域。
[0019]同時，本申請?zhí)峁┝艘环NSVCV快速檢測試紙條及其試劑盒，將熒光納米微球檢測技術(shù)應(yīng)用到SVCV的檢測領(lǐng)域，該試紙條具有特異性強(qiáng)、敏感性高、穩(wěn)定性好、靈敏度高、可重復(fù)性和再現(xiàn)性等優(yōu)點(diǎn)，可以快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定檢測鯉春病毒血癥病毒，且價格低廉。采用該試紙條檢測速度快，檢測結(jié)果直觀，結(jié)果穩(wěn)定，能滿足食品安全、屠宰、檢測機(jī)構(gòu)的檢測要求，適用于現(xiàn)場檢測。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為本申請【具體實(shí)施方式】中的一種鯉春病毒血癥病毒快速檢測試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0021]圖2為本申請【具體實(shí)施方式】中的一種鯉春病毒血癥病毒快速檢測卡的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0022]圖3為本申請【具體實(shí)施方式】中的實(shí)施例1中融合蛋白的原核表達(dá)定位分析結(jié)果圖(12h)；
[0023]圖4為本申請【具體實(shí)施方式】中的實(shí)施例1中融合蛋白的原核表達(dá)純化分析結(jié)果圖(12h)。
[0024]保藏信息
[0025]培養(yǎng)物名稱:雜交瘤細(xì)胞株SVCV-3E1
[0026]保藏日期:2013年6月6日
[0027]保藏單位:湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心，即中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)
[0028]保藏編號:CCTCCC201366【具體實(shí)施方式】
[0029]本申請采用序列為SEQ ID N0.1所示的蛋白SVCV glycoprotein作為免疫原，制備得到了雜交瘤細(xì)胞株SVCV-3E1。該雜交瘤細(xì)胞株細(xì)胞染色體穩(wěn)定，能穩(wěn)定、高表達(dá)的分泌出具有高抗原親和力、高特異性、效價高的抗SVCV單克隆抗體3E1。具體的，該單抗可由上述雜交瘤細(xì)胞株通過注射Balb/c小鼠腹腔，誘生腹水,通過辛酸-硫酸銨純化而大量獲得。該抗SVCV單克隆抗體3E1具有較好的抗原性，與天然抗原的親和力強(qiáng)，且特異性好、抗體效價高，可以作為SVCV多種檢測方法中的重要試劑原料。該抗SVCV單克隆抗體3E1特別適用于SVCV快速檢測領(lǐng)域，尤其適用于SVCV熒光納米微球免疫層析檢測法。具體的，基于本申請中得到的抗SVCV單克隆抗體3E1的高質(zhì)量，其通過化學(xué)偶聯(lián)方法可與熒光納米微球的穩(wěn)定結(jié)合，該抗體與熒光納米微球偶聯(lián)既不影響微球的光學(xué)性質(zhì)，又不影響抗體的免疫學(xué)活性，因此可大大提高檢測的靈敏度，提高檢測限。
[0030]由抗SVCV單克隆抗體3E1制備得到的SVCV熒光納米微球快速檢測試紙條，特異性強(qiáng)、敏感性高、穩(wěn)定性好，同時具備可重復(fù)性和再現(xiàn)性等優(yōu)點(diǎn)。該試紙條可進(jìn)一步與其他部件構(gòu)成SVCV檢測試劑盒，例如將該試紙條與卡殼結(jié)合即可構(gòu)成SVCV熒光納米微球檢測卡，其SVCV快速檢測試紙條則是該試劑盒的核心。本申請采用熒光納米微球免疫檢測技術(shù)，由于檢測時熒光不受激發(fā)光本底的干擾，通過采用高質(zhì)量的單克隆抗體3E1偶聯(lián)熒光納米微球，使得本申請中得到的試紙條、檢測卡和試劑盒的靈敏度得到了大大的提高，從而提高了檢測限。本申請中采用的熒光微球是核殼結(jié)構(gòu)，克服了常規(guī)熒光微球的染料泄露、抗溶液干擾能力差等缺點(diǎn)，增加了熒光微球的穩(wěn)定性和熒光的壽命。熒光微球表面修飾活性基團(tuán)，采用化學(xué)偶聯(lián)方法來標(biāo)記抗體，形成抗體與微球的穩(wěn)定結(jié)合。且該微球顆粒單分散性好，顆粒均一。具有較大的Stokes位移，在檢測時激發(fā)光及發(fā)射光可以輕松地被分開，背景干擾較低。同時，本申請中的試紙條、檢測卡和試劑盒具有操作簡單，檢測時間快，價格低廉的優(yōu)點(diǎn)，適用于現(xiàn)場檢測。
[0031]本申請中的單克隆抗體3E1除了應(yīng)用于上述熒光納米微球免疫層析檢測試紙條外，還可以用于其他SVCV檢測試劑盒、試劑或設(shè)備中。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，將本申請所述的單克隆抗體3E1直接或間接結(jié)合其他信號基團(tuán)(如膠體金、辣根過氧化酶等)，或?qū)⒈旧暾埶龅膯慰寺】贵w3E1作為包被抗體(例如ELISA)，則可用于其他形式的SVCV檢測試劑或設(shè)備。故本申請所制備得到的雜交瘤細(xì)胞及其分泌的抗體可廣泛適用于制備SVCV檢測試劑或設(shè)備。
[0032]此外，本申請中所采用的鯉春病毒血癥病毒毒株為SVCV-2004714，由深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心提供。
[0033]下面通過【具體實(shí)施方式】結(jié)合附圖對本申請作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0034]實(shí)施例一:鯉春病毒血癥病毒膜蛋白的表達(dá)
[0035]根據(jù)NCBI公布的登錄號為AY5272`73的序列，選取鯉春病毒血癥病毒膜蛋白glycoprotein [Spring viraemia of carp virus]為鯉春病毒血癥病毒抗原檢測位點(diǎn)，利用抗原決定簇分析軟件分析整個序列，最后選擇一段免疫原性強(qiáng)、特異性高的蛋白作為免疫原，該蛋白的氨基酸序列為SEQ ID N0.1，合成蛋白對應(yīng)的DNA序列為SEQ ID N0.2。將這段DNA (序列如SEQ ID N0.2所示)插入原核表達(dá)載體PET28e中，測序鑒定。用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，分離純化得到蛋白SVCV glycoprotein,即可將其作為免疫原用于免疫小鼠制備抗體。具體表達(dá)純化過程如下:
[0036]( I)融合蛋白的原核表達(dá)
[0037]①培養(yǎng)
[0038]挑取單菌落于試管中(5mL LB培養(yǎng)基,50ug/mL氨節(jié)青霉素)37 °C, 220rpm/min過
夜培養(yǎng)。
[0039]將培養(yǎng)的菌液按1:100比例接種于200ml LB培養(yǎng)基中，添加50ug/mL氨芐青霉素，37 0C，180rpm/min 擴(kuò)大培養(yǎng)。
[0040]當(dāng)OD值達(dá)到0.6左右時，添加終濃度為0.6mM的IPTG，37°C，120rpm/min誘導(dǎo)12h。
[0041]收集菌體并用PBS緩沖液懸浮。
[0042]②超聲破碎菌體
[0043]冰浴中超聲破碎菌體，功率200W，每200mL培養(yǎng)基進(jìn)行99次循環(huán)(超聲3S，暫停5S為一個循環(huán))。
[0044]超聲完畢，8 000rpm/min,4°C,離心15min,收集上清和沉淀。
[0045]將離心后沉淀采用溶解液(PBS，8M尿素)懸浮，室溫孵育3h，然后6000rpm/min，4°C，離心15min，上清以備純化。
[0046]③鎳瓊脂糖親和層析
[0047]用10倍柱床體積的Binding buffer清洗平衡柱子,流速60ml/h。
[0048]樣品(溶解液上清)上柱，流速為45ml/h，收集穿透液。
[0049]10倍柱床體積的Binding buffer清洗柱子，流速60ml/h。
[0050]Eulte Buffer洗脫，流速45ml/h,收集洗脫液。
[0051]將純化后的蛋白置于透析袋中，在PBS緩沖液(pH=8.0)中緩慢透析12h，收集透析后的樣品，SDS-PAGE分析并保存?zhèn)溆谩?br> [0052]注:BindingBuffer (PBS，8M 尿素 15mM 咪唑，300mM NaCl, 0.5%TritonX-100,pH=8.0) Eulte Buffer (PBS，8M 尿素，500mM 咪唑，ρΗ=8.0)
[0053]( 2 )融合蛋白的表達(dá)及定位
[0054]通過對樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析，電泳顯示在相應(yīng)位置(33kD)出現(xiàn)明顯的新生條帶，表明融合蛋白在誘導(dǎo)12h后成功得到了表達(dá),見圖3,圖3中,M為蛋白marker, I所示為誘導(dǎo)前樣品，2所示為誘導(dǎo)后樣品，3所示為超聲后上清，4所示為超聲后沉淀，其條件為濃縮膠80V, 15分鐘；分離膠150V，60分鐘。
[0055](3)融合蛋白的純化
[0056]融合蛋白經(jīng)過鎳瓊脂糖親和層析法進(jìn)行純化，SDS-PAGE電泳分析在相應(yīng)位置(33kD)均出現(xiàn)明顯條帶，表明融合蛋白12小時后成功得到了純化，見圖4。圖4中，M為蛋白marker，I所示為目的蛋白，其條件為濃縮膠80V，15分鐘；分離膠150V，60分鐘。
[0057]實(shí)施例二:抗鯉春病毒血癥病毒單克隆抗體的制備:
[0058](I)共選取8周齡BALB/C小鼠5只，免疫程序如下:
[0059]首免:以SVCV-glycoprotein 作為免疫原，以 Quick Antibody-Mouse5ff 作為免疫佐劑，免疫劑量為5μ g/只(5μ g免疫原+5μ L Quick Antibody-Mouse5W+生理鹽水90ul )，大腿肌肉注射。
[0060]加強(qiáng)免疫:于首免后第21天進(jìn)行,免疫劑量為5μ g/只(5μ g免疫原+5μ L QuickAntibody-Mouse5ff+生理鹽水90ul),共免疫2次,第35天斷尾采血分離血清,用間接ELISA法檢測抗SVCV懸液的血清抗體效價。若效價達(dá)到1:5000，即可用于細(xì)胞融合。
[0061]選取ELISA法檢測抗體較高的免疫小鼠，眶下竇采血，分離血清。脫頸致死小鼠；
[0062]無菌手術(shù)取出脾臟制備脾細(xì)胞，并與NSO細(xì)胞在50%PEG作用下進(jìn)行細(xì)胞融合；
[0063]將融合后的細(xì)胞懸液加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，用HAT培養(yǎng)基進(jìn)行選擇性培養(yǎng)。融合后的細(xì)胞置37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0064]用間接ELISA法以0.5 μ g/孔的蛋白的量包被酶標(biāo)板進(jìn)行陽性篩選。P/N大于
2.1時即為陽性。對強(qiáng)陽性、細(xì)胞生長旺盛的孔進(jìn)行3次有限稀釋克隆化，得到保藏號為CCTCCC201366的雜交瘤細(xì)胞株SVCV-3E1。
[0065](2)單抗的大量制備:
[0066]本例中采用腹水法大量制備單克隆抗體。將雜交瘤細(xì)胞株SVCV-3E1擴(kuò)大培養(yǎng)，待細(xì)胞濃度達(dá)5 X IO5個/mL時停止換液，直至細(xì)胞全部死亡，收集培養(yǎng)液，測定其ELISA效價；
[0067]給腹腔注射液體石蠟10天后的小鼠腹腔注射克隆化細(xì)胞株IO7個細(xì)胞，7天后抽取腹水，用SVCV病毒懸液包被酶標(biāo)板測其ELISA效價。
[0068](3)單抗的純化:
[0069]采用辛酸一硫酸銨法進(jìn)行單抗的純化。將20mL腹水加入離心管中，于40C 12000rpmX15min，將上清轉(zhuǎn)移至另一溶器中；
[0070]向上清中加入4倍血清體積的0.06M pH4.8的醋酸緩沖液，室溫邊加邊攪拌；
[0071]向上述混合物中加入適量的辛酸(33 μ L/mL)，滴加時要緩慢，室溫滴加，邊滴加邊攪拌；辛酸滴加完后，室溫攪拌30min ；
[0072]于4°C離心，12000rpmX 30min,取上清，用濾紙過濾；
[0073]向?yàn)V液中加入≤45%的飽和硫酸銨溶液(SAS)，室溫攪拌30min，4°C靜置2h或過夜；
[0074]于4°C離心 12000rpmX 30min,棄上清，沉淀用適量 0.01mol/L PH7.4PBS 重懸,用
0.01mol/L PH7.4PBS 于 4°C透析 24h，其間換液 4 次；
[0075]將透析物于4°C離心12000rpmX30min，收集上清分裝于EP管中，用核酸蛋白測定儀測定蛋白含量，稀釋至10mg/mL，置于_20°C保存。
[0076](4)單克隆抗體特異性檢測:
[0077]用純化的單克隆抗體3E1分別與其他魚類病毒(錦鯉皰疹病毒(KHV)、傳染性造血組織壞死病毒(IHNV)、病毒性出血性敗血病毒(VHSV)、傳染性胰臟壞死病毒(IPNV)、真鯛虹彩病毒(RSIV)、草魚出血病病毒(GCHV)和流行性造血器官壞死病毒(EHNV))包被的ELISA板反應(yīng)，鑒定單克隆抗體的特異性。
[0078]實(shí)施例三:熒光納米微球的制備
[0079](I)黃色熒光納米晶——CdTe / CdS核殼半導(dǎo)體納米晶的制備
[0080]在離心管中加入硼氫化鈉，注入高純水；待硼氫化鈉溶解后迅速加入碲粉，其摩爾比為2:1。反應(yīng)體系用冰冷卻，預(yù)留排氣口排出反應(yīng)中產(chǎn)生的氫氣。反應(yīng)2~8小時，瓶底生成白色的四硼酸鈉沉淀，上層清夜即為所需的NaHTe溶液。
[0081]反應(yīng)方程式為:[0082]4NaBH4+2Te+7H20 — 2NaHTe+Na2B407+14H2 ；
[0083]將CdCl2和巰基丙酸混合溶液的pH值調(diào)至7~14，用微量進(jìn)樣器加入新制得的NaHTe溶液，其摩爾比為Cd =Te:巰基丙酸=2:1:2~8。在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下將上述溶液在50~110°C回流即得到黃色CdTe半導(dǎo)體納米晶溶液。
[0084](2)黃色熒光納米微球的制備
[0085]①聚苯乙烯微球(表面羧基400nmol/mg)的制備
[0086]將2g PVP>7.6mL去離子水和60.4mL無水乙醇加入到250mL三頸瓶中，攪拌形成均相體系后，通入N21h排凈氧氣；向瓶中緩慢滴加溶有0.3g AIBN的30.0g苯乙烯溶液。滴加完畢后，保持氮?dú)鈿夥蘸鸵欢〝嚢杷俣?，?0°C下聚合反應(yīng)12h，即得乳液樣品。將下層微球用無水乙醇反復(fù)洗滌后備用。
[0087]②黃色納米晶在聚苯乙烯微球表面的組裝
[0088]將ImL帶正電荷的聚二烯丙基二甲基氯化銨(I3DDA)溶液加入到ImL表面帶有負(fù)電荷的聚苯乙烯微球(PS)懸濁液中，20min后將上層清液離心分離去除；用緩沖液對微球進(jìn)行超聲分散洗滌3~5次，每次超聲完畢即將濁液離心分離去除上層清液；然后以相同方法在微球表面再依次組裝一層帶負(fù)電的聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)和TODA，最后在TODA的表面通過靜電作用力組裝一層CdTe納米晶，這樣，微球表面即形成了 roDA/PSS/PDDA/CdTe層，從而完成了黃色CdTe納米晶的組裝。重復(fù)以上“roDA-PSS-PDDA-CdTe”操作，即可在Ps微球表面組裝多層聚電解質(zhì)/CdTe納米晶復(fù)合層。
[0089]實(shí)施例四:熒光納 米微球檢測卡的制備
[0090]( I)固相硝酸纖維素(NC)膜的活化
[0091]裁取20mmX3-4mm的NC膜，于0.lmol/L的碳二亞胺溶液中浸泡，15min后取出，室溫風(fēng)干8min?？筍VCV多克隆抗體(2mg/ml)包被于固相硝酸纖維素膜的觀察結(jié)果的測試反應(yīng)區(qū)，定義為檢測線(T),包被正常羊抗鼠IgG(2mg/ml)于質(zhì)控區(qū),定義為質(zhì)控線(C)。
[0092]其中，該抗SVCV多克隆抗體可通過以下方法制備得到:
[0093]將實(shí)施例1中制備得到的SVCV glycoprotein作為免疫原，以QuickAntibody-Rabbit5W作為免疫佐劑，免疫劑量為50 μ g/只(50μ g免疫原+50 μ L QuickAntibody-Rabbit5W)，再用生理鹽水補(bǔ)充至lOOul，每針次lOOul，小腿后腿肌肉注射免疫家兔，首免后第21天用同樣的方法進(jìn)行加強(qiáng)免疫，共免疫2次，免疫后第35天耳靜脈采血，分離血清，用表達(dá)蛋白包被的ELISA板檢測抗體效價，如果具有較高的抗體滴度，通過頸動脈放血，收集全血，分離血清。用辛酸硫酸銨法提取IgG，用核酸蛋白測定儀測定蛋白含量，將其稀釋至10mg/mL，置于_80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0094]兔抗血清經(jīng)飽和硫酸銨鹽粗提,透析,再依次過SephadexG25和DEAE纖維素柱進(jìn)一步提純，并將收集的蛋白質(zhì)于透析袋中。置蔗糖或聚乙二醇中濃縮，紫外分光光度計測其280nm、260nm波長處OD值，以公式計算蛋白含量后_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0095]經(jīng)過I次初免，I次加強(qiáng)免疫后，兔抗血清效價可達(dá)1:50000以上，具有很高的抗血清效價。
[0096]其中，多克隆抗體動物種屬來源應(yīng)為非小鼠來源，可為兔、山羊、綿羊、人、豬、馬、牛，制備多克隆的方法可以進(jìn)行簡單替換。
[0097](2)熒光納米微球-抗體復(fù)合物的試的制備與純化:[0098]IOmL標(biāo)記體系的方法如下:燒杯(鉻酸浸泡72h，再用蒸餾水洗滌并浸泡24h，ρΗ5.0的0.02Μ PB緩沖液潤洗30min)中加入8ml0.02M PB緩沖液(pH5.0，下同)，加入熒光納米微球5mg，快速攪拌下加入抗SVCV單克隆抗體3E1至終濃度為0.4~0.8g/L，再緩慢加入10mg/mL EDC38.4uL，再用0.02M PB緩沖液將體系體積補(bǔ)至10mL。室溫緩慢攪拌反應(yīng)2h,再加入Iml 10% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))BSA封閉30min ；8000r/min, 10°C離心IOmin,棄上清，并以PB清洗，相同條件離心，重懸于Iml PBS緩沖液中，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0099](3)微球結(jié)合墊的制備
[0100]裁取20mmX 4mm的玻璃纖維，分別取50 μ L的熒光納米微球抗體復(fù)合物用BIODOT噴點(diǎn)儀按4ul/cm噴涂在玻璃纖維膜上，37°C干燥lh。
[0101](4)檢測卡的組裝
[0102]熒光納米微球檢測試紙條由樣品墊、微球結(jié)合墊、硝酸纖維素膜及吸水紙4個部分組成，在底板上依次搭接地粘貼吸水紙、樣品墊、微球結(jié)合墊、含有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜，樣品墊和微球結(jié)合墊用玻璃纖維，底板為雙面膠聚乙烯塑料板；順序裝配，裁成寬度為4_的檢測檢測試紙。
[0103]本例中熒光納米微球快速檢測試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示，該熒光納米微球快速檢測試紙條，包括樣品墊1、微球結(jié)合墊2、檢測線(T) 3、固相硝酸纖維素膜4、質(zhì)控線(C) 5、吸水紙6以及底板7。其中，底板7 —端粘貼樣品墊1，另一端粘貼吸水紙6，微球結(jié)合墊2是由熒光納米微球標(biāo)記的抗SVCV單克隆抗體復(fù)合物結(jié)合在玻璃纖維膜，其一端置于樣品墊I下，另一端緊密連接固相硝酸纖維素膜4 ;檢測線(T) 3為抗SVCV多克隆抗體；質(zhì)控線(C) 5為羊抗鼠IgG抗體；檢測線(T) 3和質(zhì)控線(C) 5位于固相硝酸纖維素膜底板4的中間；吸水紙6連接固相硝酸纖維素膜4。
[0104]進(jìn)一步的，將上述S VCV熒光納米微球快速檢測試紙條組裝成檢測卡，該檢測卡的結(jié)構(gòu)如圖2所示，將上述試紙條固定在底座8上，試紙條用外殼9壓緊，底座8和外殼9通過卡齒10和卡孔11相連接；底座8上有與外殼9連接的卡齒10和試紙條相匹配的凹槽，試紙條位于所述凹槽內(nèi)；外殼9上有加樣孔12、觀察窗13和與底座卡齒10相配的卡孔11，加樣孔12的位置與試紙條樣品墊的位置相對應(yīng)，觀察窗13與試紙條固相硝酸纖維素膜上的檢測線(T)和質(zhì)控線(C)相對應(yīng)，具體的，觀察窗上印有T和C，分別與固相硝酸纖維素膜上的檢測線(T)和質(zhì)控線(C)相對應(yīng)。
[0105](5)待測樣品的前處理:
[0106]當(dāng)所述樣品為魚類組織時，病毒釋放后，樣品前處理方法為:
[0107]I)取樣方式:表面健康的魚:取腎、脾和腦；有臨床癥狀的魚:體長< 4cm取全魚；體長在4~6cm之間，取包括腎臟和腦在內(nèi)的所有臟器；體長> 6cm，取腎、脾和腦；
[0108]2)取組織6~7g，加入適量已滅菌石英砂，充分研磨，然后加入50mL M199培養(yǎng)基(含10%FBS和100IU/mL青霉素和100 μ g/mL雙氫鏈霉素的雙抗)，轉(zhuǎn)入50ml離心管，4°C孵育過夜。最后取孵育后的細(xì)胞懸液作為檢測樣品。
[0109](6)檢測方法與判斷標(biāo)準(zhǔn)
[0110]將待檢測樣品滴加到檢測卡的加樣孔，水平放置，反應(yīng)5-10min。
[0111]判斷標(biāo)準(zhǔn):在熒光讀取儀中讀取，若只在質(zhì)控線C出現(xiàn)黃色，則表示為陰性；若在檢測卡的質(zhì)控線、檢測線出現(xiàn)黃色，則判定為陽性。[0112]實(shí)施例五:熒光納米微球快速檢測卡的檢測試驗(yàn)
[0113](I)樣品中傳染性造血組織壞死病毒的檢測
[0114]抗體標(biāo)記在熒光納米微球顆粒上，當(dāng)加入樣本后,熒光納米微球標(biāo)記抗體和樣本一起向硝酸纖維素膜方向擴(kuò)散，并最終滲入吸水紙端，擴(kuò)散過程中待檢的SVCV可與熒光納米微球標(biāo)記的抗SVCV單克隆抗體相結(jié)合。當(dāng)樣本中的SVCV超過檢測限時，檢測線(T)顯黃色，多余的熒光納米微球標(biāo)記的單克隆抗體與質(zhì)控線(C)的羊抗鼠IgG 二抗相結(jié)合顯色，C線顯黃色，形成2條黃色印記為陽性；反之，待測樣品中無SVCV時，熒光納米微球標(biāo)記抗體在向硝酸纖維素膜方向擴(kuò)散的過程中，不能與抗SVCV多克隆抗體相結(jié)合，不能形成固相多克隆抗體一抗原一熒光納米微球標(biāo)記抗體復(fù)合物，因此T線不顯色，只能與羊抗鼠IgG 二抗結(jié)合，C線顯黃色，記為陰性；如果硝酸纖維素膜沒有顯示黃色標(biāo)記或C線不顯色，則表明檢測卡失效。
[0115](2)檢測卡的敏感性試驗(yàn):分別將已知病毒陽性細(xì)胞培養(yǎng)液10份經(jīng)過倍比稀釋，分別用檢測卡進(jìn)行檢測，并且與病毒分離試驗(yàn)進(jìn)行敏感性比較，結(jié)果表明檢測卡的靈敏度為 50TCID50, CV 值小于 15%。
[0116](3)檢測卡的特異性試驗(yàn)之阻斷試驗(yàn):檢測SVCV時顯示為陽性，當(dāng)將狗魚彈狀病毒(PFRV)、牙鲆彈狀病毒(HRV)、傳染性胰臟壞死病毒(IPNV)、錦鯉皰疹病毒(KHV)、傳染性造血組織壞死病毒(IHNV)、病毒性出血性敗血病毒(VHSV)、真鯛虹彩病毒(RSIV)、草魚出血病病毒(GCHV)和流行性造血器官壞死病毒(EHNV)等幾種病毒陽性細(xì)胞培養(yǎng)液分別加入檢測卡的加樣孔內(nèi)，靜置反應(yīng)10min后，檢測結(jié)果均為陰性，說明本檢測卡特異性好，結(jié)果見表1，其中“ + ”表示陽性，表示陰性。
[0117]表1.檢測卡的特異性試驗(yàn)
[0118]
【權(quán)利要求】
1.保藏號為CCTCCC201366的雜交瘤細(xì)胞株SVCV-3E1。
2.一種抗鯉春病毒血癥病毒單克隆抗體，其特征在于:所述抗體由保藏號CCTCCC201366的雜交瘤細(xì)胞株SVCV-3E1產(chǎn)生。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株SVCV-3E1在制備鯉春病毒血癥病毒檢測試劑或設(shè)備中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求2所述的抗鯉春病毒血癥病毒單克隆抗體在制備鯉春病毒血癥病毒檢測試劑或設(shè)備中的應(yīng)用。
5.一種鯉春病毒血癥病毒快速檢測試紙條，其特征在于:所述試紙條包含權(quán)利要求2所述的抗鯉春病毒血癥病毒單克隆抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的鯉春病毒血癥病毒快速檢測試紙條，其特征在于:所述的抗鯉春病毒血癥病毒單克隆抗體包附熒光納米微球。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的鯉春病毒血癥病毒快速檢測試紙條在鯉春病毒血癥病毒檢測中的應(yīng)用。
8.一種鯉春病毒血癥病毒檢測試劑盒，其特征在于:該試劑盒包括如權(quán)利要求5或6中所述的鯉春病毒血癥病毒快速檢測試紙條。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒在鯉春病毒血癥病毒檢測中的應(yīng)用。
10.一種用于制備權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株SVCV-3E1的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID N0`.1所示序列。
【文檔編號】C12N5/20GK103509758SQ201310433480
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月22日
【發(fā)明者】鄭曉聰, 鐘松清, 何俊強(qiáng), 譚攀, 賈鵬, 王津津, 史秀杰, 蘭文升, 于力, 謝冬霞, 劉葒 申請人:深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心, 深圳市三方圓生物科技有限公司