一種檢測cyp2d6基因多態(tài)性的試劑盒及方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測CYP2D6基因多態(tài)性的試劑盒及方法，屬于基因測序【技術領域】。所述試劑盒包括檢測用引物，所述檢測用引物包括：CYP2D6基因第1外顯子至第9外顯子的全長擴增特異性引物，以及CYP2D6基因第1外顯子上下游測序引物、CYP2D6基因第2外顯子上下游測序引物、CYP2D6基因第3～4外顯子上下游測序引物、CYP2D6基因第5～7外顯子上下游測序引物和CYP2D6基因第8～9外顯子上下游測序引物中的至少一對。應用該試劑盒及方法進行檢測的檢測時間明顯縮短、工作量顯著下降，本發(fā)明的試劑盒為預測經(jīng)CYP2D6代謝的藥物使用劑量提供了一種全新的快速簡便的手段。
【專利說明】—種檢測CYP2D6基因多態(tài)性的試劑盒及方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及基因測序【技術領域】，具體涉及一種檢測CYP2D6基因多態(tài)性的試劑盒及方法。
【背景技術】
[0002]細胞色素P450 (CYP450)是由亞鐵血紅素-硫醇鹽蛋白組成的主要分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體內(nèi)膜上一類基因家族，除了參與生物體內(nèi)的留醇類激素合成以外，還可以參與體內(nèi)的內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)的代謝。細胞色素P450的結構、功能以及在藥物代謝中的作用在國內(nèi)外均得到了較廣泛的研究。在遺傳藥理學上具有重要意義的細胞色素P450家族中，由CYP2D6基因編碼酶是其成員之一，該基因位于22ql3.1。研究表明在臨床上它參與了如異喹胍(腎上腺素能阻斷藥物)、司巴丁和普羅帕酮(抗心律失常藥物)以及阿米替林(抗抑郁藥)等25%以上的常用藥物的代謝。CYP2D6是所有參與藥物代謝的細胞色素P450基因家族中唯一不能被誘導的酶，已知的等位基因變異就超過了 90個，目前已經(jīng)報道有105種，造成了不同的CYP2D6基因多態(tài)性，CYP2D6基因多態(tài)性具體詳見CYP等位基因數(shù)據(jù)庫(http://www.cypalleles.k1.se),而CYP2D6基因多態(tài)性對酶的個體活性有重要影響，其中某些產(chǎn)生弱代謝表型，使代謝能力下降，如CYP2D6*3、CYP2D6*4、CYP2D6*5、CYP2D6*6、CYP2D6*7等基因多態(tài)性。CYP2D6基因的兩種正?；蛐蜑镃YP2D6*1、CYP2D6*2(C2850T突變)。CYP2D6酶對司巴丁、美托洛爾和異喹胍等藥物的代謝在高加索和東方人中是獨立的，且藥物間不存在相互作用，而對一些非洲人群，上述藥物之間卻存在一定的相互作用，其原因可能是CYP2D6基因多態(tài)性和干擾性藥物、飲食結構等因素的作用。目前，在歐洲人群中共檢測出有53種不同的CYP2D6等位基因。研究表明，異喹胍等藥物慢代謝者是具有某些缺陷等位基因，如CYP2D6*3，由于發(fā)生2549delA，導致編碼蛋白質(zhì)出現(xiàn)框移，致使酶的活性喪失，還如CYP2D6*9，由于發(fā)生三聯(lián)體密碼子2615_2617delAAG缺失，盡管未發(fā)生框移，但導致編碼氨基酸缺乏使產(chǎn)生的活性較低，再比如CYP2D6*4為C100T和G1846A共同突變，CYP2D6*5為整個基因缺失突變，CYP2D6*10為C100T突變，另外，還有些為整個基因的重復突變。研究表明，CYP2D6基因多態(tài)性在不同種族人群中的分布頻率具有較大的差異，在東方人中尚未發(fā)現(xiàn)CYP2D6*3和CYP2D6*4基因多態(tài)性，CYP2D6*5的突變頻率與高加索人和非洲人差不多，但在東方人中發(fā)現(xiàn)了 CYP2D6*10基因多態(tài)性，在東方人群中的突變頻率高達50%，這種基因多態(tài)性是導致東方人CYP2D6酶活性降低的主要原因。
[0003]現(xiàn)有技術中采用直接測序法檢測CYP2D6基因多態(tài)性，即首先采用PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈式反應)擴增不同的目的片段后，回收純化PCR產(chǎn)物，然后進行測序。
[0004]由于直接測序法的檢測時間過長，一般需要48個小時以上，使該檢測的效率降低，因此，為檢測CYP2D6基因多態(tài)性帶來不便。、
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]針對現(xiàn)有技術中檢測CYP2D6基因多態(tài)性的時間長、步驟繁瑣、需要多次PCR的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測CYP2D6基因多態(tài)性的試劑盒。
[0006]本發(fā)明的另一目的在于提供一種檢測CYP2D6基因多態(tài)性的方法。
[0007]為了解決現(xiàn)有技術中檢測CYP2D6基因多態(tài)性的時間長、步驟繁瑣、需要多次PCR的問題，本發(fā)明提采用了以下技術方案:
[0008]一種檢測CYP2D6基因多態(tài)性的試劑盒，包括，其特征在于，所述檢測用引物包括:CYP2D6基因第I外顯子至第9外顯子的全長擴增特異性引物，以及CYP2D6基因第I外顯子上下游測序引物、CYP2D6基因第2外顯子上下游測序引物、CYP2D6基因第3~4外顯子上下游測序引物、CYP2D6基因第5~7外顯子上下游測序引物和CYP2D6基因第8~9外顯子上下游測序引物中的至少一對，其中:
[0009]所述CYP2D6基因第I外顯子至第9外顯子的全長擴增特異性引物的上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；
[0010]所述CYP2D6基因第I外顯子至第9外顯子的全長擴增特異性引物的下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；
[0011]所述CYP2D6基因第I外顯子測序引物的上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:3所示；
[0012]所述CYP2D6基因第I外顯子測序引物的下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:4所示；
[0013]所述CYP2D6基因第2外 顯子測序引物的上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:5所示；
[0014]所述CYP2D6基因第2外顯子測序引物的下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:6所示；
[0015]所述CYP2D6基因第3~4外顯子測序引物的上游引物序列如序列表中SEQ IDN0:7所示；
[0016]所述CYP2D6基因第3~4外顯子測序引物的下游引物序列如序列表中SEQ IDNO:8所示；
[0017]所述CYP2D6基因第5~7外顯子測序引物的上游引物序列如序列表中SEQ IDNO:9所示；
[0018]所述CYP2D6基因第5~7外顯子測序引物的下游引物序列如序列表中SEQ IDNO: 10所示；
[0019]所述CYP2D6基因第8~9外顯子測序引物的上游引物序列如序列表中SEQ IDNO: 11所示；
[0020]所述CYP2D6基因第8~9外顯子測序引物的下游引物序列如序列表中SEQ IDNO: 12所示。
[0021]在上述試劑盒中，作為一種優(yōu)選實施方式，所述試劑盒還包括內(nèi)參基因ACTB以及內(nèi)參基因ACTB擴增引物，其中，
[0022]所述內(nèi)參基因ACTB擴增引物的上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 13所示；
[0023]所述內(nèi)參基因ACTB擴增引物的下游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 14所示；
[0024]所述內(nèi)參基因ACTB的序列如序列表中SEQ ID NO: 15所示。[0025]在上述試劑盒中，作為一種優(yōu)選實施方式，所述試劑盒還包括測序緩沖液，更優(yōu)選地，所述測序緩沖液為Buffer緩沖液,所述Buffer緩沖液的pH為8.3。
[0026]在上述試劑盒中，作為一種優(yōu)選實施方式，所述試劑盒還包括陰性對照和陽性對照，其中，所述陰性對照為去離子水；所述陽性對照為含有CYP2D6*3型的所述CYP2D6基因全長的基因組DNA樣品。
[0027]在上述試劑盒中，作為一種優(yōu)選實施方式，所述試劑盒還包括各種PCR反應試劑或者各種PCR反應試劑的混合物；更優(yōu)選地，所述各種PCR反應試劑包括PCR預混合液、Mg2+(比如氯化鎂)、dNTPs dUTP、Taq酶、BSA、T4噬菌體的基因32編碼蛋白以及無RNase去離子水。
[0028]在上述試劑盒中，作為一種優(yōu)選實施方式，所述試劑盒還包括內(nèi)部陽性控制序列以及內(nèi)部陽性控制序列的擴增引物，其中:所述內(nèi)部陽性控制序列如序列表中SEQ IDNO: 16所示；所述內(nèi)部陽性控制序列的擴增引物的上游引物如序列表中SEQ ID N0:17所示；所述內(nèi)部陽性控制序列的擴增引物的下游引物如序列表中SEQ ID N0:18所示。
[0029]在上述試劑盒中，各種優(yōu)選實施方式可以任意組合。
[0030]一種檢測CYP2D6基因多態(tài)性的方法，包括如下步驟:
[0031]步驟一，提取受檢者基因組DNA;
[0032]步驟二，以步驟一得到的基因組DNA為模板，采用如序列表中SEQ ID NO:1所示的上游引物和如序列表中SEQ ID NO: 2所示的下游引物，對CYP2D6基因第I外顯子至第9外顯子的全長序列進行PCR擴增；
[0033]步驟三，對步驟二的PCR擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳，并回收純化得到的CYP2D6基因第I外顯子至第9外顯子的DNA片段；
[0034]步驟四，以步驟三回收純化后得到的CYP2D6基因第I外顯子至第9外顯子的DNA片段為模板，采用如序列表中SEQ ID NO:3所示的上游引物和SEQ ID N0:4所示的下游引物、SEQ ID NO:5所示的上游引物和SEQ ID NO:6所示的下游引物、SEQ ID N0:7所示的上游引物和SEQ ID N0:8所示的下游引物、SEQ ID NO:9所示的上游引物和SEQ ID NO: 10所示的下游引物以及SEQ ID NO: 11所示的上游引物和SEQ ID NO: 11所示的下游引物中的至少一對上下游測序引物進行測序反應；
[0035]步驟五，將步驟四得到的測序反應產(chǎn)物純化后上測序儀進行測序，將測得序列在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中進行比對分析以獲得CYP2D6基因多態(tài)性。
[0036]在上述方法中，作為一種優(yōu)選實施方式，在所述步驟二中，所述PCR的反應條件如下:先經(jīng)過95°C 3min;然后進入PCR循環(huán)，所述PCR循環(huán)為95 °C 30s, 57 °C 3.6min、72°C 3min，共35個循環(huán)；最后72°C IOmin0更優(yōu)選地，所述PCR的反應液中部分組分及濃度如下:1 X 的 PCR 預混合液、Mg2+:2.5-4.0mM, dNTPs:0.2-0.4mM、dUTP:0.3-0.6mM、Taq 酶:
0.2υ/μ L、BSA:1.25wt%、T4 噬菌體的基因 32 編碼蛋白:lnmol/L。
[0037]在上述方法中，作為一種優(yōu)選實施方式，在所述步驟四中，所述測序反應的條件如下:先98°C變性2min，然后進行PCR循環(huán)，PCR循環(huán)參數(shù)為96°C 10s，50°C 5s, 60°C 4min，共25個循環(huán)。
[0038]在上述方法中，作為一種優(yōu)選實施方式，在所述步驟二中，所述PCR反應中還加入了如序列表中SEQ ID NO: 16所示的內(nèi)部陽性控制序列、如序列表中SEQ ID NO: 17所示的內(nèi)部陽性控制序列的擴增引物的上游引物以及如序列表中SEQ ID NO: 18所示的內(nèi)部陽性控制序列的擴增引物的下游引物。 [0039]本發(fā)明試劑盒及檢測方法的優(yōu)點和效果如下:
[0040](I)敏感性高:可以同時檢測出目前報道的105種CYP2D6基因多態(tài)性
[0041](2)特異性強:使用特異性引物擴增CYP2D6基因全長，然后進行測序，對特定的分子進行識別，準確性高，特異性好、假陽性低，可達到直接測序法的準確度，甚至比直接測序法更準確。
[0042](3)簡便安全:操作簡單、安全，只需一次PCR擴增后可以同時進行多個外顯子測序檢測多態(tài)性，極大地減少了檢測環(huán)節(jié)，降低了污染的可能性。
[0043](4)全程監(jiān)控:本發(fā)明實施例提供的試劑盒引入了內(nèi)部陽性控制質(zhì)量控制體系，對檢測過程進行全程質(zhì)量監(jiān)控，有效避免假陽性或者假陰性。
[0044](5)快速:速度快、高通量，只需一次性擴增CYP2D6基因全長，而無需對CYP2D6基因每個外顯子進行擴增，極大地降低了勞動強度，節(jié)省了檢測時間，可在8小時內(nèi)完成。
[0045]本發(fā)明提供的檢測CYP2D6基因多態(tài)性的試劑盒及方法，利用長片段PCR測序法快速、準確的檢測目前報道的105種CYP2D6基因多態(tài)性，有效杜絕了假陽性和假陰性的發(fā)生，用于經(jīng)CYP2D6代謝的藥物的使用劑量的預測并為藥物的選擇提供了重要的手段。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0046]為了更清楚地說明本發(fā)明實施例中的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0047]圖1是本發(fā)明實施例2提供的采用實施例1試劑盒的引物對擴增受檢者外周血DNA PCR產(chǎn)物凝膠電泳結果，其片段大小與預計的核酸片段大小一致，其中擴增結果對應為:第一條帶為Marker，第二條帶為基因全長，第三條帶為內(nèi)參基因ACTB，第四條帶為第一外顯子，第五條帶為第三外顯子，第六條帶為第五外顯子，第七條帶為第六外顯子，第八條帶為第九外顯子，第十條帶為陰性對照；圖2是本發(fā)明實施例2提供的采用實施例1試劑盒的CYP2D6基因第I外顯子上游測序引物進行測序后所得的結果，在第I外顯子核酸序列100堿基處發(fā)生了 100CXT，提示為CYP2D6基因多態(tài)性10* ；
[0048]圖3是本發(fā)明實施例2提供的采用實施例1試劑盒的CYP2D6基因第6外顯子上游測序引物進行測序后所得的結果，在第6外顯子核酸序列2850堿基處發(fā)生了 2850C>T，提示為CYP2D6基因多態(tài)性2*。
【具體實施方式】
[0049]為使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面結合附圖對本發(fā)明實施方式作進一步地詳細描述。下面實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常為本領域常規(guī)方法，如按照常規(guī)實驗條件如SambiOOk等人，分子克隆，實驗手冊(第三版)(科學出版社，2002)中所述的條件，或按照試劑制造廠家所建議的條件。
[0050]實施例1.試劑盒的制備[0051]1、內(nèi)參基因ACTB以及CYP2D6基因的引物設計
[0052]根據(jù)基因序列內(nèi)參基因ACTB序列和CYP2D6基因序列來源于美國國家生物技術信息中心核酸數(shù)據(jù)庫(NCBI)，其中內(nèi)參基因ACTB ID為60，參考序列號為NG_007992.1，也可參見本發(fā)明序列表中SEQ ID NO: 15 ；CYP2D6基因ID為1565，參考序列號為NG_008376.2，采用Primer5.0引物設計軟件分別設計內(nèi)參基因ACTB和CYP2D6基因的特異引物，包括:CYP2D6基因第I外顯子至第9外顯子的全長擴增特異性引物的上下游引物；CYP2D6基因第I外顯子測序引物的上下游引物；CYP2D6基因第2外顯子測序引物的上下游引物；CYP2D6基因第3~4外顯子測序引物的上下游引物；CYP2D6基因第5~7外顯子測序引物的上下游引物；CYP2D6基因第8~9外顯子測序引物的上下游引物；內(nèi)參基因ACTB擴增上下游引物。其中如CYP2D6基因第I外顯子上下游引物和CYP2D6基因第9外顯子引物用于鑒別CYP2D6*10基因多態(tài)性，CYP2D6基因第3外顯子上下游引物用于鑒別CYP2D6*4、CYP2D6*6和CYP2D6*8基因多態(tài)性，CYP2D6基因第5外顯子上下游引物用于鑒別CYP2D6*9基因多態(tài)性，CYP2D6基因第6外顯子上下游引物用于鑒別CYP2D6*3基因多態(tài)性，CYP2D6基因全長擴增引物除了用于擴增CYP2D6基因全長外，也同時用于鑒別CYP2D6*5基因多態(tài)性，共計能夠檢測105種CYP2D6基因型，其中，105種CYP2D6基因多態(tài)性具體詳見CYP等位基因數(shù)據(jù)庫(http://www.cypalleles.k1.se)。
[0053]通過上述引物設計得到:
[0054]CYP2D6基因第I外顯子至第9外顯子的全長擴增特異性引物的上下游引物分另Ij 為 5’ -TGGCAGCACAGTCAACACAG-3，(如序列表中 SEQ ID NO:1 所示)、5’-GGAACTACCACATTGCTTTATTG-3’(如序列表中 SEQ ID NO:2 所示)。
[0055]CYP2D6基因第I外顯子測序引物的上下游引物分另Ij為 5’ -TGCTGAGAGTGTCCTGCCT-3’(如序列表中 SEQ ID NO: 3 所示)、5’ -TTTCACCCACCACCCATGTTT-3’(如序列表中 SEQ ID N0:4 所示)。
[0056]CYP2D6基因第2外顯子測序引物的上下游引物分另Ij為 5’ -ATAGGGTTGGAGTGGGTGGT-3’(如序列表中 SEQ ID NO: 5 所示)、5’ -TCACGGCTTTGTCCAAGAGA-3’(如序列表中 SEQ ID N0:6 所示)。
[0057]CYP2D6基因第3~4外顯子測序引物的上下游引物分別為 5’ -TGAGACTTGTCCAGGTGAACG-3’(如序列表中 SEQ ID NO: 7 所示)、5’-TCAACCCACCACCCTTGC-3’(如序列表中 SEQ ID N0:8 所示)。
[0058]CYP2D6基因第5~7外顯子測序引物的上下游引物分別為 5’ -GCAGAATTGGAGGTCATTTGG-3’(如序列表中 SEQ ID NO: 9 所示)、5’-TGTCCCAGCAAAGTTCATGG-3’(如序列表中 SEQ ID NO: 10 所示)。
[0059]CYP2D6基因第8~9外顯子測序引物的上下游引物分別為5’-TATCACCCAGGAGCCAGG-3’(如序列表中 SEQ ID NO: 11 所示)、5’-CACATTGCTTTATTGTACATTAGAGCC-3’ (如序列表中 SEQ ID NO: 12 所示)。
[0060]內(nèi)參基因ACTB擴增上下游引物分別為5’-CGATTTCTCGCAGCTCACCAT-3’(如序列表中 SEQ ID N0:13 所示)、5’-AATACACACTCCAAGGCCGC-3’ (如序列表中 SEQ ID NO: 14 所示)。
[0061]2、內(nèi)部陽性控制序列及其引物的設計
[0062]該內(nèi)部陽性控制序列包含CYP2D6基因部分序列和一部分人工合成序列，如序列表中SEQ ID NO: 16所示。
[0063]采用Primer5.0引物設計軟件并按照上述引物設計原則設計出上述內(nèi)部陽性控制序列的上下游引物分別為:5’-GCGCGTGACACTGCTACATG-3’(如序列表中SEQ ID NO: 17所示)、5’ -TCGAGTAGCTGAGACTGCGT-3’(如序列表中 SEQ ID NO: 18 所示)。
[0064]3、試劑盒的組成及制備
[0065]①基因組DNA提取試劑:該提取試劑為本領域常用試劑，本實施例采用組織基因組DNA提取試劑盒(Qiagen公司，貨號:69504)中的試劑。
[0066]②引物:包括上述CYP2D6基因第I外顯子至第9外顯子的全長擴增上下游引物、上述CYP2D6基因第I外顯子上下游測序引物、上述CYP2D6基因第2外顯子上下游測序引物、上述CYP2D6基因第3~4外顯子上下游測序引物、上述CYP2D6基因第5~7外顯子上下游測序引物、上述CYP2D6基因第8~9外顯子上下游測序引物、上述內(nèi)部陽性控制序列上下游引物和上述內(nèi)參基因ACTB的上下游引物。
[0067]③上述內(nèi)參基因ACTB以及內(nèi)部陽性控制序列。
[0068]上述引物序列、內(nèi)部陽性控制序列和內(nèi)參基因ACTB序列由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。
[0069]④陰性對照和陽性對照:以去離子水為陰性對照，以含有CYP2D6基因CYP2D6*3多態(tài)性的基因組DNA樣品為陽性對照；
[0070]陽性對照的制備:采用組織基因組DNA提取試劑盒(Qiagen公司，貨號:69504)快速提取已經(jīng)確診的含有CYP2D6基因CYP2D6*3多態(tài)性的0.5ml受檢者外周血基因組DNA，作為陽性對照。
[0071]⑤各種PCR反應試劑:PCR預混合液，本實施例中選用2 XPCR Premix (Qiagen公司，產(chǎn)品貨號:210212) ;Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq 酶、BSA (Albumin from bovine serum,牛血清白蛋白)、T4噬菌體的基因32編碼蛋白、無RNase去離子水。
[0072]⑥測序緩沖液,pH為8.3的Buffer緩沖液,其Buffer緩沖液的配制:1 μ IBigdye和 3 μ 15χ 含 IOmM MgCl2 的 400mM Tris 溶液。
[0073]實施例2.用實施例1制備的試劑盒檢測CYP2D6基因多態(tài)性
[0074]以隨機檢測30例受檢者外周血標本結果為例。
[0075]用本發(fā)明的試劑盒檢測人群中CYP2D6基因多態(tài)性的檢測流程為:首先，獲取臨床受檢者外周血樣本，快速提取基因組DNA ;其次，先配制內(nèi)參基因ACTB的PCR反應液，然后加入濃度均為2ng/l. I的內(nèi)參基因ACTB序列和內(nèi)部陽性控制序列各2 μ 1，進行PCR擴增，PCR結束后在濃度為2%的瓊脂糖DNA凝膠中進行電泳，查看PCR擴增情況。如果內(nèi)參基因ACTB的PCR擴增產(chǎn)物中存在390bp和800bp左右的兩個條帶，提示整個檢測過程有效，如果缺少一條或二條帶，提示檢測失敗，則需要重新進行檢測。再次，如果通過內(nèi)參基因ACTB的PCR結果證明檢測過程有效，則配制CYP2D6基因全長擴增PCR反應液和陰性、陽性反應液，前者中加入2μ I提取的受檢者外周血基因組DNA，后者分別加入2ul去離子水和陽性樣品DNA，并各加入濃度為2ng/ul內(nèi)部陽性控制序列2ul，進行PCR擴增，PCR擴增結束后在濃度為2%的瓊脂糖DNA凝膠電泳上成像，查看PCR擴增情況。受檢者外周血標本應為4500bp和390bp左右條帶各一個，陽性對照組為300bp和390bp左右條帶各一個，陰性對照組為390bp條帶I個。最后，PCR擴增結果采用軟件分析，并標化計算樣本數(shù)據(jù)。[0076]最后，回收純化PCR產(chǎn)物以得到受檢者CYP2D6基因第I外顯子至第9外顯子的DNA片段，將該DNA片段用于測序反應的模板，配制PCR測序反應液后進行PCR測序反應，將PCR測序反應物純化后上測序儀進行測序。
[0077]CYP2D6基因多態(tài)性的具體檢測步驟如下:
[0078]①受檢者外周血基因組DNA的抽提:采用實施例1試劑盒中的基因組DNA提取試劑按DNA抽提純化的方法快速提取0.5ml受檢者外周血基因組DNA。
[0079]②將上述提取的受檢者外周血基因組DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，通過紫外分光光度計測定260nm與280nm光密度值計算DNA的純度與濃度，用無菌去離子水調(diào)節(jié)抽提的DNA至相同濃度，置冰箱_20°C保存。
[0080]③將實施例1試劑盒中的內(nèi)部陽性控制序列標準品和內(nèi)參基因ACTB標準品分別稀釋至濃度為2ng/y l。
[0081 ] ④內(nèi)參基因ACTB的PCR擴增:
[0082]PCR反應體系為20 μ L，在該反應體系中各成分及終濃度如下:1Χ的PCR預混合液(Qiagen 公司，產(chǎn)品貨號:210212, 2XPCR Premix, 10.0μ L)、Mg2+:3mM ； dNTPs:0.3mM ；dUTP:0.5mM ；Taq 酶:0.2U/μ L ；BSA:1.25wt% ；T4 噬菌體的基因 32 編碼蛋白:lnmol/L ；內(nèi)參基因ACTB上、下游引物均為:0.25pmol/yL;內(nèi)部陽性控制序列上、下游引物均為:0.25pmol/ μ L ;內(nèi)部陽性控制序列:0.3pmol/ μ L ;內(nèi)參基因ACTB序列:0.2ng/ μ I ;其余為無RNase去離子水。
[0083]在ABI9700PCR儀器上進行PCR擴增，PCR反應程序為:先經(jīng)過95°C 3min,然后95°C 30s, 57°C 3.6min，72°C 3min，35 個循環(huán)，最后 72°C IOmin0
[0084]PCR擴增結束后在濃度為2%的瓊脂糖DNA凝膠電泳上成像。如圖1的第三條帶所示，存在390bp和SOObp左右的兩個條帶，提示整個檢測過程有效，因此可以進行以下操作。
[0085]⑤CYP2D6基因第I外顯子至第9外顯子的全長PCR擴增:
[0086]PCR反應體系為20 μ L，在該反應體系中各成分及終濃度如下:1Χ的PCR預混合液(Qiagen 公司，產(chǎn)品貨號:210212, 2 XPCR Premix, 10.0μ L) ；Mg2+:3mM ； dNTPs:0.3mM ；dUTP:0.5mM ；Taq 酶:0.2U/μ L ；BSA:1.25wt% ；T4 噬菌體的基因 32 編碼蛋白:lnmol/L ；CYP2D6基因第I外顯子至第9外顯子的全長擴增特異性上、下游引物均為0.25pmol/yL ；內(nèi)部陽性控制序列上、下游引物均為0.25pm0l/y L ;內(nèi)部陽性控制序列:0.3pmol/yL ;受檢者外周血基因組DNA的用量為2 μ L ;其余為無RNase去離子水。
[0087]在CYP2D6基因第I外顯子至第9外顯子的全長PCR擴增的同時設置陽性對照和陰性對照，陽性對照和陰性對照的反應體系均為20 μ L，在該反應體系中各成分及終濃度如下:1Χ 的 PCR 預混合液(Qiagen 公司，產(chǎn)品貨號:210212, 2XPCR Premix, 10.0 μ L) ；Mg2+:3mM ；dNTPs:0.3mM ；dUTP:0.5mM ；Taq S1:0.2U/μ L ；BSA:1.25wt% ;T4 噬菌體的基因 32 編碼蛋白:lnmol/L ;內(nèi)參基因ACTB擴增上、下游引物均為:0.25pmol/μ L ;內(nèi)部陽性控制序列上、下游引物均為0.25pm0l/y L ;內(nèi)部陽性控制序列:0.3pmol/yL ;陽性樣品或者陰性樣品的用量為2 μ L,其余為無RNase去離子水。
[0088]在ABI9700PCR儀器上進行PCR擴增，PCR反應程序為:先經(jīng)過95°C 3min,然后95°C 30s, 57°C 3.6min，72°C 3min，35 個循環(huán)，最后 72°C IOmin0
[0089]PCR擴增結束后在濃度為2%的瓊脂糖DNA凝膠電泳上成像。以其中一個受檢者的PCR結果為例，如圖1第二條帶所示，受檢者外周血標本有4500bp和390bp左右條帶各一個，陽性對照組有300bp和390bp左右條帶各一個，陰性對照組有390bp條帶I個。
[0090]⑥分別切取CYP2D6基因全長PCR產(chǎn)物和內(nèi)部陽性控制序列PCR產(chǎn)物，利用Axy公司DNA凝膠回收試劑盒回收純化擴增的DNA片段。
[0091]⑦測序反應液的配制:取4 μ I Buffer測序緩沖液，濃度均為lpmol/Ι的CYP2D6基因第I外顯子上下游測序引物各I μ 1、濃度均為lpmol/Ι的CYP2D6基因第2外顯子上下游測序引物各I μ 1、濃度均為lpmol/Ι的CYP2D6基因第3~4外顯子上下游測序引物各I μ 1、濃度均為lpmol/Ι的CYP2D6基因第5~7外顯子上下游測序引物各I μ 1、濃度均為lpmol/Ι的CYP2D6基因第8~9外顯子上下游測序引物各I μ 1，再加入I μ 12ng/y I的步驟⑥純化得到的CYP2D6基因全長DNA ；
[0092]在ABI9700儀器上先98°C變性2min，然后進行PCR循環(huán)，PCR循環(huán)參數(shù)為96°C 10s，50°C 5s, 60°C 4min，25個循環(huán)，擴增結束后設置4°C保溫。
[0093]⑧采用醋酸鈉/乙醇法純化步驟⑦的測序反應產(chǎn)物，按照ABI3130測序儀的操作說明進行測序⑨數(shù)據(jù)收集處理和分析:將所測得序列在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中進行比對分析，分析CYP2D6基因多態(tài)性，結果參見表1。
[0094]表1為長片段PCR測序法分析受檢者外周血基因組中CYP2D6基因多態(tài)性
[0095]
【權利要求】
1.一種檢測CYP2D6基因多態(tài)性的試劑盒，包括檢測用引物，其特征在于，所述檢測用引物包括:CYP2D6基因第I外顯子至第9外顯子的全長擴增特異性引物，以及CYP2D6基因第I外顯子上下游測序引物、CYP2D6基因第2外顯子上下游測序引物、CYP2D6基因第3~4外顯子上下游測序引物、CYP2D6基因第5~7外顯子上下游測序引物和CYP2D6基因第8~9外顯子上下游測序引物中的至少一對，其中: 所述CYP2D6基因第I外顯子至第9外顯子的全長擴增特異性引物的上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:1所示； 所述CYP2D6基因第I外顯子至第9外顯子的全長擴增特異性引物的下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:2所示； 所述CYP2D6基因第I外顯子測序引物的上游引物序列如序列表中SEQ ID N0:3所示； 所述CYP2D6基因第I外顯子測序引物的下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:4所示； 所述CYP2D6基因第2外顯子測序引物的上游引物序列如序列表中SEQ ID N0:5所示； 所述CYP2D6基因第2外顯子測序引物的下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:6所示； 所述CYP2D6基因第3~4外顯子測序引物的上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:7 所示； 所述CYP2D6基因第3~4外顯子測序引物的下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:8所示； 所述CYP2D6基因第5~7外顯子測序引物的上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:9所示； 所述CYP2D6基因第5~7外顯子測序引物的下游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 10所示； 所述CYP2D6基因第8~9外顯子測序引物的上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 11所示； 所述CYP2D6基因第8~9外顯子測序引物的下游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 12所示。
2.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括內(nèi)參基因ACTB以及內(nèi)參基因ACTB擴增引物，其中， 所述內(nèi)參基因ACTB擴增引物的上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 13所示； 所述內(nèi)參基因ACTB擴增引物的下游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 14所示； 所述內(nèi)參基因ACTB的序列如序列表中SEQ ID NO: 15所示。
3.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括測序緩沖液，優(yōu)選地，所述測序緩沖液為Buffer緩沖液,所述Buffer緩沖液的pH為8.3。
4.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括陰性對照和陽性對照，其中，所述陰性對照為去離子水；所述陽性對照為含有CYP2D6*3型的所述CYP2D6基因全長的基因組DNA樣品。
5.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括各種PCR反應試劑或者各種PCR反應試劑的混合物，優(yōu)選地，所述各種PCR反應試劑包括PCR預混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq酶、BSA、T4噬菌體的基因32編碼蛋白以及無RNase去離子水。
6.根據(jù)權利要求1-5任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括內(nèi)部陽性控制序列以及內(nèi)部陽性控制序列的擴增引物，其中: 所述內(nèi)部陽性控制序列如序列表中SEQ ID NO: 16所示； 所述內(nèi)部陽性控制序列的擴增引物的上游引物如序列表中SEQ ID N0:17所示；所述內(nèi)部陽性控制序列的擴增引物的下游引物如序列表中SEQ ID NO: 18所示。
7.一種檢測CYP2D6基因多態(tài)性的方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟一，提取受檢者基因組DNA ； 步驟二，以步驟一得到的基因組DNA為模板，采用如序列表中SEQ ID N0:1所示的上游引物和如序列表中SEQ ID NO: 2所示的下游引物，對CYP2D6基因第I外顯子至第9外顯子的全長序列進行PCR擴增； 步驟三，對步驟二的PCR擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳，并回收純化得到的CYP2D6基因第I外顯子至第9外顯子的DNA片段；步驟四，以步驟三回收純化后得到的CYP2D6基因第I外顯子至第9外顯子的DNA片段為模板，采用如序列表中SEQ ID NO: 3所示的上游引物和SEQID N0:4所示的下游引物、SEQ ID NO:5所示的上游引物和SEQ ID N0:6所示的下游引物、SEQ ID NO: 7所示的上游引物和SEQ ID NO:8所示的下游引物、SEQ ID N0:9所示的上游引物和SEQ ID NO: 10所示的下游引物以及SEQ ID NO: 11所示的上游引物和SEQ ID NO: 11所示的下游引物中的至少一對上下游測序引物進行測序反應； 步驟五，將步驟四得到的測序反應產(chǎn)物純化后上測序儀進行測序，將測得序列在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中進行比對分析 以獲得CYP2D6基因多態(tài)性。
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于，在所述步驟二中，所述PCR的反應條件如下:先經(jīng)過95°C 3min ;然后進入PCR循環(huán)，所述PCR循環(huán)為95°C 30s,57°C 3.6min、72°C 3min，共 35 個循環(huán)；最后 72°C IOmin0
9.根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于，在所述步驟四中，所述測序反應的條件如下:先98°C變性2min，然后進行PCR循環(huán)，PCR循環(huán)參數(shù)為96°C 10s，50°C 5s, 60°C 4min，共25個循環(huán)。
10.根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于，在所述步驟二中，所述PCR反應中還加入了如序列表中SEQ ID NO: 16所示的內(nèi)部陽性控制序列、如序列表中SEQ ID NO: 17所示的內(nèi)部陽性控制序列的擴增引物的上游引物以及如序列表中SEQ ID NO: 18所示的內(nèi)部陽性控制序列的擴增引物的下游引物。
【文檔編號】C12Q1/68GK103468815SQ201310433443
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月22日 優(yōu)先權日:2013年9月22日
【發(fā)明者】劉輝 申請人:劉輝