抗ihnv單克隆抗體6g7及其制備與應用的制作方法

抗ihnv單克隆抗體6g7及其制備與應用的制作方法
【專利摘要】本申請公開了一種抗傳染性造血組織壞死病毒（IHNV）單克隆抗體6G7，及其制備和應用。該單克隆抗體6G7由雜交瘤細胞株IHNV-6G7分泌，該細胞株的保藏號為CCTCC?C201360。該雜交瘤細胞株IHNV-6G7能穩(wěn)定產生單克隆抗體6G7，該抗體具有抗體效價高、靈敏度高、特異性強、與天然抗原的親和力強等優(yōu)點。本申請還提供了一種包含該單克隆抗體的快速檢測試紙條及其試劑盒，其采用熒光納米微球免疫層析檢測技術，具有良好的靈敏度、特異性，穩(wěn)定性、重復性和再現性等特點。同時，該試紙條和試劑盒使用簡單方便、檢測速度快、可滿足食品安全、屠宰、檢測機構等的檢測要求，適用于現場檢測。
【專利說明】抗IHNV單克隆抗體6G7及其制備與應用
【技術領域】
[0001]本申請涉及傳染性造血組織壞死病毒檢測領域，特別涉及一種抗傳染性造血組織壞死病毒(IHNV)單克隆抗體6G7及其制備與應用。
【背景技術】
[0002]魚傳染性造血器官壞死病(或稱傳染性造血器官壞死病，infectioushaematopoietic necrosis of fish,IHN)是由一種毒力很強的彈狀病毒，即傳染性造血器官壞死病毒血癥病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus,簡稱IHNV)所引起的急性、全身性的嚴重傳染病，致病因子IHNV病毒粒子呈彈狀，有囊膜，其內表面為基質蛋白(M)，囊膜上有糖蛋白(G)突起膜內有基質蛋白、核蛋白、聚合酶等，侵染的主要靶器官是腎造血組織。這種爆發(fā)性疾病最早流行于北美太平洋西北養(yǎng)殖場的鮭科魚類稚幼魚，后來在日本、歐洲和朝鮮也曾檢測到。1988年在中國東北地區(qū)各養(yǎng)鱒場陸續(xù)發(fā)現該病毒，最近在深圳和北京2個水產養(yǎng)殖場牙鲆、虹鱒及從美國進口的匙吻鱘卵中也檢測到IHNV的存在。
[0003]IHNV主要感染鮭、鱒魚，敏感寄主通常為稚幼魚，一般認為成魚比稚幼魚難以感染，成魚一般不表現臨床癥狀，成為病毒的終身攜帶者，在苗種期感染IHNV后殘留的帶病毒魚是主要傳染源，病毒可隨著糞、尿、性腺產物排入水中。病毒放到水中或拌在飼料中投喂均可引起發(fā)病。感染IHNV的病魚典型體表癥狀為厭食嗜睡、異常游動、眼突出、體色發(fā)黑、腹部積水，鰭條基部和肛門周圍充血，肛門外有白色不透明糞便，有些感染該病毒后存活的魚脊柱變形。解剖病魚可見肝臟、脾臟、腎臟、腸道等充血，并有卡他性炎癥，體腔內有積水，鰓及內臟顏色變淡；口腔、骨骼肌、脂肪組織、腹膜、腦膜、鰾和心包膜常有出血斑點，腸出血，魚苗的卵黃囊也會出血、因充滿漿液而膨大，腸道內常常沒有食物。顯微鏡檢結果表明，腎臟、造血組織、胰臟、腸道和腎上腺皮質出現退化和壞死；胃、腸固有膜的顆粒細胞、部分胰腺及胰島細胞也會發(fā)生變性和壞死。
[0004]IHN被國際獸疫局列為必須申報的疾病，是魚類口岸第I類檢疫對象，被我國列為二類動物疫病。
[0005]防止IHNV的傳播是控制IHN發(fā)生的重要環(huán)節(jié)，而加強檢疫是防止IHNV傳播的關鍵，因此應用靈敏、有效、快速的病毒檢測技術非常重要。目前，IHNV的檢測技術主要有細胞培養(yǎng)、免疫學技術、核酸雜交技術、核酸擴增技術(RT-PCR、Real-time RT-PCR、等溫擴增技術)等。采用核酸檢測技術，如專利CN1687447 (2005)，公開了用RT-PCR法同步檢測三種魚病病毒的試劑盒及其檢測方法；專利CN102212620A (2011)公開了檢測三種魚類彈狀病毒的測量審核用試劑盒，為用PCR方法檢測此三種病毒的準確性提供了測評基準。然而，以上檢查方法均需要一定的條件和技術，或因為需要特殊儀器，或因為費用昂貴等，其現場檢測推廣及多次重復追蹤復查受到限制。此外，采用免疫學技術檢測，如專利US20050163795A1和“朱旭等，傳染性造血器官壞死病毒糖蛋白抗血清的制備及應用，《漁業(yè)科學進展》，201206 (33)”采用IHNV-G蛋白(表達蛋白)作為抗原，制備抗體，檢測IHNV，卻仍存在不能確保IHNV-G蛋白有很好的抗原性，或抗原活性蛋白含量低、抗體特異性差的缺點。
[0006]突光微球(fluorescent microspheres, FMs)是指將突光染料通過物理和化學等方法吸附或包埋到粒子內而形成的直徑在納米至微米級0.01-1Oum范圍內受激發(fā)光源激發(fā)能發(fā)出熒光的固體微粒。相比膠體金等傳統(tǒng)標記物須大量聚集才會被辨別出，它的發(fā)光強度可以隨激發(fā)光的強度增強而增強，所以熒光微球標記有望提高免疫層析技術的檢測限。在微球殼結構的作用下，熒光微球具有相對穩(wěn)定的形態(tài)結構、粒度均一、單分散性好、穩(wěn)定性好、發(fā)光效率高重復性好、有較好的生物相容性。形成微球后染料熒光猝滅大大減少，發(fā)射強而穩(wěn)定且基本不受外界環(huán)境介質變化的影響，因此熒光微球作為標記物的免疫層析技術有較高的研究價值與前景，并且操作簡單快捷、結果清晰易于判斷、無需復雜的實驗技能和特殊設備，特別適于現場檢測。因此，研究開發(fā)適合于快速檢測用的抗IHNV單克隆抗體具有重要意義。

【發(fā)明內容】

[0007]本申請的一個目的是提供一種適用于快速檢測的抗傳染性造血組織壞死病毒(IHNV)單克隆抗體。
[0008]本申請的另一個目的是提供該單克隆抗體在傳染性造血組織壞死病毒檢測中的應用，特別的提供了一種特異性高、靈敏度高的傳染性造血組織壞死病毒(IHNV)快速檢測試紙條及其試劑盒。
[0009]為了實現上述目的，本申請采用了以下技術方案:
[0010]本申請公開了一種可產生抗傳染性造血組織壞死病毒(IHNV)單克隆抗體的雜交瘤細胞株IHNV-6G7，該細胞株已于2013年6月6日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC )，保藏號為 CCTCC C201360。
[0011]本申請公開了一種由上述保藏號CCTCC C201360的雜交瘤細胞株IHNV-6G7產生的抗IHNV單克隆抗體，在本申請中也將該抗體稱為抗IHNV單克隆抗體6G7(或簡稱為單克隆抗體6G7)。
[0012]本申請同時公開了保藏號CCTCC C201360的雜交瘤細胞株IHNV-6G7在制備IHNV檢測試劑或設備中的應用。
[0013]本申請還公開了上述抗IHNV單克隆抗體6G7在制備IHNV檢測試劑或設備中的應用
[0014]本申請?zhí)峁┝艘环NIHNV快速檢測試紙條，該試紙條包含上述抗IHNV單克隆抗體6G7。
[0015]進一步的，上述IHNV快速檢測試紙條中，抗IHNV單克隆抗體6G7包附熒光納米微球。
[0016]本申請還提供了一種IHNV檢測試劑盒，該試劑盒包括上述IHNV快速檢測試紙條，例如可由上述IHNV快速檢測試紙條組裝而成。
[0017]本申請還提供了上述IHNV快速檢測試紙條或IHNV檢測試劑盒在IHNV檢測中的應用。
[0018]此外，本申請還提供了一種用于制備上述保藏號為CCTCC C201360的雜交瘤細胞株IHNV-6G7的蛋白，該蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID N0.2所示的序列。[0019]由于采用了上述技術方案，本申請的有益效果在于:
[0020]本申請?zhí)峁┑碾s交瘤細胞株IHNV-6G7能穩(wěn)定產生抗IHNV單克隆抗體6G7，該抗體特異性強、親和性好、靈敏度高，可應用于IHNV快速檢測領域。
[0021]同時，本申請?zhí)峁┝艘环NIHNV快速檢測試紙條及其試劑盒，將熒光納米微球檢測技術應用到IHNV的檢測領域。該試紙條具有特異性強、敏感性高、穩(wěn)定性好、靈敏度高、可重復性和再現性等優(yōu)點，同時，其還具備檢測速度快、檢測時間短、操作簡單、結果穩(wěn)定且直觀等優(yōu)勢，能滿足食品安全、屠宰 、檢測機構的檢測要求，適用于現場檢測。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為本申請【具體實施方式】中的一種傳染性造血組織壞死病毒快速檢測試紙條的結構不意圖；
[0023]圖2為本申請【具體實施方式】中的一種傳染性造血組織壞死病毒快速檢測卡的結構示意圖；
[0024]圖3為本申請【具體實施方式】中的實施例1中融合蛋白的原核表達定位分析結果圖(12h)；
[0025]圖4為本申請【具體實施方式】中的實施例1中融合蛋白的原核表達純化分析結果圖(12h)。
[0026]保藏信息
[0027]培養(yǎng)物名稱:雜交瘤細胞株IHNV-6G7。
[0028]保藏日期:2013年6月6日
[0029]保藏單位:湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學保藏中心，即中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)
[0030]保藏編號:CCTCCC C201360【具體實施方式】
[0031]本申請采用序列如SEQ ID N0.2所示的蛋白IHNV glycoprotein作為免疫原,制備得到了雜交瘤細胞株IHNV-6G7。該雜交瘤細胞株細胞染色體穩(wěn)定，能穩(wěn)定、高表達的分泌出具有高抗原親和力、高特異性、效價高的抗IHNV單克隆抗體6G7。具體的，該單抗可由上述雜交瘤細胞株通過注射Balb/c小鼠腹腔，誘生腹水,通過辛酸-硫酸銨純化而大量獲得。該抗IHNV單克隆抗體6G7具有較好的抗原性，與天然抗原的親和力強，且特異性好、抗體效價高，可以作為IHNV多種檢測方法中的重要試劑原料。該抗IHNV單克隆抗體6G7特別適用于IHNV快速檢測領域，尤其適用于IHNV熒光納米微球免疫層析檢測法，具體的，基于本申請中得到的抗IHNV單克隆抗體6G7的高質量，其通過化學偶聯方法可與熒光納米微球的穩(wěn)定結合，該抗體與熒光納米微球偶聯既不影響微球的光學性質，又不影響抗體的免疫學活性，因此可大大提高檢測的靈敏度，提高檢測限。
[0032]由抗IHNV單克隆抗體6G7制備得到的IHNV熒光納米微球快速檢測試紙條，特異性強、敏感性高、穩(wěn)定性好，同時具備可重復性和再現性等優(yōu)點。該試紙條可進一步與其他部件構成IHNV檢測試劑盒，例如將該試紙條與卡殼結合即可構成IHNV熒光納米微球檢測卡，其IHNV快速檢測試紙條則是該試劑盒的核心。本申請采用熒光納米微球免疫檢測技術，由于檢測時熒光不受激發(fā)光本底的干擾，通過采用高質量的單克隆抗體6G7偶聯熒光納米微球，使得本申請中得到的試紙條、檢測卡和試劑盒的靈敏度得到了大大的提高，從而提高了檢測限。本申請中采用的熒光微球是核殼結構，克服了常規(guī)熒光微球的染料泄露、抗溶液干擾能力差等缺點，增加了熒光微球的穩(wěn)定性和熒光的壽命。熒光微球表面修飾活性基團，采用化學偶聯方法來標記抗體，形成抗體與微球的穩(wěn)定結合。且該微球顆粒單分散性好，顆粒均一。具有較大的Stokes位移，在檢測時激發(fā)光及發(fā)射光可以輕松地被分開，背景干擾較低。同時，本申請中的試紙條、檢測卡和試劑盒具有操作簡單，檢測時間快，價格低廉的優(yōu)點，適用于現場檢測。
[0033]本申請中的單克隆抗體6G7除了應用于上述熒光納米微球免疫層析檢測試紙條外，還可以用于其他IHNV檢測試劑盒、試劑或設備中。本領域技術人員可以理解，將本申請所述的單克隆抗體6G7直接或間接結合其他信號基團(如膠體金、辣根過氧化酶等)，或將本申請所述的單克隆抗體6G7作為包被抗體(例如ELISA)，則可用于其他形式的IHNV檢測試劑或設備。故本申請所制備得到的雜交瘤細胞及其分泌的抗體可廣泛適用于制備IHNV檢測試劑或設備。[0034]此外，本申請中采用的傳染性造血組織壞死病毒(Infectious hematopoieticnecrosis virus,簡稱IHNV)的毒株為IHNV-UK,英國CEFAS贈送，由深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心保存，紫外分光光度儀MK3購自Therom Fisher scientific公司。
[0035]下面通過【具體實施方式】結合附圖對本申請作進一步詳細說明。
[0036]實施例一:傳染性造血組織壞死病毒膜蛋白的表達
[0037]根據NCBI公布的登錄號為AAT99394的序列，選取傳染性組織壞死病毒膜蛋白glycoprotein為傳染性組織壞死病毒抗原檢測位點，利用抗原決定簇分析軟件分析整個序列，最后選擇免疫原性強、特異性高的一段蛋白作為免疫原，該蛋白的氨基酸序列為SEQID N0.2，合成蛋白對應的DNA序列為SEQ ID N0.1。將這段DNA (序列如SEQ ID N0.1所示)插入原核表達載體PET28e中，測序鑒定。用IPTG誘導表達，分離純化出蛋白IHNVglycoprotein,即可將其作為免疫原用于免疫小鼠制備抗體。具體表達純化過程如下:
[0038]( I)融合蛋白的原核表達
[0039]①培養(yǎng)
[0040]挑取單菌落于試管中(5mL LB培養(yǎng)基,50ug/mL氨節(jié)青霉素)37 °C, 220rpm/min過
夜培養(yǎng)；
[0041]將培養(yǎng)的菌液按1:100比例接種于200ml LB培養(yǎng)基中，添加50ug/mL氨芐青霉素，37 0C，180rpm/min 擴大培養(yǎng)；
[0042]當OD值達到0.6左右時，添加終濃度為0.6mM的IPTG，37 °C，120rpm/min誘導12h ；
[0043]收集菌體并用PBS緩沖液懸浮。
[0044]②超聲破碎菌體
[0045]冰浴中超聲破碎菌體，功率200W，每200mL培養(yǎng)基進行99次循環(huán)(超聲3S，暫停5S為一個循環(huán));
[0046]超聲完畢,8000rpm/min, 4°C,離心15min,收集上清和沉淀；[0047]將離心后沉淀采用溶解液(PBS，8M尿素)懸浮，室溫孵育3h，然后6000rpm/min，4°C，離心15min，上清以備純化。
[0048]③鎳瓊脂糖親和層析
[0049]用10倍柱床體積的Binding buffer清洗平衡柱子,流速60ml/h ；
[0050]樣品(溶解液上清)上柱，流速為45ml/h，收集穿透液；
[0051]10倍柱床體積的Binding buffer清洗柱子，流速60ml/h ；
[0052]Eulte Buffer洗脫，流速45ml/h,收集洗脫液； [0053]將純化后的蛋白置于透析袋中，在PBS緩沖液(pH=8.0)中緩慢透析12h，收集透析后的樣品，SDS-PAGE分析并保存?zhèn)溆谩?br> [0054]注:BindingBuffer (PBS，8M 尿素 15mM 咪唑，300mM NaCl,0.5%Triton X-100，pH=8.0) Eulte Buffer (PBS，8M 尿素，500mM 咪唑，pH=8.0)
[0055]( 2 )融合蛋白的表達及定位
[0056]通過對樣品進行SDS-PAGE分析，電泳顯示在相應位置(33kD)出現明顯的新生條帶，表明融合蛋白在誘導12h后成功得到了表達,見圖3。圖3中，M為蛋白marker, I所示為誘導前樣品，2所示為誘導后樣品，3所示為超聲后上清，4所示為超聲后沉淀，其條件為濃縮膠80V，15分鐘；分離膠150V，60分鐘。
[0057](3)融合蛋白的純化
[0058]融合蛋白經過鎳瓊脂糖親和層析法進行純化，SDS-PAGE電泳分析在相應位置(33kD)均出現明顯條帶，表明融合蛋白12小時后成功得到了純化，見圖4。圖4中，M為蛋白marker，I所示為目的蛋白，其條件為濃縮膠80V，15分鐘；分離膠150V，60分鐘。
[0059]實施例二:抗傳染性組織壞死病毒單克隆抗體的制備:
[0060](I)共選取8周齡BALB/C小鼠5只，免疫程序如下:
[0061]首免:以實施例1中得到的IHNV glycoprotein作為免疫原，以QuickAntibody-Mouse5ff作為免疫佐劑，免疫劑量為5 μ g/只(5 μ g免疫原+5 μ L QuickAntibody-Mouse5ff+生理鹽水90ul),大腿肌肉注射。
[0062]加強免疫:于首免后第21天進行,免疫劑量為5μ g/只(5μ g免疫原+5μ L QuickAntibody-Mouse5ff+生理鹽水90ul),共免疫2次,第35天斷尾采血分離血清,用間接ELISA法檢測抗IHMV懸液的血清抗體效價。若效價達到1:5000，即可用于細胞融合。
[0063]選取ELISA法檢測抗體較高的免疫小鼠，眶下竇采血，分離血清。脫頸致死小鼠；
[0064]無菌手術取出脾臟制備脾細胞，并與NSO細胞在50%PEG作用下進行細胞融合；
[0065]將融合后的細胞懸液加到96孔細胞培養(yǎng)板上，用HAT培養(yǎng)基進行選擇性培養(yǎng)。融合后的細胞置37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0066]用間接ELISA法以0.5 μ g/孔的蛋白的量包被酶標板進行陽性篩選。P/N大于2.1時即為陽性。對強陽性、細胞生長旺盛的孔進行3次有限稀釋克隆化，得到保藏號為CCTCCC201360的雜交瘤細胞株IHMV-6G7。
[0067](2)單抗的大量制備:
[0068]本例采用腹水法大量制備抗IHNV單克隆抗體6G7。將雜交瘤細胞株IHNV-6G7擴大培養(yǎng)，待細胞濃度達5 X IO5個/mL時，收集培養(yǎng)液，測定其ELISA效價和抑制價；
[0069]給腹腔注射0.5ml的降植烷，10天后的小鼠腹腔注射克隆化細胞株IO7個細胞，7天后抽取腹水，用IHNV病毒懸液包被酶標板測其ELISA效價和抑制價。
[0070](3)單抗的純化:
[0071]采用辛酸一硫酸銨法進行單抗的純化。將20mL腹水加入離心管中，于40C 12000rpmX15min，將上清轉移至另一溶器中；向上清中加入4倍血清體積的0.06MpH4.8的醋酸緩沖液，室溫邊加邊攪拌；
[0072]向上述混合物中加入適量的辛酸(33 μ L/mL )，滴加時要緩慢，室溫滴加,邊滴加邊攪拌；辛酸滴加完后，室溫攪拌30min ;于4°C離心，12000rpmX 30min，取上清，用濾紙過濾；
[0073]向濾液中加入≤45%的飽和硫酸銨溶液(SAS)，室溫攪拌30min，4°C靜置2h或過夜；
[0074]于4°C離心 12000rpmX 30min,棄上清，沉淀用適量 0.01mol/L PH7.4PBS 重懸,用0.01mol/L PH7.4PBS 于 4°C透析 24h，其間換液 4 次；
[0075]將透析物于4°C離心12000rpmX30min，收集上清分裝于EP管中，用核酸蛋白測定儀測定蛋白含量，稀釋至10mg/mL，置于_20°C保存。
[0076](4)單克隆抗體特異性檢測:
[0077]用純化的抗IHNV單克隆抗體6G7分別與其他魚類病毒(錦鯉皰疹病毒(KHV)、鯉春病毒血癥病毒(SVCV)、病毒性出血性敗血病毒(VHSV)、傳染性胰臟壞死病毒(IPNV)、真鯛虹彩病毒(RSIV)、草魚出血病病毒(GCHV)和流行性造血器官壞死病毒(EHNV))包被的ELISA板反應，鑒定單克隆抗體的特異性。
[0078]實施例三:熒光納米微球的制備:
[0079](I)黃色熒光納米晶——CdTe / CdS核殼半導體納米晶的制備
[0080]在離心管中加入硼氫化鈉，注入高純水；待硼氫化鈉溶解后迅速加入碲粉，其摩爾比為2:1。反應體系用冰冷卻，預留排氣口排出反應中產生的氫氣。反應2~8小時，瓶底生成白色的四硼酸鈉沉淀，上層清夜即為所需的NaHTe溶液。
[0081]反應方程式為:
[0082]4NaBH4+2Te+7H20 — 2NaHTe+Na2B407+14H2 ；
[0083]將CdCl2和巰基丙酸混合溶液的pH值調至7~14，用微量進樣器加入新制得的NaHTe溶液，其摩爾比為Cd =Te:巰基丙酸=2:1:2~8。在氮氣保護條件下將上述溶液在50~110°C回流即得到黃色CdTe半導體納米晶溶液。
[0084](2)黃色熒光納米微球的制備
[0085]①聚苯乙烯微球(表面羧基400nmol/mg)的制備
[0086]將2g PVP>7.6mL去離子水和60.4mL無水乙醇加入到250mL三頸瓶中，攪拌形成均相體系后，通入N2Ih排凈氧氣；向瓶中緩慢滴加溶有0.3g AIBN的30.0g苯乙烯溶液。滴加完畢后，保持氮氣氣氛和一定攪拌速度，在70°C下聚合反應12h，即得乳液樣品。將下層微球用無水乙醇反復洗滌后備用。
[0087]②黃色納米晶在聚苯乙烯微球表面的組裝
[0088]將ImL帶正電荷的聚二烯丙基二甲基氯化銨(I3DDA)溶液加入到ImL表面帶有負電荷的聚苯乙烯微球(PS)懸濁液中，20min后將上層清液離心分離去除；用緩沖液對微球進行超聲分散洗滌3~5次，每次超聲完畢即將濁液離心分離去除上層清液；然后以相同方法在微球表面再依次組裝一層帶負電的聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)和roDA，最后在TODA的表面通過靜電作用力組裝一層CdTe納米晶，這樣，微球表面即形成了 roDA/PSS/PDDA/CdTe層，從而完成了黃色CdTe納米晶的組裝。重復以上“roDA-PSS-PDDA-CdTe”操作，就可以在Ps微球表面組裝多層聚電解質/CdTe納米晶復合層。
[0089]實施例四:熒光納米微球檢測卡的制備
[0090]( I)固相硝酸纖維素(NC)膜的活化
[0091]裁取20mmX3-4mm的NC膜，于0.lmol/L的碳二亞胺溶液中浸泡，15min后取出，室溫風干8min。抗IHNV多克隆抗體(2mg/ml)包被于固相硝酸纖維素膜的觀察結果的測試反應區(qū)，定義為檢測線(T),包被正常羊抗鼠IgG(2mg/ml)于質控區(qū),定義為質控線(C)。
[0092]其中，該抗IHNV多克隆抗體可通過以下方法制備得到:[0093]將實施例1中制備得到的IHNV glycoprotein作為免疫原，以QuickAntibody-Rabbit5W作為免疫佐劑，免疫劑量為50 μ g/只(50μ g免疫原+50 μ L QuickAntibody-Rabbit5W，再用生理鹽水補充至IOOul，每針次IOOul，小腿后腿肌肉注射免疫家兔，首免后第21天用同樣的方法進行加強免疫，共免疫2次，免疫后第35天耳靜脈采血，分離血清，用表達蛋白包被的ELISA板檢測抗體效價，如果具有較高的抗體滴度，通過頸動脈放血，收集全血，分離血清。用辛酸硫酸銨法提取IgG，用核酸蛋白測定儀測定蛋白含量，將其稀釋至10mg/mL，置于_80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0094]兔抗血清經飽和硫酸銨鹽粗提,透析,再依次過SephadexG25和DEAE纖維素柱進一步提純，并將收集的蛋白質于透析袋中。置蔗糖或聚乙二醇中濃縮，紫外分光光度計測其280nm、260nm波長處OD值，以公式計算蛋白含量后_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0095]經過I次初免，I次加強免疫后，兔抗血清效價可達1:50000以上，具有很高的抗血清效價。
[0096]其中，多克隆抗體動物種屬來源應為非小鼠來源，可為兔、山羊、綿羊、人、豬、馬、牛，制備多克隆的方法可以進行簡單替換。
[0097](2)熒光納米微球-抗體復合物的試的制備與純化:
[0098]IOmL標記體系的方法如下:燒杯(鉻酸浸泡72h，再用蒸餾水洗滌并浸泡24h，ρΗ5.0的0.02Μ PB緩沖液潤洗30min)中加入8ml0.02M PB緩沖液(pH5.0，下同)，加入熒光納米微球5mg，快速攪拌下加入抗IHNV單克隆抗體6G7至終濃度為0.4~0.8g/L，再緩慢加入10mg/mL EDC38.4uL，再用0.02M PB緩沖液將體系體積補至10mL。室溫緩慢攪拌反應2h,再加入Iml 10% (質量分數)BSA封閉30min ；8000r/min, 10°C離心IOmin,棄上清，并以PB清洗，相同條件離心，重懸于Iml PBS緩沖液中，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0099](3)微球結合墊的制備
[0100]裁取20mmX 4mm的玻璃纖維，分別取50 μ L的熒光納米微球抗體復合物用B10D0T噴點儀按4ul/cm噴涂在玻璃纖維膜上，37°C干燥lh。
[0101](4)檢測卡的組裝
[0102]熒光納米微球檢測試紙條由樣品墊、微球結合墊、硝酸纖維素膜及吸水紙4個部分組成，在底板上依次搭接地粘貼吸水紙、樣品墊、微球結合墊、含有檢測線和質控線的硝酸纖維素膜，樣品墊和微球結合墊用玻璃纖維，底板為雙面膠聚乙烯塑料板；順序裝配，裁成寬度為4_的檢測試紙條。[0103] 本例中熒光納米微球快速檢測試紙條的結構示意圖如圖1所示，該熒光納米微球快速檢測試紙條，包括樣品墊1、微球結合墊2、檢測線(T) 3、固相硝酸纖維素膜4、質控線(C) 5、吸水紙6以及底板7。其中，底板7 —端粘貼樣品墊1，另一端粘貼吸水紙6，微球結合墊2是由熒光納米微球標記的抗IHNV單克隆抗體復合物結合在玻璃纖維膜，其一端置于樣品墊I下，另一端緊密連接固相硝酸纖維素膜4 ;檢測線(T) 3為抗IHNV多克隆抗體；質控線(C) 5為羊抗鼠IgG抗體；檢測線(T) 3和質控線(C) 5位于固相硝酸纖維素膜底板4的中間；吸水紙6連接固相硝酸纖維素膜4。
[0104]進一步的，將上述IHNV熒光納米微球快速檢測試紙條組裝成檢測卡，該檢測卡的結構如圖2所示，將上述試紙條固定在底座8上，試紙條用外殼9壓緊，底座8和外殼9通過卡齒10和卡孔11相連接；底座8上有與外殼9連接的卡齒10和與試紙條相匹配的凹槽，該試紙條位于所述凹槽內；外殼9上有加樣孔12、觀察窗13和與底座卡齒10相配的卡孔11，加樣孔12的位置與試紙條樣品墊的位置相對應，觀察窗13與試紙條固相硝酸纖維素膜上的檢測線(T)和質控線(C)相對應，具體的，觀察窗上印有T和C，分別與固相硝酸纖維素膜上的檢測線(T)和質控線(C)相對應。
[0105](5)待測樣品的前處理:
[0106]當所述樣品為魚類組織時，病毒釋放后，樣品前處理方法為:
[0107]I)取樣方式:表面健康的魚:取腎、脾和腦；有臨床癥狀的魚:體長< 4cm取全魚；體長在4~6cm之間，取包括腎臟和腦在內的所有臟器；體長> 6cm，取腎、脾和腦；
[0108]2)取組織6~7g，加入適量已滅菌石英砂，充分研磨，然后加入50mL M199培養(yǎng)基(含10%FBS和100IU/mL青霉素和100 μ g/mL雙氫鏈霉素的雙抗)，轉入50ml離心管，4°C孵育過夜。最后取孵育后的細胞懸液作為檢測樣品。
[0109](6)檢測方法與判斷標準
[0110]將待檢測樣品滴加到檢測卡的加樣孔，水平放置，反應5-10min。
[0111]判斷標準:在熒光讀取儀中讀取，若只在質控線C出現黃色，則表示為陰性；若在檢測卡的質控線、檢測線出現黃色，則判定為陽性。
[0112]實施例五:熒光納米微球快速檢測卡的檢測試驗
[0113](I)樣品中傳染性造血組織壞死病毒的檢測
[0114]抗體標記在熒光納米微球顆粒上，當加入樣本后,熒光納米微球標記抗體和樣本一起向硝酸纖維素膜方向擴散，并最終滲入吸水紙端，擴散過程中待檢的IHNV可與熒光納米微球標記的抗IHNV單克隆抗體相結合。當樣本中的IHNV超過檢測限時，檢測線(T)顯黃色，多余的熒光納米微球標記的單克隆抗體與質控線(C)的羊抗鼠IgG 二抗相結合顯色，C線顯黃色，形成2條黃色印記為陽性；反之，待測樣品中無IHNV時，熒光納米微球標記抗體在向硝酸纖維素膜方向擴散的過程中，不能與抗IHNV多克隆抗體相結合，不能形成固相多克隆抗體一抗原一熒光納米微球標記抗體復合物，因此T線不顯色，只能與羊抗鼠IgG 二抗結合，C線顯黃色，記為陰性；如果硝酸纖維素膜沒有顯示黃色標記或C線不顯色，則表明檢測卡失效。
[0115](2)檢測卡的敏感性試驗:分別將已知病毒陽性細胞培養(yǎng)液10份經過倍比稀釋，分別用檢測卡進行檢測，并且與病毒分離試驗進行敏感性比較，結果表明檢測卡的靈敏度為 50TCID50, CV 值小于 15%。[0116](3)檢測卡的特異性試驗之阻斷試驗:檢測IHNV時顯示為陽性，當將狗魚彈狀病毒(PFRV)、牙鲆彈狀病毒(HRV)、傳染性胰臟壞死病毒(IPNV)、錦鯉皰疹病毒(KHV)、鯉春病毒血癥病毒(SVCV)、病毒性出血性敗血病毒(VHSV)、真觸虹彩病毒(RSIV)、草魚出血病病毒(GCHV)和流行性造血器官壞死病毒(EHNV)等幾種病毒陽性細胞培養(yǎng)液分別加入檢測卡的加樣孔內，靜置反應10min后，檢測結果均為陰性，說明本檢測卡特異性好，結果見表1，其中“ + ”表示陽性，表示陰性。
[0117]表1.檢測卡的特異性試驗
[0118]
【權利要求】
1.保藏號為CCTCCC201360的雜交瘤細胞株IHNV-6G7。
2.一種抗傳染性造血組織壞死病毒單克隆抗體，其特征在于:所述抗體由保藏號CCTCC C201360的雜交瘤細胞株IHNV-6G7產生。
3.根據權利要求1所述的雜交瘤細胞株IHNV-6G7在制備傳染性造血組織壞死病毒檢測試劑或設備中的應用。
4.如權利要求2所述的抗傳染性造血組織壞死病毒單克隆抗體在制備傳染性造血組織壞死病毒檢測試劑或設備中的應用。
5.一種傳染性造血組織壞死病毒快速檢測試紙條，其特征在于:所述試紙條包含權利要求2所述的抗傳染性造血組織壞死病毒單克隆抗體。
6.根據權利要求5所述的傳染性造血組織壞死病毒快速檢測試紙條，其特征在于:所述抗傳染性造血組織壞死病毒單克隆抗體包附熒光納米微球。
7.根據權利要求5或6所述的快速檢測試紙條在傳染性造血組織壞死病毒檢測中的應用。
8.一種傳染性造血組織壞死病毒檢測試劑盒，其特征在于:該試劑盒包括如權利要求5或6中所述的傳染性造血組織壞死病毒快速檢測試紙條。
9.根據權利要求8所述的試劑盒在傳染性造血組織壞死病毒檢測中的應用。
10.一種用于制備權利要求1所述雜交瘤細胞株IHNV-6G7的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID N0.2所示序列。
【文檔編號】C12N5/20GK103525767SQ201310433433
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年9月22日 優(yōu)先權日:2013年9月22日
【發(fā)明者】賈鵬, 鐘松清, 何俊強, 劉葒, 鄭曉聰, 譚攀, 王津津, 史秀杰, 蘭文升, 于力, 謝冬霞 申請人:深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心, 深圳市三方圓生物科技有限公司