一種檢測(cè)cyp3a4基因多態(tài)性的試劑盒及方法

一種檢測(cè)cyp3a4基因多態(tài)性的試劑盒及方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測(cè)CYP3A4基因多態(tài)性的試劑盒及方法，屬于基因測(cè)序【技術(shù)領(lǐng)域】。所述試劑盒包括檢測(cè)用引物，即包括：CYP3A4基因第1～3外顯子的長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性上下游引物、CYP3A4基因第4～7外顯子的長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性上下游引物、CYP3A4基因第8～11外顯子的長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性上下游引物和CYP3A4基因第12～13外顯子的長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性上下游引物中的至少一對(duì)，以及與所述第1～3外顯子的長(zhǎng)片段DNA、第4～7外顯子的長(zhǎng)片段DNA、第8～11外顯子的長(zhǎng)片段DNA以及第12～13外顯子的長(zhǎng)片段DNA相對(duì)應(yīng)的CYP3A4基因的各外顯子的上下游測(cè)序引物中的至少一對(duì)。本發(fā)明檢測(cè)時(shí)間短、工作量少。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種檢測(cè)CYP3A4基因多態(tài)性的試劑盒及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明涉及基因測(cè)序【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種檢測(cè)CYP3A4基因多態(tài)性的試劑盒及方法。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)胞色素P450酶(Cytochrome P450, CYP),又稱(chēng)混合功能氧化酶(Mixed functionoxcidase)、單加氧酶(Monooxygenase)或藥物代謝酶,其廣泛分布于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)。在哺乳動(dòng)物的組織中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有20多種同工酶，分為CYPl~4的4個(gè)家族。CYP3A型酶在體內(nèi)占CYP450總量的70%，占肝內(nèi)CYP450的30 %，參與60 %以上常用藥物在體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化。目前，在人體內(nèi)己發(fā)現(xiàn)4種CYP3A~基因，即CYP3A4、CYF3A5，CYP3A7和CYP3A43，而其中CYP3A4是臨床上最重要的P450酶之一，參與代謝38個(gè)類(lèi)別的150多種藥物的氧化代謝，約占全部藥物的50%，是許多藥物因相互作用發(fā)生不良反應(yīng)的根源。CYP3A4是肝臟和胃腸道中主要的P450代謝酶，其活性表現(xiàn)為單態(tài)分布，在許多藥物和環(huán)境污染物的代謝中發(fā)揮著重要作用。研究表明，CYP3A4不僅在表達(dá)水平上具有顯著的個(gè)體差異，其底物的體內(nèi)代謝也可相差10倍以上。編碼CYP3A4蛋白的基因位于染色體7q21.3—22.1，編碼區(qū)域包含13個(gè)外顯子和12個(gè)內(nèi)含子，主要調(diào)控其轉(zhuǎn)錄及表達(dá)的結(jié)構(gòu)區(qū)位于5端，長(zhǎng)約27kb, CYP3A4基因多態(tài)性具體詳見(jiàn)CYP等位基因數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.cypalleles.k1.se)。到目前為止CYP3A4已有24個(gè)等位基因已經(jīng)確定，不同種族間CYP3A4SNPs的發(fā)生頻率不同，如CYP3A4*3和*17僅在白種人中發(fā)現(xiàn)，CYP3A4*15只在黑種人中發(fā)現(xiàn)，而CYP3A4*16僅存在于日本人和墨西哥人中，在已發(fā)現(xiàn)的39個(gè)SNPs中，CYP3A4*4，*5，*6，*18，*19在中國(guó)人中已確定，它們的發(fā)生頻率分別為1.5 %，0.98 %，0.5 %，2 %和2 %。許多常用藥物是CYP3A4的強(qiáng)誘導(dǎo)劑或抑制劑，當(dāng)CYP3A4作為誘導(dǎo)劑時(shí)，其與代謝底物合并用藥，能大大提高后者的代謝速率，從而可能使后者無(wú)法達(dá)到發(fā)揮藥效時(shí)的血藥濃度，降低后者的利用度或者無(wú)法達(dá)到治療效果。相反，當(dāng)CYP3A4作為抑制劑時(shí)，它們與經(jīng)CYP3A4代謝的藥物合并用藥時(shí)，會(huì)減少后者的代謝速率，導(dǎo)致后者的血藥濃度升高，可能引起不良反應(yīng)。因此，通過(guò)檢測(cè)CYP3A4基因多態(tài)性，判斷CYP3A4酶的活性，為臨床用藥個(gè)體化提供指導(dǎo)依據(jù)。
[0003]現(xiàn)有技術(shù)中采用直接測(cè)序法檢測(cè)CYP3A4基因多態(tài)性，即首先采用PCR擴(kuò)增不同的目的片段后，回收純化PCR產(chǎn)物，然后進(jìn)行測(cè)序。
[0004]由于直接測(cè)序法的檢測(cè)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，一般需要48個(gè)小時(shí)以上，使該檢測(cè)的效率降低，因此，為檢測(cè)CYP3A4基因多態(tài)性帶來(lái)不便。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)CYP3A4基因多態(tài)性的時(shí)間長(zhǎng)、步驟繁瑣、需要多次PCR的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)CYP3A4基因多態(tài)性的試劑盒。
[0006]本發(fā)明的另一目的在于提供一種檢測(cè)CYP3A4基因多態(tài)性的方法。
[0007]為了解決現(xiàn)有技術(shù)檢測(cè)CYP3A4基因多態(tài)性時(shí)間長(zhǎng)、步驟繁瑣、需要多次PCR的問(wèn)題，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案:
[0008]一種檢測(cè)CYP3A4基因多態(tài)性的試劑盒，包括檢測(cè)用引物，所述檢測(cè)用引物包括:CYP3A4基因第I~3外顯子的長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性上下游引物、CYP3A4基因第4~7外顯子的長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性上下游引物、CYP3A4基因第8~11外顯子的長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性上下游引物和CYP3A4基因第12~13外顯子的長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性上下游引物中的至少一對(duì)，以及與所述第I~3外顯子的長(zhǎng)片段DNA、第4~7外顯子的長(zhǎng)片段DNA、第8~11外顯子的長(zhǎng)片段DNA以及第12~13外顯子的長(zhǎng)片段DNA相對(duì)應(yīng)的CYP3A4基因的各外顯子的上下游測(cè)序引物中的至少一對(duì)，其中:
[0009]所述CYP3A4基因第I~3外顯子長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性上游引物序列如序列表中SEQID NO:1 所示；
[0010]所述CYP3A4基因第I~3外顯子長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性下游引物序列如序列表中SEQID NO:2 所示；
[0011 ] 所述CYP3A4基因第4~7外顯子長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性上游引物序列如序列表中SEQID NO:3 所示；
[0012]所述CYP3A4基因第4~7外顯子長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性下游引物序列如序列表中SEQID NO:4 所示；
[0013]所述CYP3A4基因第8~11外顯子長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:5 所示；
[0014]所述CYP3A4基因第8~11外顯子長(zhǎng)片段擴(kuò) 增特異性下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:6 所示；
[0015]所述CYP3A4基因第12~13外顯子長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:7 所示；
[0016]所述CYP3A4基因第12~13外顯子長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:8 所示；
[0017]所述CYP3A4基因第I外顯子上游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ ID NO:9所示；
[0018]所述CYP3A4基因第I外顯子下游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 10所示；
[0019]所述CYP3A4基因第2外顯子上游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 11所示；
[0020]所述CYP3A4基因第2外顯子下游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 12所示；
[0021]所述CYP3A4基因第3外顯子上游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 13所示；
[0022]所述CYP3A4基因第3外顯子下游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 14所示；
[0023]所述CYP3A4基因第4外顯子上游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 15所示；
[0024]所述CYP3A4基因第4外顯子下游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 16所示；
[0025]所述CYP3A4基因第5~6外顯子上游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 17所示；
[0026]所述CYP3A4基因第5~6外顯子下游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 18所示；
[0027]所述CYP3A4基因第7外顯子上游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 19所示；
[0028]所述CYP3A4基因第7外顯子下游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 20所示；
[0029]所述CYP3A4基因第8外顯子上游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 21所示；[0030]所述CYP3A4基因第8外顯子下游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 22所示；
[0031]所述CYP3A4基因第9外顯子上游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 23所示；
[0032]所述CYP3A4基因第9外顯子下游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 24所示；
[0033]所述CYP3A4基因第10外顯子上游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 25所示；
[0034]所述CYP3A4基因第10外顯子下游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 26所示；
[0035]所述CYP3A4基因第11外顯子上游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 27所示；
[0036]所述CYP3A4基因第11外顯子下游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 28所示；
[0037]所述CYP3A4基因第12外顯子上游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 29所示；
[0038]所述CYP3A4基因第12外顯子下游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 30所示；
[0039]所述CYP3A4基因第13外顯子上游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 31所示；
[0040]所述CYP3A4基因第13外顯子下游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 32所示。
[0041]在上述試劑盒中，作為一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述試劑盒還包括內(nèi)參基因ACTB以及內(nèi)參基因ACTB擴(kuò)增引物，其中，
[0042]所述內(nèi)參基因ACTB擴(kuò)增引物的上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:33所示；
[0043]所述內(nèi)參基因ACTB擴(kuò)增引物的下游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 34所示；
[0044]所述內(nèi)參基因ACTB的序列如序列表中SEQ ID N0:35所示。
[0045]在上述試劑盒中，作為一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述試劑盒還包括測(cè)序緩沖液。更有選地，所述測(cè)序緩沖液為Buffer緩沖液,所述Buffer緩沖液的pH為8.3。
[0046]在上述試劑盒中，作為一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述試劑盒還包括陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，其中，所述陰性對(duì)照為去離子水；所述陽(yáng)性對(duì)照為CYP3A4*8型的CYP3A4基因多態(tài)性中的含389G>A突變位點(diǎn)的基因序列DNA樣品。
[0047]在上述試劑盒中，作為一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述試劑盒還包括各種PCR反應(yīng)試劑或者各種PCR反應(yīng)試劑的混合物；更優(yōu)選地，所述各種PCR反應(yīng)試劑包括:PCR預(yù)混合液、Mg2+、dNTPs dUTP、Taq酶、BSA、T4噬菌體的基因32編碼蛋白以及無(wú)RNase去離子水。
[0048]在上述試劑盒中，作為一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述試劑盒還包括內(nèi)部陽(yáng)性控制序列以及內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的擴(kuò)增引物，其中:所述內(nèi)部陽(yáng)性控制序列如序列表中SEQ IDN0:36所示；所述內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的擴(kuò)增引物的上游引物如序列表中SEQ ID N0:37所示；所述內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的擴(kuò)增引物的下游引物如序列表中SEQ ID N0:38所示。
[0049]在上述試劑盒中，各種優(yōu)選實(shí)施方式可以任意組合。
[0050]一種檢測(cè)CYP3A4基因多態(tài)性的方法，包括如下步驟:
[0051]步驟一，提取受檢者基因組DNA ;
[0052]步驟二，以步驟一得到的基因組DNA為模板，采用如序列表中SEQ ID NO:1和SEQID N0:2所示的CYP3A4基因第I~3外顯子的長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性上下游引物、如序列表中SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4所示的CYP3A4基因第4~7外顯子的長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性上下游引物、如序列表中SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6所示的CYP3A4基因第8~11外顯子的長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性上下游引物或者如序列表中SEQ ID N0:7和SEQ ID NO:8所示的CYP3A4基因第12~13外顯子的長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性上下游引物，PCR擴(kuò)增CYP3A4基因第I~3外顯子的長(zhǎng)片段DNA、CYP3A4基因第4~7外顯子的長(zhǎng)片段DNA、CYP3A4基因第8~11外顯子的長(zhǎng)片段DNA或CYP3A4基因第12~13外顯子的長(zhǎng)片段DNA ；[0053]步驟三，對(duì)步驟二的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，并回收純化得到的CYP3A4基因第I~3外顯子的長(zhǎng)片段DNA、CYP3A4基因第4~7外顯子的長(zhǎng)片段DNA、CYP3A4基因第8~11外顯子的長(zhǎng)片段DNA或CYP3A4基因第12~13外顯子的長(zhǎng)片段DNA ；
[0054]步驟四，以步驟三回收純化后得到的產(chǎn)物為模板，采用如序列表中SEQ IDN0:9和SEQ ID NO: 10所示的上下游引物、SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12所示的上下游引物、SEQID NO: 13和SEQ ID NO: 14所示的上下游引物、SEQ IDN0:15和SEQ ID NO: 16所示的上下游引物、SEQ ID NO: 17 和 SEQ ID NO: 18 所示的上下游引物、SEQ ID NO: 19 和 SEQ ID NO: 20所示的上下游引物、SEQ IDN0:21和SEQ ID NO:22所示的上下游引物、SEQ ID NO:23SEQ ID N0:24所示的上下游引物、SEQ ID N0:25和SEQ ID NO:26所示的上下游引物、SEQIDN0:27和SEQ ID NO:28所示的上下游引物、SEQ ID N0:29和SEQ ID N0:30所示的上下游引物以及SEQ ID N0:31和SEQ ID NO:32所示的上下游引物中的至少一對(duì)相應(yīng)的上下游測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)；
[0055]步驟五，將步驟四得到的測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物純化后上測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)得序列在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)分析以獲得CYP2D6基因多態(tài)性。
[0056]在上述方法中，作為一種優(yōu)選實(shí)施方式，在所述步驟二中，所述PCR的反應(yīng)條件如下:先經(jīng)過(guò)95°C 3min;然后進(jìn)入PCR循環(huán)，所述PCR循環(huán)為95 °C 30s, 57 °C 3.6min、72°C 3min，共35個(gè)循環(huán)；最后72°C IOmin0更優(yōu)選地，所述PCR的反應(yīng)液中部分組分及濃度如下:1 X 的 PCR 預(yù)混合液、Mg2+:2.5-4.0mM, dNTPs:0.2-0.4mM、dUTP:0.3-0.6mM、Taq 酶:0.2υ/μ L、BSA:1.25wt%、T4 噬菌體的基因 32 編碼蛋白:lnmol/L。
[0057]在上述方法中，作為一種優(yōu)選實(shí)施方式，在所述步驟四中，所述測(cè)序反應(yīng)的條件如下:先98°C變性2min，然后進(jìn)行PCR循環(huán)，PCR循環(huán)參數(shù)為96°C 10s，50°C 5s, 60°C 4min，共25個(gè)循環(huán)。
[0058]在上述方法中，作為一種優(yōu)選實(shí)施方式，在所述步驟二中，所述PCR反應(yīng)中還加入了如序列表中SEQ ID N0:36所示的內(nèi)部陽(yáng)性控制序列、如序列表中SEQ ID N0:37所示的內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的擴(kuò)增引物的上游引物以及如序列表中SEQ ID N0:38所示的內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的擴(kuò)增引物的下游引物。
[0059]本發(fā)明試劑盒及檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)和效果如下:
[0060](I)敏感性高:可以同時(shí)檢測(cè)出目前報(bào)道的24種CYP3A4基因多態(tài)性，具體詳見(jiàn)CYP 等位基因數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.cypalleles.k1.se)。
[0061](2)特異性強(qiáng):使用特異性引物擴(kuò)增CYP3A4基因長(zhǎng)片段序列，然后進(jìn)行測(cè)序，對(duì)特定的分子進(jìn)行識(shí)別，準(zhǔn)確性高，特異性好、假陽(yáng)性低，可達(dá)到直接測(cè)序法的準(zhǔn)確度，甚至比直接測(cè)序法更準(zhǔn)確。
[0062](3)簡(jiǎn)便安全:操作簡(jiǎn)單、安全，只需一次PCR擴(kuò)增后可以同時(shí)進(jìn)行多個(gè)外顯子測(cè)序檢測(cè)多態(tài)性，極大地減少了檢測(cè)環(huán)節(jié)，降低了污染的可能性。
[0063](4)全程監(jiān)控:本發(fā)明實(shí)施例提供的試劑盒引入了內(nèi)部陽(yáng)性控制質(zhì)量控制體系，對(duì)檢測(cè)過(guò)程進(jìn)行全程質(zhì)量監(jiān)控，有效避免假陽(yáng)性或者假陰性。
[0064](5)快速:速度快、高通量，只需一次性擴(kuò)增CYP3A4基因長(zhǎng)片段序列，而無(wú)需對(duì)CYP3A4基因每個(gè)外顯子進(jìn)行擴(kuò)增，極大地降低了勞動(dòng)強(qiáng)度，節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間，可在8小時(shí)內(nèi)完成。[0065]本發(fā)明的試劑盒及方法，利用長(zhǎng)片段PCR測(cè)序法快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)目前報(bào)道的24種CYP3A4基因多態(tài)性，有效杜絕了假陽(yáng)性和假陰性的發(fā)生，用于經(jīng)CYP3A4代謝的藥物的使用劑量的預(yù)測(cè)并且為藥物的選擇提供了重要的手段。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0066]為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0067]圖1是本發(fā)明實(shí)施例2提供的采用實(shí)施例1的試劑盒的長(zhǎng)片段擴(kuò)增引物對(duì)擴(kuò)增受檢者外周血DNA PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果，其片段大小預(yù)計(jì)的核酸片段大小一致，擴(kuò)增結(jié)果對(duì)應(yīng)為:第一條帶為Marker，第二條帶為CYP3A4第I~3外顯子引物擴(kuò)增長(zhǎng)片段，第三條帶為CYP3A4第4~7外顯子引物擴(kuò)增長(zhǎng)片段，第四條帶為CYP3A4第8~11外顯子引物擴(kuò)增長(zhǎng)片段，第六條帶為CYP3A4第12~13外顯子引物擴(kuò)增長(zhǎng)片段，第七條帶為陽(yáng)性對(duì)照，第八條帶為陰性對(duì)照；
[0068]圖2是本發(fā)明實(shí)施例2提供的采用實(shí)施例1試劑盒的CYP3A4基因第7外顯子上游測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序后所得的結(jié)果，在第7外顯子核酸序列566堿基處發(fā)生了 566T>C，提示為CYP3A4基因多態(tài)性*17 ；
[0069]圖3是本發(fā)明實(shí)施例2提供的采用實(shí)施例1試劑盒的CYP3A4基因第11外顯子上游測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序后所得的結(jié)果，在第11外顯子核酸序列1088堿基處發(fā)生了 1088CXT，提示為CYP3A4基因多態(tài)性*11。
【具體實(shí)施方式】
[0070]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明實(shí)施方式作進(jìn)一步地詳細(xì)描述。下面實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常為本領(lǐng)域常規(guī)方法，如按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件如SambiOOk等人，分子克隆，實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(第三版)(科學(xué)出版社，2002)中所述的條件，或按照試劑制造廠家所建議的條件。
[0071]實(shí)施例1.試劑盒的制備
[0072]1、內(nèi)參基因ACTB以及CYP3A4基因的引物設(shè)計(jì)
[0073]根據(jù)基因序列ACTB基因序列和CYP3A4基因序列來(lái)源于美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心核酸數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI)，其中ACTB基因ID為60，參考序列號(hào)為NG_007992.1，也可參見(jiàn)本發(fā)明序列表中SEQ ID N0:35 ;CYP3A4基因ID為1574，參考序列號(hào)為NG_008421.1，采用Primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件分別設(shè)計(jì)內(nèi)參基因ACTB和CYP3A4基因的特異引物，包括:CYP3A4基因第I~3外顯子的長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性上下游引物、CYP3A4基因第4~7外顯子的長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性上下游引物、CYP3A4基因第8~11外顯子的長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性上下游引物、CYP3A4基因第12~13外顯子的長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性上下游引物，以及CYP3A4基因第I外顯子上下游測(cè)序引物、CYP3A4基因第2外顯子上下游測(cè)序引物、CYP3A4基因第3外顯子上下游測(cè)序引物、CYP3A4基因第4外顯子上下游測(cè)序引物、CYP3A4基因第5~6外顯子上下游測(cè)序引物、CYP3A4基因第7外顯子上下游測(cè)序引物、CYP3A4基因第8外顯子上下游測(cè)序引物、CYP3A4基因第9外顯子上下游測(cè)序引物、CYP3A4基因第10外顯子上下游測(cè)序引物、CYP3A4基因第11外顯子上下游測(cè)序引物、CYP3A4基因第12外顯子上下游測(cè)序引物和CYP3A4基因第13外顯子上下游測(cè)序引物，其中，如CYP3A4基因第I~3外顯子的長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性上下游引物分別用于鑒別CYP3A4基因的CYP3A4*14型，CYP3A4基因第7外顯子上下游引物用于鑒別CYP3A4*17基因多態(tài)性，CYP3A4基因第11外顯子上下游引物用于鑒別CYP2D6*11等均為——對(duì)應(yīng)關(guān)系，可以同時(shí)檢測(cè)出目前報(bào)道的24種CYP3A4基因多態(tài)性，其中，24種CYP3A4基因多態(tài)性具體詳見(jiàn)CYP等位基因數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.cypalleles.k1.se)。
[0074]通過(guò)上述引物設(shè)計(jì)得到:
[0075]CYP3A4基因第I~3外顯子長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性上游引物序列:5’ -TGGACTTGGGGTGCTAATCA-3’，如序列表中 SEQ ID NO:1 所示；
[0076]CYP3A4基因第I~3外顯子長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性下游引物序列:5’ -TGTGTGTGTGTAAAAACCCTGAC-3’，如序列表中 SEQ ID NO: 2 所示；
[0077]CYP3A4基因第4~7外顯子長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性上游引物序列:5’-GGCTGTTGATGTTTAATCAACTCTG-3’，如序列表中 SEQ ID NO: 3 所示；
[0078]CYP3A4基因第4~7外顯子長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性下游引物序列:5’-CAAATGTACTACAAATCACTGAACTG-3’，如序列表中 SEQ ID NO: 4 所示；
[0079]CYP3A4基因第8~11外顯子長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性上游引物序列5’-AGCAAATAATTATACAACCACATGAC-3’，如序列表中 SEQ ID NO: 5 所示；
[0080]CYP3A4基因第8~11外顯子長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性下游引物序列:5’ -GCTCCAGGTAAATTT TGCACA-3’，如序列表中 SEQ ID NO: 6 所示；
[0081]CYP3A4基因第12~13外顯子長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性上游引物序列:5’ -GTAAGAAACCCTAACATGTAACT-3’，如序列表中 SEQ ID NO: 7 所示；
[0082]CYP3A4基因第12~13外顯子長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性下游引物序列:5，-AGGCCAGGATGTCTCTCCA-3’，如序列表中 SEQ ID NO: 8 所示；
[0083]CYP3A4基因第I外顯子上游測(cè)序引物序列:5’ -GCCCTGCTACTGGCTGCA-3’，如序列表中SEQ ID NO:9所示；
[0084]CYP3A4基因第I外顯子下游測(cè)序引物序列:5’ -CGGCCTGAACATCTTTTTTG-3’，如序列表中SEQ ID NO: 10所示；
[0085]CYP3A4基因第2外顯子上游測(cè)序引物序列:5’-TCGCTGTGACTTGATTTCTGT-3’，如序列表中SEQ ID NO: 11所示；
[0086]CYP3A4基因第2外顯子下游測(cè)序引物序列:5’-AAAACTTCAGACCTTCCCCCT-3’，如序列表中SEQ ID NO: 12所示；
[0087]CYP3A4基因第3外顯子上游測(cè)序引物序列:5’ -TGACAAGAGCTTCATCCCAA-3’，如序列表中SEQ ID NO: 13所示；
[0088]CYP3A4基因第3外顯子下游測(cè)序引物序列:5’-TCCCAATTAGAGGCAGGGTTA-3’，如序列表中SEQ ID NO: 14所示；
[0089]CYP3A4基因第4外顯子上游測(cè)序引物序列:5’-TTGGGCTCCAGCTGTAGAATA-3’，如序列表中SEQ ID NO: 15所示；[0090]CYP3A4基因第4外顯子下游測(cè)序引物序列:5’-CCTGGACATTTTTTAGGCAAC-3’，如序列表中SEQ ID NO: 16所示；
[0091]CYP3A4基因第5~6外顯子上游測(cè)序引物序列:5’-AAGTGTTCCTGTTTAACACATTTTC-3’，如序列表中SEQ ID NO: 17所示;
[0092]CYP3A4基因第5~6外顯子下游測(cè)序引物序列:5’ -TCACTGGAATAACCCAACAGCA-3’，如序列表中SEQ ID NO: 18所示；
[0093]CYP3A4基因第7外顯子上游測(cè)序引物序列:5’-GTGGATGAATTACATGGTGATTT-3’，如序列表中SEQ ID NO: 19所示；
[0094]CYP3A4基因第7外顯子下游測(cè)序引物序列:5’ -GGAAGGATGGTAAAAAGGTGCT-3’，如序列表中SEQ ID NO:20所示；
[0095]CYP3A4基因第8外顯子上游測(cè)序引物序列:5’-GCTCCAGGTAAATTTTGCACA-3’，如序列表中SEQ ID NO:21所示；
[0096]CYP3A4 基因第 8 外顯子下游測(cè)序引物序列:5’ -AAAACATACAGGTAACTGCACTGA-3’，如序列表中SEQ ID NO:22所示；
[0097]CYP3A4基因第9外顯子上游測(cè)序引物序列:5’ -TCAGGAGCCACTTTCTGTCA-3’，如序列表中SEQ ID NO:23所示；
[0098]CYP3A4基因第9外顯子下游測(cè)序引物序列:5’-TATGCCTGCATGCCTCTAGAA-3’，如序列表中SEQ ID NO:24所示； [0099]CYP3A4 基因第 10 外顯子上游測(cè)序引物序列:5’-CTCTTCATCTAAACTGTGATGCCC-3’，如序列表中SEQ ID NO:25所示；
[0100]CYP3A4 基因第 10 外顯子下游測(cè)序引物序列:5’-AGAGTCAGTGAAAGAATCAGTGATT-3’，如序列表中SEQ ID N0:26所示；
[0101]CYP3A4 基因第 11 外顯子上游測(cè)序引物序列:5’-CTTCATTAGTACTGCATGGACTGAG-3’，如序列表中SEQ ID NO:27所示；
[0102]CYP3A4 基因第 11 外顯子下游測(cè)序引物序列:5’ -AGCAAATAATTATACAACCACATGACTG-3’，如序列表中SEQ ID NO: 28所示；
[0103]CYP3A4基因第12外顯子上游測(cè)序引物序列:5’-TCTCAACAAGACTGAAAGCTCC-3’，如序列表中SEQ ID NO:29所示；
[0104]CYP3A4 基因第 12 外顯子下游測(cè)序引物序列:5’-GGGCTTTACATGATGTTTTTGATG-3’，如序列表中SEQ ID NO:30所示；
[0105]CYP3A4基因第13外顯子上游測(cè)序引物序列:5’ -TCCCCTCAACACTGAAGGAGT-3’，如序列表中SEQ ID NO:31所示；
[0106]CYP3A4基因第13外顯子下游測(cè)序引物序列:5’ -CAATGCATGTACAGAATCCCC-3’，如序列表中SEQ ID NO:32所示；
[0107]內(nèi)參基因ACTB擴(kuò)增上游測(cè)序引物序列:5’ -CGATTTCTCGCAGCTCACCAT-3’，如序列表中SEQ ID NO:33所示；
[0108]內(nèi)參基因ACTB擴(kuò)增下游測(cè)序引物序列:5’ -AATACACACTCCAAGGCCGC-3’，如序列表中 SEQ ID NO:34 所示。
[0109]2、內(nèi)部陽(yáng)性控制序列及其引物的設(shè)計(jì)[0110]該內(nèi)部陽(yáng)性控制序列包含CYP3A4基因部分序列和一部分人工合成序列，如序列表中SEQ ID NO:36所示。
[0111]采用Primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件并按照上述引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)出上述內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的上下游引物分別為:5’-GCGCGTGACACTGCTACATG-3’(如序列表中SEQ ID NO:37所示)、5’ -TCGAGTAGCTGAGACTGCGT-3’(如序列表中 SEQ ID N0:38 所示)。
[0112]3、試劑盒的組成及制備
[0113]本發(fā)明試劑盒組成如下:
[0114]①基因組DNA提取試劑:該提取試劑為本領(lǐng)域常用試劑，本實(shí)施例采用組織基因組DNA提取試劑盒(Qiagen公司，貨號(hào):69504)中的試劑。
[0115]②引物:包括上述可以分別擴(kuò)增CYP3A4基因第1~3外顯子、4~7外顯子、8~11外顯子和12~13外顯子的長(zhǎng)片段擴(kuò)增上下游引物、上述CYP3A4基因第1、2、3、4、5~
6、7、8、9、10、11、12以及13外顯子測(cè)序上下游引物、上述內(nèi)部陽(yáng)性控制序列擴(kuò)增上下游引物和內(nèi)參基因ACTB擴(kuò)增上下游引物。
[0116]③上述內(nèi)參基因ACTB以及內(nèi)部陽(yáng)性控制序列。
[0117]上述引物序列、內(nèi)部陽(yáng)性控制序列和內(nèi)參基因ACTB序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
[0118]④陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照:以去離子水為陰性對(duì)照，以含有CYP3A4*8型的CYP3A4基因多態(tài)性中的含389G>A突變位點(diǎn)的基因序列DNA樣品為陽(yáng)性對(duì)照；
[0119]陽(yáng)性對(duì)照的制備:采用組織基因組DNA提取試劑盒(Qiagen公司，貨號(hào):69504)快速提取已經(jīng)確診的含有CYP3A4*8型的CYP3A4基因多態(tài)性中的含389G>A突變位點(diǎn)的基因序列的0.5ml受檢者外周血基因組DNA，作為陽(yáng)性對(duì)照。
[0120]⑤各種PCR反應(yīng)試劑:PCR預(yù)混合液，本實(shí)施例中選用2 XPCR Premix (Qiagen公司，產(chǎn)品貨號(hào):210212) ;Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq 酶、BSA (Albumin from bovine serum,牛血清白蛋白)、T4噬菌體的基因32編碼蛋白、無(wú)RNase去離子水。
[0121]⑥測(cè)序緩沖液,pH為8.3的Buffer緩沖液,其Buffer緩沖液的配制:1 μ IBigdye和 3 μ 15x 含 IOmM MgCl2 的 400mM Tris 溶液。
[0122]實(shí)施例2.用實(shí)施例1制備的試劑盒檢測(cè)CYP3A4基因多態(tài)性
[0123]以隨機(jī)檢測(cè)30例受檢者外周血標(biāo)本結(jié)果為例。
[0124]用本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)人群CYP3A4基因多態(tài)性的檢測(cè)流程為:首先獲取臨床受檢者外周血樣本，快速提取基因組DNA ;其次，先配制內(nèi)參基因ACTB的PCR反應(yīng)液，然后加入濃度均為2ng/l.! I內(nèi)參基因ACTB序列和內(nèi)部陽(yáng)性控制序列各2 μ 1，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR結(jié)束后在濃度為2%的瓊脂糖DNA凝膠中進(jìn)行電泳，查看PCR擴(kuò)增情況。如果內(nèi)參基因ACTB的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中存在390bp和800bp左右的兩個(gè)條帶，提示整個(gè)檢測(cè)過(guò)程有效，如圖1所示，如果缺少一條或二條帶，提示檢測(cè)失敗，則需要重新進(jìn)行檢測(cè)。再次，如果通過(guò)內(nèi)參基因ACTB的PCR結(jié)果證明檢測(cè)過(guò)程有效，則配制CYP3A4基因長(zhǎng)片段擴(kuò)增PCR反應(yīng)液和陰性、陽(yáng)性反應(yīng)液，前者中加入2μ I提取的受檢者外周血基因組DNA，后者分別加入2μ I去離子水和陽(yáng)性樣品DNA，并各加入濃度為2ng/ μ I內(nèi)部陽(yáng)性控制序列2 μ 1，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增結(jié)束后在濃度為2%的瓊脂糖DNA凝膠電泳上成像，查看PCR擴(kuò)增情況。受檢者外周血標(biāo)本CYP3A4基因第1~3外顯子、4~7外顯子、8~11外顯子和12~13外顯子擴(kuò)增片段大小分別應(yīng)為3780bp、4500bp、5210bp、4281bp左右，而且均有390bp左右條帶一個(gè)，陽(yáng)性對(duì)照組為800bp和390bp左右條帶各一個(gè)，陰性對(duì)照組為390bp條帶I個(gè)，如圖1所示。
[0125]最后，回收純化PCR產(chǎn)物以得到受檢者CYP3A4第I~3外顯子、4~7外顯子、8~11外顯子和12~13外顯子的長(zhǎng)片段中的一個(gè)，將該DNA片段用于測(cè)序反應(yīng)的模板，配制PCR測(cè)序反應(yīng)液后進(jìn)行PCR測(cè)序反應(yīng)，將PCR測(cè)序反應(yīng)物純化后上測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。
[0126]CYP3A4基因多態(tài)性的具體檢測(cè)步驟如下:
[0127]①受檢者外周血基因組DNA的抽提:采用實(shí)施例1試劑盒中的基因組DNA提取試劑按DNA抽提純化的方法快速提取0.5ml受檢者外周血基因組DNA。
[0128]②將上述提取的受檢者外周血基因組DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定260nm與280nm光密度值計(jì)算DNA的純度與濃度，用無(wú)菌去離子水調(diào)節(jié)抽提的DNA至相同濃度，置冰箱_20°C保存。
[0129]③將實(shí)施例1試劑盒中的內(nèi)部陽(yáng)性控制序列標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)參基因ACTB標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋至濃度為2ng/y I。
[0130]④內(nèi)參基因ACTB的PCR擴(kuò)增:
[0131]PCR反應(yīng)體系為20 μ L，在該反應(yīng)體系中各成分及終濃度如下:1Χ的PCR預(yù)混合液(Qiagen 公司，產(chǎn)品貨號(hào):210212, 2XPCR Premix, 10.0μ L)、Mg2+:3mM ； dNTPs:0.3mM ；dUTP:0.5mM ；Taq 酶:0.2U/μ L ；BSA:1.25wt% ；T4 噬菌體的基因 32 編碼蛋白:lnmol/L ；內(nèi)參基因ACTB上、下游引物均為:0.25pmol/yL;內(nèi)部陽(yáng)性控制序列上、下游引物均為:0.25pmol/ μ L ;內(nèi)部陽(yáng)性控制序列:0.3pmol/ μ L ;內(nèi)參基因ACTB序列:0.2ng/ μ I ;其余為無(wú)RNase去離子水。
[0132]在ABI9700PCR儀器上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序?yàn)?先經(jīng)過(guò)95° C3min，然后950C 30s, 570C 3.6min，72°C 3min，35 個(gè)循環(huán)，最后 72°C IOmin0
[0133]PCR擴(kuò)增結(jié)束后在濃度為2%的瓊脂糖DNA凝膠電泳上成像，從電泳圖中可以看到存在390bp和SOObp左右的兩個(gè)條帶，提示整個(gè)檢測(cè)過(guò)程有效，因此可以進(jìn)行以下操作。
[0134]⑤CYP3A4基因第I~3外顯子、4~7外顯子、8~11外顯子和12~13外顯子長(zhǎng)片段PCR擴(kuò)增:
[0135]上述四個(gè)CYP3A4基因長(zhǎng)片段的PCR反應(yīng)體系均為20 μ L，在該反應(yīng)體系中各成分及終濃度如下=IX的PCR預(yù)混合液(Qiagen公司，產(chǎn)品貨號(hào):210212，2XPCR Premix,10.0μ L) ；Mg2+:3mM ；dNTPs:0.3mM ；dUTP:0.5mM ；Taq 酶:0.2U/μ L ；BSA:1.25wt% ；T4 噬菌體的基因32編碼蛋白:lnmol/L ；CYP3A4基因第I~3外顯子、第4~7外顯子、第8~11外顯子或第12~13外顯子長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性上、下游引物均為0.25ρπι01/μ L ;內(nèi)部陽(yáng)性控制序列上、下游引物均為0.25ρπι01/μ L ;內(nèi)部陽(yáng)性控制序列:0.3pmol/yL ;受檢者外周血基因組DNA的用量為2 μ L ;其余為無(wú)RNase去離子水。
[0136]在CYP3A4基因第I~3外顯子、4~7外顯子、8~11外顯子和12~13外顯子長(zhǎng)片段PCR擴(kuò)增的同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照的反應(yīng)體系均為20 μ L，在該反應(yīng)體系中各成分及終濃度如下:1Χ的PCR預(yù)混合液(Qiagen公司，產(chǎn)品貨號(hào):210212，2XPCR Premix, 10.0μ L)；Mg2+:3mM ；dNTPs:0.3mM ；dUTP:0.5mM ；Taq 酶:0.2U/μ L ；BSA:1.25wt% ；T4噬菌體的基因32編碼蛋白:lnmol/L ;內(nèi)參基因ACTB擴(kuò)增上、下游引物均為:0.25pm0l/y L ;內(nèi)部陽(yáng)性控制序列上、下游引物均為0.25pm0l/y L ;內(nèi)部陽(yáng)性控制序列:0.3pmol/yL ;陽(yáng)性樣品或者陰性樣品的用量為2 μ L，其余為無(wú)RNase去離子水。
[0137]在ABI9700PCR儀器上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序?yàn)?先經(jīng)過(guò)95°C 3min,然后95°C 30s, 57°C 3.6min，72°C 3min，35 個(gè)循環(huán)，最后 72°C IOmin0
[0138]PCR擴(kuò)增結(jié)束后在濃度為2%的瓊脂糖DNA凝膠電泳上成像。如圖1所示。
[0139]⑥分別切取CYP3A4基因第I~3外顯子、第4~7外顯子、第8~11外顯子和第12~13外顯子長(zhǎng)片段擴(kuò)增PCR產(chǎn)物以及內(nèi)部陽(yáng)性控制序列PCR產(chǎn)物，利用Axy公司DNA凝膠回收試劑盒回收純化擴(kuò)增的DNA片段。
[0140]⑦測(cè)序反應(yīng)液的配制:取4口1 Buffer測(cè)序緩沖液，濃度均為2ng/μ I的步驟⑥回收純化得到的四個(gè)長(zhǎng)片段DNA各I μ 1，再相對(duì)應(yīng)地取濃度均為lpmol/ml的CYP3A4基因第1、2、3、4、5~6、7、8、9、10、11、12和13外顯子上下游測(cè)序引物各I μ I。
[0141]在ΑΒΙ9700儀器上先98°C變性2min，然后進(jìn)行PCR循環(huán)，PCR循環(huán)參數(shù)為96°C 10s，50°C 5s, 60°C 4min，25個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增結(jié)束后設(shè)置4°C保溫。
[0142]⑧采用醋酸鈉/乙醇法純化步驟⑦的測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物，按照ABI3130測(cè)序儀的操作說(shuō)明進(jìn)行測(cè)序。
[0143]⑨數(shù)據(jù)收集處理和分析:將所測(cè)得序列在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)分析，分析CYP3A4基因多態(tài)性，結(jié)果參見(jiàn)表1。
[0144]表1為長(zhǎng)片段PCR測(cè)序法分析受檢者外周血基因組中CYP3A4基因多態(tài)性
[0145]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)CYP3A4基因多態(tài)性的試劑盒，包括檢測(cè)用引物，其特征在于，所述檢測(cè)用引物包括:CYP3A4基因第I~3外顯子的長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性上下游引物、CYP3A4基因第4~7外顯子的長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性上下游引物、CYP3A4基因第8~11外顯子的長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性上下游引物和CYP3A4基因第12~13外顯子的長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性上下游引物中的至少一對(duì)，以及與所述第I~3外顯子的長(zhǎng)片段DNA、第4~7外顯子的長(zhǎng)片段DNA、第8~11外顯子的長(zhǎng)片段DNA以及第12~13外顯子的長(zhǎng)片段DNA相對(duì)應(yīng)的CYP3A4基因的各外顯子的上下游測(cè)序引物中的至少一對(duì)，其中: 所述CYP3A4基因第I~3外顯子長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性上游引物序列如序列表中SEQ IDNO:1所示； 所述CYP3A4基因第I~3外顯子長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性下游引物序列如序列表中SEQ IDN0:2所示； 所述CYP3A4基因第4~7外顯子長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性上游引物序列如序列表中SEQ IDN0:3所示； 所述CYP3A4基因第4~7外顯子長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性下游引物序列如序列表中SEQ IDNO:4所示； 所述CYP3A4基因第8~11外顯子長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性上游引物序列如序列表中SEQ IDN0:5所示； 所述CYP3A4基因第8~11外顯子長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性下游引物序列如序列表中SEQ IDNO:6所示； 所述CYP3A4基因第12~13外顯子長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性上游引物序列如序列表中SEQID NO:7 所示；. 所述CYP3A4基因第12~13外顯子長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性下游引物序列如序列表中SEQID NO:8 所示； 所述CYP3A4基因第I外顯子上游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ ID NO:9所示； 所述CYP3A4基因第I外顯子下游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 10所示； 所述CYP3A4基因第2外顯子上游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 11所示； 所述CYP3A4基因第2外顯子下游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 12所示； 所述CYP3A4基因第3外顯子上游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 13所示； 所述CYP3A4基因第3外顯子下游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 14所示； 所述CYP3A4基因第4外顯子上游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 15所示； 所述CYP3A4基因第4外顯子下游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 16所示； 所述CYP3A4基因第5~6外顯子上游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 17所示； 所述CYP3A4基因第5~6外顯子下游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 18所示； 所述CYP3A4基因第7外顯子上游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 19所示； 所述CYP3A4基因第7外顯子下游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 20所示； 所述CYP3A4基因第8外顯子上游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 21所示； 所述CYP3A4基因第8外顯子下游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 22所示； 所述CYP3A4基因第9外顯子上游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 23所示； 所述CYP3A4基因第9外顯子下游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 24所示；所述CYP3A4基因第10外顯子上游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 25所示； 所述CYP3A4基因第10外顯子下游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 26所示； 所述CYP3A4基因第11外顯子上游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 27所示； 所述CYP3A4基因第11外顯子下游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 28所示； 所述CYP3A4基因第12外顯子上游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 29所示； 所述CYP3A4基因第12外顯子下游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 30所示； 所述CYP3A4基因第13外顯子上游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 31所示； 所述CYP3A4基因第13外顯子下游測(cè)序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 32所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括內(nèi)參基因ACTB以及內(nèi)參基因ACTB擴(kuò)增引物，其中， 所述內(nèi)參基因ACTB擴(kuò)增引物的上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 33所示； 所述內(nèi)參基因ACTB擴(kuò) 增引物的下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:34所示； 所述內(nèi)參基因ACTB的序列如序列表中SEQ ID NO:35所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括測(cè)序緩沖液，優(yōu)選地，所述測(cè)序緩沖液為Buffer緩沖液,所述Buffer緩沖液的pH為8.3。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，其中，所述陰性對(duì)照為去離子水；所述陽(yáng)性對(duì)照為CYP3A4*8型的CYP3A4基因多態(tài)性中的含389G>A突變位點(diǎn)的基因序列DNA樣品。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括各種PCR反應(yīng)試劑或者各種PCR反應(yīng)試劑的混合物，優(yōu)選地，所述各種PCR反應(yīng)試劑包括:PCR預(yù)混合液、Mg2+(t匕如氯化鎂)、dNTPs、dUTP、Taq酶、牛血清白蛋白、T4噬菌體的基因32編碼蛋白以及無(wú)RNase去離子水。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括內(nèi)部陽(yáng)性控制序列以及內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的擴(kuò)增引物，其中: 所述內(nèi)部陽(yáng)性控制序列如序列表中SEQ ID NO:36所示； 所述內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的擴(kuò)增引物的上游引物如序列表中SEQ ID N0:37所示；所述內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的擴(kuò)增引物的下游引物如序列表中SEQ ID N0:38所示。
7.一種檢測(cè)CYP3A4基因多態(tài)性的方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟一，提取受檢者基因組DNA ； 步驟二，以步驟一得到的基因組DNA為模板，采用如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ IDNO: 2所示的CYP3A4基因第I~3外顯子的長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性上下游引物、如序列表中SEQID N0:3和SEQ ID NO:4所示的CYP3A4基因第4~7外顯子的長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性上下游引物、如序列表中SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6所示的CYP3A4基因第8~11外顯子的長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性上下游引物或者如序列表中SEQ ID N0:7和SEQ ID NO:8所示的CYP3A4基因第12~13外顯子的長(zhǎng)片段擴(kuò)增特異性上下游引物，PCR擴(kuò)增CYP3A4基因第I~3外顯子的長(zhǎng)片段DNA、CYP3A4基因第4~7外顯子的長(zhǎng)片段DNA、CYP3A4基因第8~11外顯子的長(zhǎng)片段DNA或CYP3A4基因第12~13外顯子的長(zhǎng)片段DNA ； 步驟三，對(duì)步驟二的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，并回收純化得到的CYP3A4基因第I~3外顯子的長(zhǎng)片段DNA、CYP3A4基因第4~7外顯子的長(zhǎng)片段DNA、CYP3A4基因第8~11外顯子的長(zhǎng)片段DNA或CYP3A4基因第12~13外顯子的長(zhǎng)片段DNA ； 步驟四，以步驟三回收純化后得到的產(chǎn)物為模板，采用如序列表中SEQ IDN0:9和SEQID NO: 10所示的上下游引物、SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12所示的上下游引物、SEQ IDNO: 13和SEQ ID NO: 14所示的上下游引物、SEQ IDNO:15和SEQ ID NO: 16所示的上下游引物、SEQ ID NO: 17和 SEQ ID NO: 18所示的上下游引物、SEQ ID NO: 19和 SEQ ID NO: 20 所示的上下游引物、SEQ IDNO:21和SEQ ID NO:22所示的上下游引物、SEQ ID NO:23和SEQ IDNO: 24所示的上下游引物、SEQ ID NO: 25和SEQ ID NO: 26所示的上下游引物、SEQ IDNO: 27和SEQ ID N0:28所示的上下游引物、SEQ ID N0:29和SEQ ID NO:30所示的上下游引物以及SEQ ID N0:31和SEQ ID NO:32所示的上下游引物中的至少一對(duì)相應(yīng)的上下游測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)； 步驟五，將步驟四得到的測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物純化后上測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)得序列在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)分析以獲得CYP2D6基因多態(tài)性。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，在所述步驟二中，所述PCR的反應(yīng)條件如下:先經(jīng)過(guò)95°C 3min ;然后進(jìn)入PCR循環(huán)，所述PCR循環(huán)為95°C 30s,57°C 3.6min、72°C 3min，共 35 個(gè)循環(huán)；最后 72°C IOmin0
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，在所述步驟四中，所述測(cè)序反應(yīng)的條件如下:先98°C變性2min，然后進(jìn)行PCR循環(huán)，PCR循環(huán)參數(shù)為96°C 10s，50°C 5s, 60°C 4min，共25個(gè)循環(huán)。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，在所述步驟二中，所述PCR反應(yīng)中還加入了如序列表中SEQ ID N0:36所示的內(nèi)部陽(yáng)性控制序列、如序列表中SEQ ID N0:37所示的內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的擴(kuò)增引物的上游引物以及如序列表中SEQ ID N0:38所示的內(nèi)部陽(yáng)性控制序列的擴(kuò)增引物的下游引物。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103468814SQ201310433222
【公開(kāi)日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月22日
【發(fā)明者】劉輝 申請(qǐng)人:劉輝