鴨IGF-Ⅰ和IGF-ⅠR基因mRNA表達量聯合檢測的試劑盒及使用方法
【專利摘要】本發明公開了一種鴨IGF-I和IGF-I?R基因mRNA表達量聯合檢測的試劑盒及使用方法，包括盒體(1)和隔離墊(2)，還包括IGF-I基因嵌合特異上下游引物(3)、IGF-I?R基因嵌合特異上下游引物(4)、參照基因ACTB基因嵌合特異上下游引物(5)、IGF-I基因內對照DNA(6)、IGF-I?R基因內對照DNA(7)Tag酶DNA連接酶(8)。本發明將設計獨特、穩定和高效的試劑盒與MCF-PCR技術結合，是一種可靠、便捷、價格低廉的檢測方法。
【專利說明】鴨IGF-1和IGF-1 R基因mRNA表達量聯合檢測的試劑盒及使用方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子生物學【技術領域】，涉及一種鴨IGF-1和IGF-1 R基因mRNA表達量聯合檢測的試劑盒及使用方法。
【背景技術】
[0002]我國是世界上最大的水禽生產國和消費國，但是我國水禽業整體生產水平不高，競爭力不強，水禽領域的技術很薄弱、可供利用的科學研究成果很少，特別是有關鴨肌肉生長發育分子技術方面的研究成果極少，因此，要想在短期內快速有效地提高我國鴨業生產水平，就必須借助先進的分子生物學的技術和成果，加快我國鴨業的發展。
[0003]MCF-PCR技術是一種經濟、較高通量、準確的多基因表達分析技術，該技術基于競爭性PCR原理，結合熒光通用引物和多重嵌合特異引物使用，實現多重PCR擴增以及毛細管電泳長度差異片段分離，對多個目標基因及參照基因進行同時定量，最后以參照基因校正即可獲取目標基因的相對表達量。目前已經廣泛應用于人類和動物基因表達檢測研究。國內外大量的研究報道，IGF-1和IGF-1 R基因在鴨生長發育調控過程中起重要作用。IGF-1和IGF-1R基因在組織中表達量的準確分析對IGF-1和IGF-1 R基因的功能揭示和應用都有顯著的科學和現實意義。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于克服上述技術存在的缺陷，提供一種鴨IGF-1和IGF-1 R基因mRNA表達量聯合檢測的試劑盒及使用方法，將設計獨特、穩定和高效的試劑盒與MCF-PCR技術結合，是一種可靠、便捷、價格低廉的檢測方法。
[0005]其具體技術方案為:
[0006]一種鴨IGF-1和IGF-1 R基因mRNA表達量聯合檢測的試劑盒，包括盒體和隔離墊，還包括IGF-1基因嵌合特異上下游引物、IGF-1 R基因嵌合特異上下游引物、參照基因ACTB基因嵌合特異上下游引物、IGF-1基因內對照DNA、IGF-1 R基因內對照DNA、Tag酶DNA連接酶。
[0007]一種本發明所述的鴨IGF-1和IGF-1 R基因mRNA表達量聯合檢測的試劑盒及使用方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0008]1)引物設計
[0009]通用引物的設計:
[0010]設計原則保證上下游引物的TM值≤58°C，為了避免通用引物帶來非特異產物，通用引物的長度為18bp，上游通用引物5’端用Fam熒光標記；
[0011]嵌合特異引物的設計:
[0012]根據GenBank數據庫中目標基因IGF-1和IGF-1 R及參照基因ACTB基因的cDNA序列信息，設計了 3對20~26bp長的序列作為嵌合特異引物，TM值> 61°C，擴增產物長度在200~3IObp之間，相鄰產物長度的差大于10bp，之后與通用引物組成嵌合特異引物，且在通用引物的3’端插入ct兩個堿基,引物經Blast和Oligo mask軟件分析，確保特異性擴增；
[0013]IGF-1基因嵌合特異上下游引物Pl和P2、IGF-1 R基因嵌合特異上下游引物P3和P4、參照基因ACTB基因嵌合特異上下游引物P5和P6，Pl~P6六條引物詳細信息如下，每條引物中小寫ct前是通用引物，小寫ct后為特異引物:
[0014]IGF-1基因嵌合特異上游引物Pl表示的信息為:
[0015]5’ -AGGTCGTCCATCGTAGTCctCTGGTTGATGCTCTTCAGTTCGTAT-3’
[0016]IGF-1基因嵌合特異下游引物P2表示的信息為:
[0017]5，-ACAGCGTCGTTATCGTTCctTGCAGACTTAGGTGGCTTTATTGGA-3，
[0018]IGF-1 R基因嵌合特異上游引物P3表示的信息為:
[0019]5’ -AGGTCGTCCATCGTAGTCctTTCAGGAACCAAAGGGCGACA-3’
[0020]IGF-1 R基因嵌合特異下游引物P4表示的信息為:
[0021]5’ -ACAGCGTCGTTATCGTTCctCAACATCAACCATATTCCAGCTATTG-3’
[0022]參照基因ACTB嵌合特異上游引物P5表示的信息為:
[0023]5’ -AGGTCGTCCATCGTAGTCctGTCCA`CCTTCCAGCAGATGT-3’
[0024]參照基因ACTB嵌合特異下游引物P6表示的信息為:
[0025]5， -ACAGCGTCGTTATCGTTCctAGTCAAGCGCCAAAAGAAAA-3，；
[0026]2)合成內對照DNA片段
[0027]針對IGF-1和IGF-1 R基因和參照基因ACTB的擴增片段，合成與對應引物擴增序列相比插入3bp堿基的DNA片段為內對照序列，并進行精確定量，配制內對照DNA混合液，梯度稀釋至IO3~IO4個分子/ μ?；
[0028]3)多重競爭性PCR反應
[0029]a)肝臟總RNA提取按TRNzol-A+總RNA提取試劑盒(DP421)的說明書進行，RNA樣品經1.4%瓊脂糖-甲醛變性凝膠電泳和紫外分光光度計檢測，OD2607280L 8~2.0，保證RNA樣品質量可靠，均一化RNA濃度至I μ g/ μ 1，取I μ g總RNA，cDNA第I鏈的合成按照反轉錄試劑盒QuantScript RT Kit, KR103-04的使用說明書進行；
[0030]b)配制PCR引物混合液，含3對0.5 μ M的嵌合特異引物Ρ1、Ρ2 ;Ρ3、Ρ4和Ρ5、Ρ6，20 μ M的通用引物,兩者等比例混合；
[0031]c)多重PCR反應體系 10XGT Buffer含34mM Mg2+L 5 μ 1，IOOmM Mg2+0.09 μ I, dNTPmix 各 2.5mM3 μ I, Primers 引物混合物 3 μ I, Taq DNA Polymerase5units / μ 10.75 μ I,Templates cDNAl.5 μ I,BSAlOmg / ml0.21 μ I，內對照DNAlul，DEPC H2O補水至 15 μ 1，反應過程為 94°C 2min, 94°C 30s, 62°C 90s, 65°C lmin, 20cycles ；94°C 2min, 94°C 30s, 53°C 90s,68°C lm, 68°C 20min, 18cycles ；
[0032]d)取I μ I PCR產物，加入8.6 μ I的Hi_Di和0.4 μ I的DNA分子標準，上述混合物95°C，變性5min，然后迅速冰水浴2min，離心后用ABI測序儀3730檢測，電泳結果經GeneScan Analysis3.0和GeneMapper ID software ν3.2軟件分析獲得每個基因位點的樣本條帶/內對照條帶大小、峰高、峰面積的數據，產物大小由DNA分子標準得出，峰高或峰面積用于判斷PCR產物的量；[0033]4)數據分析
[0034]a)計算每個基因位點的比值(S) /內對照DNA條帶(1)的熒光峰高或峰面積之比
S/ I ；
[0035]b)將每個目標基因位點的比值(S / I)分別除以參照基因的比值(S / I)即可獲得樣本目標基因的相對表達量。
[0036]與現有技術相比，本發明的有益效果為:
[0037]本發明一種鴨IGF-1和IGF-1 R基因mRNA表達量聯合檢測的試劑盒及使用方法，將設計獨特、穩定和高效的試劑盒與MCF-PCR技術結合，是一種可靠、便捷、價格低廉的檢測方法。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0038]圖1是本發明鴨IGF-1和IGF-1 R基因mRNA表達量聯合檢測的試劑盒的結構示意圖。
【具體實施方式】
[0039]下面結合附圖和具體實施例對本發明的技術方案作進一步詳細地說明
[0040]參照圖1，一種鴨IGF-1和IGF-1 R基因mRNA表達量聯合檢測的試劑盒，包括盒體I和隔離墊2，還包括IGF-1基因嵌合特異上下游引物3、IGF-1 R基因嵌合特異上下游引物4、參照基因ACTB基因嵌合特異上下游引物5、IGF-1基因內對照DNA6、IGF-1 R基因內對照DNA7、Tag酶DNA連接酶8。
[0041]一種本發明所述的鴨IGF-1和IGF-1 R基因mRNA表達量聯合檢測的試劑盒的使用方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0042]4)引物設計
[0043]通用引物的設計:
[0044]設計原則保證上下游引物的TM值< 58°C，為了避免通用引物帶來非特異產物，通用引物的長度為18bp，上游通用引物5’端用Fam熒光標記；
[0045]嵌合特異弓丨物的設計:
[0046]根據GenBank數據庫中目標基因IGF-1和IGF-1 R及參照基因ACTB基因的cDNA序列信息，設計了 3對20~26bp長的序列作為嵌合特異引物，TM值> 61°C，擴增產物長度在200~3IObp之間，相鄰產物長度的差大于10bp，之后與通用引物組成嵌合特異引物，且在通用引物的3’端插入ct兩個堿基,引物經Blast和Oligo mask軟件分析，確保特異性擴增；
[0047]IGF-1基因嵌合特異上下游引物Pl和P2、IGF-1 R基因嵌合特異上下游引物P3和P4、參照基因ACTB基因嵌合特異上下游引物P5和P6，Pl~P6六條引物詳細信息如下，每條引物中小寫ct前是通用引物，小寫ct后為特異引物:
[0048]IGF-1基因嵌合特異上游引物Pl表示的信息為:
[0049]5’ -AGGTCGTCCATCGTAGTCctCTGGTTGATGCTCTTCAGTTCGTAT-3’
[0050]IGF-1基因嵌合特異下游引物P2表示的信息為:
[0051]5’ -ACAGCGTCGTTATCGTTCctTGCAGACTTAGGTGGCTTTATTGGA-3’[0052]IGF-1 R基因嵌合特異上游引物P3表示的信息為:
[0053]5， -AGGTCGTCCATCGTAGTCctTTCAGGAACCAAAGGGCGACA-3’
[0054]IGF-1 R基因嵌合特異下游引物P4表示的信息為:
[0055]5’ -ACAGCGTCGTTATCGTTCctCAACATCAACCATATTCCAGCTATTG-3’
[0056]參照基因ACTB嵌合特異上游引物P5表示的信息為:
[0057]5’ -AGGTCGTCCATCGTAGTCctGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3’
[0058]參照基因ACTB嵌合特異下游引物P6表示的信息為:
[0059]5， -ACAGCGTCGTTATCGTTCctAGTCAAGCGCCAAAAGAAAA-3，；
[0060]5)合成內對照DNA片段
[0061]針對IGF-1和IGF-1 R基因和參照基因ACTB的擴增片段，合成與對應引物擴增序列相比插入3bp堿基的DNA片段為內對照序列，并進行精確定量，配制內對照DNA混合液，梯度稀釋至IO3~IO4個分子/ μ?；
[0062]6)多重競爭性PCR反應
[0063]a)肝臟總RNA提取按TRNzol-A+總RNA提取試劑盒(DP421)的說明書進行，RNA樣品經1.4%瓊脂糖-甲醛變性凝膠電泳和紫外分光光度計檢測，OD26tl / 2801.8~2.0，保證RNA樣品質量可靠，均一化RNA濃度至I μ g/ μ 1，取I μ g總RNA，cDNA第I鏈的合成按照反轉錄試劑盒QuantScript RT Kit, KR103-04的使用說明書進行；
[0064]b)配制PCR引物混合液，含3對0.5 μ M的嵌合特異引物Ρ1、Ρ2 ;Ρ3、Ρ4和Ρ5、Ρ6，20 μ M的通用引物,兩者等比例混合；
[0065]c)多重PCR反應體系 10XGT Buffer含34mM Mg2+L 5 μ 1，IOOmM Mg2+0.09 μ I, dNTPmix 各 2.5mM3 μ I, Primers 引物混合物 3 μ I, Taq DNA Polymerase5units / μ 10.75 μ I,Templates cDNAl.5 μ I,BSAlOmg / ml0.21 μ I，內對照DNAlul，DEPC H2O補水至 15 μ 1，反應過程為 94°C 2min, 94°C 30s, 62°C 90s, 65°C lmin, 20cycles ；94°C 2min, 94°C 30s, 53°C 90s,68°C lm, 68°C 20min, 18cycles ；
[0066]d)取I μ I PCR產物，加入8.6 μ I的Hi_Di和0.4 μ I的DNA分子標準，上述混合物95°C，變性5min，然后迅速冰水浴2min，離心后用ABI測序儀3730檢測，電泳結果經GeneScan Analysis3.0和GeneMapper ID software ν3.2軟件分析獲得每個基因位點的樣本條帶/內對照條帶大小、峰高、峰面積的數據，產物大小由DNA分子標準得出，峰高或峰面積用于判斷PCR產物的量；
[0067]4)數據分析
[0068]a)計算每個基因位點的比值(S) /內對照DNA條帶(1)的熒光峰高或峰面積之比
S/ I ；
[0069]b)將每個目標基因位點的比值(S / I)分別除以參照基因的比值(S / I)即可獲得樣本目標基因的相對表達量。
[0070]實施例1，運用本發明提供的試劑盒和方法對4周齡高郵鴨的肝臟組織進行相對定量分析。
[0071]1、樣品及RNA提取
[0072]采集4周齡高郵鴨肝臟組織5份。肝臟總RNA提取按TRNzol-A+總RNA提取試劑盒(DP421)的說明書進行。RNA樣品經1.4%瓊脂糖-甲醛變性凝膠電泳和紫外分光光度計檢測，OD260 / 2801.8~2.0,保證RNA樣品質量可靠,均一化RNA濃度至I μ g/ μ I。
[0073]2、引物設計
[0074]引物設計按照所述方法步驟I執行。IGF-1基因嵌合特異上下游引物(Pl和Ρ2)、IGF-1 R基因嵌合特異上下游引物(Ρ3和Ρ4)、參照基因ACTB基因嵌合特異上下游引物(Ρ5和 Ρ6)。
[0075]IGF-1基因嵌合特異上游引物Pl表示的信息為:
[0076]5’ -AGGTCGTCCATCGTAGTCctCTGGTTGATGCTCTTCAGTTCGTAT-3’
[0077]IGF-1基因嵌合特異下游引物P2表示的信息為:
[0078]5’ -ACAGCGTCGTTATCGTTCctTGCAGACTTAGGTGGCTTTATTGGA-3’
[0079]IGF-1 R基因嵌合特異性上游引物P3表示的信息為:
[0080]5， -AGGTCGTCCATCGTAGTCctTTCAGGAACCAAAGGGCGACA-3’
[0081]IGF-1 R基因嵌合特異下游引物P4表示的信息為:
[0082]5’ -ACAGCGTCGTTATCGTTCctCAACATCAACCATATTCCAGCTATTG-3
[0083]參照基因ACTB嵌合特異上游引物P5表示的信息為:
[0084]5， -AGGTCGTCCATCGTAGTCctGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3，
[0085]參照基因ACTB嵌合`特異下游引物P6表示的信息為:
[0086]5， -ACAGCGTCGTTATCGTTCctAGTCAAGCGCCAAAAGAAAA-3’
[0087]3、IGF-1、IGF-1 R 和 ACTB 基因競爭性 PCR 反應
[0088]多重競爭性PCR反應按照試劑盒使用方法步驟2進行。
[0089]4、數據分析如表1所示:
[0090]表1
【權利要求】
1.一種鴨IGF-1和IGF-1 R基因mRNA表達量聯合檢測的試劑盒，其特征在于，包括盒體(1)和隔離墊(2)，還包括IGF-1基因嵌合特異上下游引物(3)、IGF-1 R基因嵌合特異上下游引物⑷、參照基因ACTB基因嵌合特異上下游引物(5)、IGF-1基因內對照DNA (6)、IGF-1 R基因內對照DNA (7)、Tag酶DNA連接酶⑶。
2.—種權利要求1所述的鴨IGF-1和IGF-1 R基因mRNA表達量聯合檢測的試劑盒的使用方法，其特征在于，包括以下步驟: . 7)引物設計 通用引物的設計: 設計原則保證上下游引物的TM值≤58°C，通用引物的長度為18bp，上游通用引物5’端用Fam突光標記； 嵌合特異引物的設計: 根據GenBank數據庫中目標基因IGF-1和IGF-1 R及參照基因ACTB基因的cDNA序列信息，設計了 3對20~26bp長的序列作為嵌合特異引物，TM值≥ 61°C，擴增產物長度在200~310bp之間，相鄰產物長度的差大于10bp，之后與通用引物組成嵌合特異引物，且在通用引物的3’端插入ct兩個堿基,引物經Blast和Oligo mask軟件分析,確保特異性擴增； IGF-1基因嵌合特異上下游引物Pl和P2、IGF-1 R基因嵌合特異上下游引物P3和P4、參照基因ACTB基因嵌合特異上下游引物P5和P6，P1~P6六條引物詳細信息如下，每條引物中小寫ct前是通用引物，小寫ct后為特異引物: IGF-1基因嵌合特異上游引物Pl表示的信息為:
.5，-AGGTCGTCCATCGTAGTCctCTGGTTGATGCTCTTCAGTTCGTAT-3， IGF-1基因嵌合特異下游引物P2表示的信息為: . 5，-ACAGCGTCGTTATCGTTCctTGCAGACTTAGGTGGCTTTATTGGA-3， IGF-1 R基因嵌合特異上游引物P3表示的信息為: . 5，-AGGTCGTCCATCGTAGTCctTTCAGGAACCAAAGGGCGACA-3， IGF-1 R基因嵌合特異下游引物P4表示的信息為: . 5，-ACAGCGTCGTTATCGTTCctCAACATCAACCATATTCCAGCTATTG-3， 參照基因ACTB嵌合特異上游引物P5表示的信息為: . 5，-AGGTCGTCCATCGTAGTCctGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3， 參照基因ACTB嵌合特異下游引物P6表示的信息為: . 5’ -ACAGCGTCGTTATCGTTCctAGTCAAGCGCCAAAAGAAAA-3’ ； .8)合成內對照DNA片段 針對IGF-1和IGF-1 R基因和參照基因ACTB的擴增片段，合成與對應引物擴增序列相比插入3bp堿基的DNA片段為內對照序列，并進行精確定量，配制內對照DNA混合液，梯度稀釋至1O（3）~IO（4）個分子/ μ 1 ; . 9)多重競爭性PCR反應 a)肝臟總RNA提取按TRNzol-A+總RNA提取試劑盒(DP421)的說明書進行，RNA樣品經1.4%瓊脂糖-甲醛變性凝膠電泳和紫外分光光度計檢測，OD260丨2801.8~2.0，保證RNA樣品質量可靠，均一化RNA濃度至1ug/ μ 1，取I μ g總RNA，cDNA第I鏈的合成按照反轉錄試劑盒QuantScript RT Kit, KR103-04的使用說明書進行； b)配制PCR引物混合液，含3對0.5μ M的嵌合特異引物P1、P2 ;P3、P4和P5、P6，20 μ M的通用引物，兩者等比例混合；
c)多重PCR 反應體系 10XGT Buffer 含 34mM Mg2+L 5 μ I, IOOmM Mg2+0.09 μ I, dNTPmix 各 2.5mM3 μ I, Primers 引物混合物 3 μ I, Taq DNA Polymerase5units / μ 10.75 μ I,Templates cDNAl.5μ I,BSAlOmg / ml0.21 μ I，內對照DNAlul，DEPC H2O補水至 15 μ 1，反應過程為 94°C 2min, 94°C 30s, 62°C 90s, 65°C lmin, 20cycles ；94°C 2min, 94°C 30s, 53°C 90s,68°C lm, 68°C 20min, 18cycles ； d)取Iμ I PCR產物，加入8.6 μ I的H1-Di和0.4 μ I的DNA分子標準，上述混合物95°C，變性5min，然后迅速冰水浴2min，離心后用ABI測序儀3730檢測，電泳結果經GeneScan Analysis3.0和GeneMapper ID software ν3.2軟件分析獲得每個基因位點的樣本條帶/內對照條帶大小、峰高、峰面積的數據，產物大小由DNA分子標準得出，峰高或峰面積用于判斷PCR產物的量； 4)數據分析 a)計算每個基因位點的比值S/內對照DNA條帶I的熒光峰高或峰面積之比S / I ; b)將每個目標基因位點的比值S/ I分別除以參照基因的比值S / I即獲得樣本目標基因的相對表達量。
【文檔編號】C12M1/00GK103497886SQ201310432585
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年9月13日 優先權日:2013年9月13日
【發明者】李慧芳, 朱文奇, 張靜, 宋衛濤, 胡艷, 宋遲, 束婧婷, 朱春紅, 陶志云, 徐文娟, 善艷菊 申請人:江蘇省家禽科學研究所