一種辣椒疫霉菌lamp引物及其快速檢測方法

文檔序號：518835閱讀：695來源：國知局

一種辣椒疫霉菌lamp引物及其快速檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種辣椒疫霉菌LAMP引物及其快速檢測方法，專用于辣椒疫霉菌特異檢測。主要設計了一種辣椒疫霉菌的LAMP引物（F3、B3，FIP、BIP），采用該引物進行恒溫擴增和加入50μMCalcein-500μMMnCl2顯色劑顯色或瓊脂糖凝膠電泳檢測，可觀察到綠色熒光或出現LAMP特征性的梯形帶。本發明可被用于生產實踐中辣椒疫霉菌感染的植株和土壤中辣椒疫霉菌的快速、靈敏、準確的檢測，同時可用于田間病害的早期診斷和病菌的監測和鑒定，為辣椒疫霉菌引起的病害防治提供可靠的技術和理論依據。
【專利說明】一種辣椒疫霉菌LAMP引物及其快速檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種辣椒疫霉菌LAMP引物及其快速檢測方法，專用于辣椒疫霉菌高靈敏度快速分子檢測，同時可用于田間辣椒疫病的早期診斷和病菌的監測和鑒定，屬于農作物病害檢測、鑒定及防治【技術領域】。
【背景技術】
[0002]辣椒疫病是一種世界范圍內普遍發生的毀滅性真菌病害，其首先于1918年在美國新墨西哥州發現，引起辣椒疫病的辣椒疫霉菌Phytophthora capsici Leonian是LeonLeonian于1922年命名的，它屬于植物病原卵菌。辣椒疫霉以卵孢子或厚垣孢子在土壤病殘體中越冬，可以存活數月甚至更長時間，寄主范圍廣，主要侵染辣椒、番茄、茄子、黃瓜、南瓜等多種重要蔬菜作物。辣椒疫病露地和保護地均能發生，該病的流行致使辣椒損失嚴重，一般病株率為15-30%，嚴重時達80%以上。自1980年以來，辣椒疫病在我國蔬菜種植區域發病程度日趨加重，嚴重影響了蔬菜種植業的經濟效益，給我國的蔬菜安全生產造成了巨大的經濟損失。因此，預防與控制由辣椒疫霉引起的蔬菜疫病的爆發成為保障我國蔬菜生產的重要任務。對發病植物進行快速準確的病害診斷、對無病植物材料和植物生長環境中病原菌的及時檢測和監測是控制植物病害發生、流行和成災的重要基礎。因此建立辣椒疫霉菌快速檢測體系，早期對發病植株及土壤進行疫霉菌快速準確檢測，對預測病害發生情況、及時采取有效的防治措施控制病原菌的傳播和流行、減少經濟損失都具有重要的理論和實際意義。
[0003]目前對辣椒疫霉菌的檢測大多仍沿用傳統的培養及鑒定方法，傳統的病原菌檢測技術是在分離得到病原物的基礎上，通過形態學觀察和柯赫氏法則來判斷病原物的種類。整個過程常常需要耗費大量的勞動力和時間，一般需要幾天才能完成。而且要求操作者具備專業的病原菌分離、形態學鑒定知識和豐富的經驗。因此，以形態特征為基礎的常規病害診斷技術，由于其耗時長，效率低，難以滿足對辣椒疫病診斷的實際需要，因其很容易錯過病害防治的最佳時期。因此，建立一套快速、靈敏、準確的辣椒疫霉菌檢測診斷技術不僅非常必要，而且十分迫切。
[0004]PCR技術為植物病原診斷提供了快速、靈敏、準確的優勢，然而目前PCR特異性檢測技術仍然需要PCR儀、電泳和凝膠成像系統等昂貴的專業儀器和分子生物學試劑，且需要分子生物學專業實驗人員操作，限制了 PCR檢測方法的推廣應用。循環恒溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification,簡稱 LAMP)是 2000 年由日本榮研株式會社Notomi等人開發的一種新型循環恒溫核酸擴增技術。LAMP反應針對靶基因的6個位點設計出4條引物,利用一種鏈式置換活性的DNA聚合酶(fci DNA polymerase),在恒溫條件下(60 - 650C )保溫30 - 90分鐘，即可完成擴增反應。由于LAMP反應的高效性和等溫快速擴增的特點，在90分鐘內可擴增IO9 - 101°倍產物。LAMP擴增產物的檢測一般采用熒光染料目測觀察、瓊脂糖凝膠電泳和濁度觀察等方法。由于LAMP反應簡單、快速、高效、經濟等特征，因而具有極為廣泛的應用前景。目前LAMP檢測主要應用于人畜病原物、食品安全和環境衛生的檢測，在植物病原菌檢測中報道極少，辣椒疫霉菌的檢測國內外均未見報道。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是針對現有技術中辣椒疫霉菌的生物學檢測方法所需周期長、檢測方法特異性差，靈敏度低的問題，提供一種辣椒疫霉菌的LAMP檢測引物以及結果可靠、易于操作、特異性強、靈敏度高的辣椒疫霉菌的快速檢測方法。
[0006]實現本發明的目的包括下列步驟:
1.LAMP引物的設計
我們從GenBank中下載辣椒疫霉ITS基因(登錄號:FN257934)序列，根據辣椒疫霉ITS基因序列，采用PrimerExplorer V4軟件設計一種LAMP檢測引物，包括2條外引物(F3和B3)和2條內引物(FIP和BIP)，引物序列分別為:
F3:5， - TTGGCTTCGGCTGAACAG -3，；
B3:5’ - GCGGGAAATTCTTGCCTGAA -3’ ；
FIP:5’ - CGCAACAGCAAAGCCGATTCAA-ATGCTTTTCCTGCTGTGGC -3’ ；
BIP:5’ - GGCTGTCGAGGGTCGATCCA-AGGTCCAATTGAGATGCGC -3’。
[0007]2.辣椒疫霉菌快速檢測體系的建立
LAMP檢測:LAMP反應體系25 μ 1，其中F3與Β3各0.25-0.30uM, FIP與BIP各1.6-1.8uM,20mM Tris-HCl, IOmM (NH4)2SO4, IOmM KCl,8mM MgSO4,0.1% Tween-20,0.8MBetaine, 1.4 mM dNTPs,8U BstMk聚合酶大片段，10_50ng DNA模板,不足部分用無菌雙蒸水補足；LAMP反應條件為在60-65°C溫育30-90 min，80°C保溫5-10min。
[0008]所述的檢測方法為熒光染料目測觀察法和瓊脂糖凝膠電泳法。所述熒光染料目測觀察法:在LAMP反應的最終擴增產物中加入1μ I顯色劑，所述顯色劑為50 μ MCalcein-500 μ M MnCl2，顯色結果觀察到綠色熒光判斷為陽性，橙色判斷為陰性。所述瓊脂糖凝膠電泳法:取2 μ I PCR擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果出現LAMP特征性的梯形帶判斷為陽性，沒有出現擴增條帶判斷為陰性。
[0009]本發明建立了辣椒疫霉菌快速、簡便、特異性強、靈敏度高的監測技術體系，對于辣椒疫霉菌引起病害顯癥之前的早期監測，確定病害防治最佳時期具有十分重要的意義。可用于帶菌的植株和土壤的高靈敏度快速檢測。
[0010]①當在用于辣椒組織中存在辣椒疫霉菌時，采用NaOH快速裂解法提取辣椒疫霉菌的DNA，具體過程如下:(1)將辣椒病葉或病莖洗凈、晾干，剪取發病部位；(2)按Img病葉加入10 μ I (0.5mol/L NaOH, 0.5%PVP)計量，將組織充分磨碎成糊，在12，OOOg離心機中離心5min ； (3)取上清20 μ I與等體積的0.1 mol/L的Tris-HCl (ρΗ8.0)混合；(4)稀釋10倍、100倍、1000倍液，分別取I μ I原液、10倍、100倍、1000倍液作為PCR模板進行擴增。
[0011]②當在用于辣椒土壤中存在辣椒疫霉菌時，采用土壤DNA提取法提取土壤中辣椒疫霉菌的DNA。具體方法如下:取過篩的土壤冷凍抽干24-48 h后加少量石英砂，倒入液氮充分研磨，將研磨后的土壤細粉分裝至1.5 ml離心管中，每管加入500 μ I 0.4%脫脂奶粉溶液，渦旋混勻。12000 rpm離心15 min。取上清加入等體積蛋白酶K緩沖液，加終濃度為10 ug/ml蛋白酶K，55°C水浴1_3 h。水浴結束后，加入1/2體積的7.5 M NH4AC溶液，上下顛倒混勻。12000 rpm離心15 min。吸上清加2倍體積無水乙醇_20°C沉淀(沉淀時間1.5 h)。沉淀結束后，12000 rpm離心15 min。用70%乙醇洗滌沉淀后傾去，室溫晾干。每份樣品所提DNA用10 μ I TE (或無菌超純水)溶解，_20°C保存備用。
[0012]按如下LAMP反應體系和反應條件用所設計的引物進行檢測:
①優選的LAMP反應體系25 μ 1:包含F3與Β3各0.25uM, FIP與BIP各1.6uM, 20mMTris-HCl, IOmM (NH4)2SO4, IOmM KCl，8mM MgSO4, 0.1% Tween-20,0.8M Betaine, 1.4 mMdNTPs,8U feiDNA聚合酶大片段，25ng DNA模板，不足部分用無菌雙蒸水補足；LAMP反應條件為在64°C溫育60 min，80°C保溫lOmin。
[0013]②在LAMP反應的最終擴增產物中加入1μ I顯色劑，所述顯色劑為50μΜCalcein-500 μ M MnCl2,顯色結果觀察到綠色熒光，或取2 μ I擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果出現LAMP特征性的梯形帶，即可判斷所述的辣椒組織或土壤中存在辣椒疫霉菌；否則所述的辣椒組織或土壤中未存在辣椒疫霉菌。
[0014]本發明適用于發病組織或土壤中辣椒疫霉菌的快速可靠的檢測和鑒定，對于農業生產中辣椒疫霉菌引起的病害防治具有重要的實用價值。本發明與現有技術相比，具有以下的技術優勢和積極效果:
1、結果可靠:本發明所設計出的LAMP檢測引物，對辣椒疫霉菌和帶辣椒疫霉菌的土樣、植物組織進行了測試驗證，因此結果可靠性具有充分的保證；
2、特異性強:本發明所采用的LAMP引物是針對辣椒疫霉菌序列中6個不同區域設計出4條特異性引物，6個區域中任何區域與引物不匹配均不能進行核酸擴增，故特異性聞。
[0015]3、靈敏度高:LAMP對辣椒疫霉菌的檢測靈敏度和巢式PCR的靈敏度相當，在DNA水平上可達到IOf g，比常規PCR檢測高1000倍。[0016]4、實用性好:本發明所設計出的LAMP引物，可用于帶辣椒疫霉菌的組織和土壤的高靈敏度快速檢測，因此本方法的實用性強，可滿足對帶菌組織和土壤中存在的辣椒疫霉菌進行快速可靠的檢測和鑒定的需要。
[0017]5、操作簡便快速:應用本發明方法，對帶辣椒疫霉菌的組織和土壤進行檢測可在I小時內完成，且LAMP核酸擴增是在等溫條件下進行，只需一個水浴鍋即可，不需要復雜的儀器設備和昂貴的分子試劑，結果肉眼直接可見。
[0018]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為本發明辣椒疫病菌的特異LAMP檢測結果圖。圖1中A表示瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，其中:泳道M為DL 2000 DNA marker,泳道5為陰性對照，泳道6為陽性對照，泳道1-3為辣椒疫霉菌，泳道4為其他卵菌和真菌菌株；圖1中B表示顯色結果，其中--第5管為陰性對照，第6管為陽性對照，第1- 3管為辣椒疫霉菌，第4管為其他卵菌和真菌菌株。
[0020]圖2為本發明辣椒疫病菌的LAMP靈敏性檢測結果圖。圖2中A表示瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，其中:泳道M為DL 2000 DNA marker,泳道I為陰性對照，2 - 8模板濃度分別為 IOng, lng, 100 pg, 10 pg, I pg, 100 fg, 10 fg, and I fg ;圖 2 中 B表示顯色結果，其中:第 2 - 8 管模板濃度分別為 IOng, lng, 100 pg, 10 pg, I pg, 100 fg, 10 fg,and I fg。
[0021]圖3為本發明對發病植株和薯塊的檢測結果圖。圖3中A表示瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，其中:泳道I為陰性對照，泳道2為陽性對照，泳道3為健康組織，泳道4為發病土壤，泳道5為發病組織；泳道M為DL 2000 DNA marker ;圖3中B表示顯色結果，其中:第I管為陰性對照，第2管為陽性對照，第3管為健康組織，第4管為發病土壤，第5管為發病組織。
[0022]
【具體實施方式】
[0023]本發明的技術內容包括辣椒疫霉菌的LAMP 檢測引物，LAMP引物序列分別為:
F3:5， - TTGGCTTCGGCTGAACAG -3，；
B3:5’ - GCGGGAAATTCTTGCCTGAA -3’ ；
FIP:5’ - CGCAACAGCAAAGCCGATTCAA-ATGCTTTTCCTGCTGTGGC -3’ ；
BIP:5’ - GGCTGTCGAGGGTCGATCCA-AGGTCCAATTGAGATGCGC -3’。
[0024]利用LAMP引物檢測辣椒疫霉菌顯色結果可觀察到綠色熒光或瓊脂糖凝膠電泳出現LAMP特征性的梯形帶。
[0025]主要試劑:1feiDNA聚合酶大片段購自英國NEB公司；DNA marker購自寶生物工程大連有限公司；其余試劑均購自上海生工生物技術有限公司。引物由上海生工生物技術有限公司合成。
[0026]實施例1:LAMP引物對辣椒疫霉菌的特異性擴增及引物序列的驗證
本發明的關鍵性技術是辣椒疫霉菌的高效特異擴增的引物序列及其擴增方法。為了驗證辣椒疫霉菌的特異引物序列，本發明以辣椒疫霉菌、11種疫霉屬和腐霉屬卵菌及22種不同真菌為供試材料，采用CTAB法提取組織中辣椒疫霉菌的DNA。具體方法如下:取50mg冷凍干燥后的菌絲粉于1.5ml離心管中，加入900 μ I 2% CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)提取液(提取液的配方為:2% CTAB ；100 m mol/L Tris-HCl (三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽)，PH8.0 ；20mmol/L EDTA (乙二胺四乙酸二鈉)，pH8.0 ；1.4 mol/L NaCl)和 90μ1 10% SDS(十二烷基苯磺酸鈉)后混勻，于55~60°C水浴1.5 h,每10 min振蕩混勻一次，水浴
1.5h后離心(12，000rpm)15min,取上清液加入與上清液等體積的酹/氯仿/異戍醇(酹、氯仿和異戊醇的體積比為25:24:1)，離心(12, OOOrpm) 5 min，取上清液(水相)，加入與上清液等體積的氯仿抽提一次(12，OOOrpm)離心5min,吸上清(350 μ I),加0.1體積(35 μ I)的3mol/L NaAC溶液和2體積(700 μ I)的冰無水乙醇，_20°C下沉淀30min后12，OOOrpm離心5 min,輕輕地倒去上清液，加入700 μ I冰70%乙醇進行洗滌(稍離心，傾掉上清)，在超凈工作臺上自然晾干無酒精味后用IXTE (10mmol/L Tris-HCl,0.lmmol/L EDTA, pH8.0)溶液進行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光度計檢測DNA濃度并稀釋至50ng/ μ I待用。
[0027]對供試菌株和36株辣椒疫霉菌的特異性進行LAMP驗證。
[0028]①LAMP 反應體系 25μ 1:包含 F3 與 B3 各 0.25uM，FIP 與 BIP 各 1.6uM，20mMTris-HCl, IOmM (NH4)2SO4, IOmM KCl，8mM MgSO4, 0.1% Tween-20,0.8M Betaine, 1.4 mMdNTPs,8U feiDNA聚合酶大片段，25ng DNA模板，不足部分用無菌雙蒸水補足。LAMP反應條件為在64°C溫育60 min，80°C保溫lOmin。[0029]②在LAMP反應的最終擴增產物中加入1μ I顯色劑，所述顯色劑為50 μ MCalcein-500 μ M MnCl2，顯色結果觀察到綠色熒光判斷為陽性，橙色判斷為陰性。或取2 μ I擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果出現LAMP特征性的梯形帶判斷為陽性，沒有出現擴增條帶判斷為陰性。
[0030]結果:除了辣椒疫霉菌顯色結果可觀察到綠色熒光或瓊脂糖凝膠電泳檢測出現LAMP特征性的梯形帶外，檢測了 11種其他卵菌及22種真菌菌株顯色結果為橙色或瓊脂糖凝膠電泳沒有出現擴增條帶，部分結果見圖1。這說明該引物具有很強的特異性，可被用于生產實踐中發病組織及土壤中辣椒疫霉菌快速可靠的檢測和鑒定。
[0031 ] 實施例2 =LAMP引物對辣椒疫霉菌的靈敏性檢測
1.辣椒疫霉菌的LAMP靈敏性檢測采用10倍濃度系列稀釋法將提取的辣椒疫霉菌DNA稀釋成10ng，lng, 100 pg, 10pg, I pg, 100 fg, 10 fg, and I fg 共 10 個不同濃度梯度。
[0032]①LAMP 反應體系 25μ 1:包含 F3 與 B3 各 0.25uM，FIP 與 BIP 各 1.6uM，20mMTris-HCl, IOmM (NH4)2SO4, IOmM KCl，8mM MgSO4, 0.1% Tween-20,0.8M Betaine, 1.4 mMdNTPs,8U feiDNA聚合酶大片段，25ng DNA模板，不足部分用無菌雙蒸水補足；LAMP反應條件為在64°C溫育60 min，80°C保溫lOmin。
[0033]②在LAMP反應的最終擴增產物中加入1μ I顯色劑，所述顯色劑為50 μ MCalcein-500 μ M MnCl2，顯色結果觀察到綠色熒光判斷為陽性，橙色判斷為陰性。或取2 μ I擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果出現LAMP特征性的梯形帶判斷為陽性，沒有出現擴增條帶判斷為陰性。
[0034]2.檢測結果:辣椒疫霉菌LAMP靈敏性檢測結果見圖2，顯色結果可觀察到綠色熒光或瓊脂糖凝膠電泳出現LAMP特征性的梯形帶,檢測靈敏度可達10fg。
[0035]實施例3:發病組織或土壤中辣椒疫霉菌的檢測
1.樣品采集:植物組織樣品采自福建福州、廣東韶關、和江西南昌辣椒生產基地；土壤樣品采自福建省寧德辣椒生產基地。
[0036]2.DNA提取及檢測
發病植物組織采用NaOH快速裂解法提取辣椒疫霉菌DNA。具體過程如下:(I)將辣椒病葉或病莖洗凈、晾干，剪取發病部位；(2)按Img病葉加入10 μ 1(0.5mol/L Na0H，0.5%PVP)計量，將組織充分磨碎成糊，在12，OOOg離心機中離心5min ； (3)取上清20 μ I與等體積的
0.1 mol/L 的 Tris-HCl (ρΗ8.0)混合；(4)稀釋 10 倍、100 倍、1000 倍液，分別取 I μ I 原液、10倍、100倍、1000倍液作為PCR模板進行擴增。
[0037]發病土壤采用土壤DNA提取法提取辣椒疫霉菌的DNA。具體方法如下:取過篩的土壤冷凍抽干24-48 h后加少量石英砂，倒入液氮充分研磨，將研磨后的土壤細粉分裝至1.5ml離心管中，每管加入500 μ I 0.4%脫脂奶粉溶液，渦旋混勻。12000 rpm離心15 min。取上清加入等體積蛋白酶K緩沖液，加終濃度為10 ug/ml蛋白酶K，55°C水浴1-3 h。水浴結束后，加入1/2體積的7.5 M NH4AC溶液,上下顛倒混勻。12000 rpm離心15 min。吸上清加2倍體積無水乙醇-20°C沉淀(沉淀時間1.5 h)。沉淀結束后，12000 rpm離心15 min。用70%乙醇洗滌沉淀后傾去，室溫晾干。每份樣品所提DNA用10 μ I TE (或無菌超純水)溶解，-20°C保存備用。[0038]按下述方法進行LAMP檢測:
① LAMP 反應體系 25 μ 1:包含 F3 與 B3 各 0.25uM, FIP 與 BIP 各 1.6uM, 20mMTris-HCl, IOmM (NH4)2SO4, IOmM KCl，8mM MgSO4, 0.1% Tween-20,0.8M Betaine, 1.4 mMdNTPs,8U feiDNA聚合酶大片段，25ng DNA模板，不足部分用無菌雙蒸水補足；LAMP反應條件為在64°C溫育60 min，80°C保溫lOmin。
[0039]②在LAMP反應的最終擴增產物中加入1μ I顯色劑，所述顯色劑為50 μ MCalcein-500 μ M MnCl2，顯色結果觀察到綠色熒光判斷為陽性，橙色判斷為陰性。或取2 μ I擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果出現LAMP特征性的梯形帶判斷為陽性，沒有出現擴增條帶判斷為陰性。
[0040]3.檢測結果
如圖3所示，發病組織或土壤中感染辣椒疫霉菌，顯色結果可觀察到綠色熒光或瓊脂糖凝膠電泳出現LAMP特征性的梯形帶，健康組織顯色結果則觀察到橙色熒光或瓊脂糖凝膠電泳未出現LAMP特征性的梯形帶。
【權利要求】
1.一種辣椒疫霉菌的LAMP引物，其特征在于:所述LAMP引物序列如下:F3:5， - TTGGCTTCGGCTGAACAG -3，；B3:5’ - GCGGGAAATTCTTGCCTGAA -3’ ；FIP:5’ - CGCAACAGCAAAGCCGATTCAA-ATGCTTTTCCTGCTGTGGC -3’ ；BIP:5’ - GGCTGTCGAGGGTCGATCCA-AGGTCCAATTGAGATGCGC -3’。
2.一種利用權利要求1所述引物的辣椒疫霉菌LAMP快速檢測方法，其特征在于:LAMP 反應體系 25ul，其中 F3 與 Β3 各 0.25-0.30uM, FIP 與 BIP 各 1.6-1.8uM, 20mMTris-HCl, 10mM (NH4)2SO4, IOmM KCl，8mM MgSO4, 0.1% Tween-20,0.8M Betaine, 1.4 mMdNTPs,8U feiDNA聚合酶大片段，10-50ng DNA模板，不足部分用無菌雙蒸水補足；LAMP反應條件為在 60-65°C溫育 30-90 min，80°C保溫 5-lOmin。
3.根據權利要求2所述的辣椒疫霉菌LAMP快速檢測方法，其特征在于:在LAMP反應的擴增產物中加入I μ I顯色劑，所述顯色劑為50 μ M Calcein-500 μ M MnCl2,顯色結果觀察到綠色熒光判斷為陽性，橙色判斷為陰性；或取2μ I擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如出現梯形條帶判斷為陽性，沒有出現則判斷為陰性。
4.根據權利要求2所述的辣椒疫霉菌LAMP快速檢測方法，其特征在于:所述的LAMP反應體系中，F3與B3優選為0.25uM，FIP與BIP優選為1.6uM，DNA模板優選為25ng ；LAMP反應條件優選為在64°C溫育60 min,80°C保溫lOmin。
【文檔編號】C12R1/645GK103525913SQ201310432567
【公開日】2014年1月22日申請日期:2013年9月22日優先權日:2013年9月22日
【發明者】劉裴清, 陳慶河, 李本金, 董中美, 尹容美, 翁啟勇申請人:福建省農業科學院植物保護研究所

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