一種腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白及其制法和用途

一種腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白及其制法和用途
【專利摘要】本發明屬生物【技術領域】，具體公開了一種腫瘤壞死因子家族細胞凋亡蛋白融合蛋白及其制法和用途。該融合蛋白是由膜聯蛋白、連接肽、腫瘤壞死因子家族細胞凋亡蛋白組成的，通過克隆構建該融合蛋白的編碼基因。該腫瘤壞死因子家族細胞凋亡蛋白融合蛋白具有顯著增強的誘導細胞凋亡的效果，能夠使得誘導對細胞凋亡不敏感的腫瘤細胞凋亡，能夠降低獲得治療效果所需要的蛋白給藥劑量。
【專利說明】—種腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白及其制法和用途

【技術領域】
[0001]本發明屬生物【技術領域】，涉及一種腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白及其制法和用途。

【背景技術】
[0002]癌癥是世界上導致死亡的第二大因素。目前治療癌癥的方法除手術外，主要是化療和放療，但這兩種方法缺乏特異性，具有明顯的細胞毒性。理想的抗腫瘤藥物是能選擇性地殺死腫瘤細胞而不傷害正常細胞。許多化療藥物是通過誘導凋亡來殺死腫瘤細胞的，腫瘤細胞也會通過產生抑制凋亡的機制而導致化療的失敗。因此，凋亡通路成為研制抗腫瘤藥物的最具吸引力的靶點。
[0003]自從Aggarwal等人1984年分離并鑒定出首個腫瘤壞死因子(TNF)至今，這個蛋白家族已有19名成員。腫瘤壞死因子家族成員通過與其受體家族一腫瘤壞死因子受體家族相互作用，發揮重要生理作用。腫瘤壞死因子及其受體家族系統在自身免疫性疾病、細菌和病毒感染、腫瘤、糖尿病、骨質疏松等多種疾病的發生與發展中起關鍵作用。因此，大部分腫瘤壞死因子及其受體家族成員被作為多種疾病的藥物靶點進行廣泛開發。美國食品藥品管理局(FDA)已批準5種TNF阻斷劑藥物上市銷售，主要用于關節炎、牛皮癬、克羅恩病等炎癥和自身免疫疾病治療，其中有三種藥物的銷售額已躋身于美國“重磅炸彈”(年銷售額過10億美元)行列，成為最成功的生物技術類藥物之一。2010年11月FDA批準腫瘤壞死因子家族成員之一 -RANKL的人源化抗體(Xgeva)用于防治腫瘤轉移相關的骨破壞病癥；近期，FDA又批準另外一種腫瘤壞死因子家族成員BAFF的中和抗體(Benlysta)用于系統性紅斑狼瘡(SLE)治療。另外，還有多種腫瘤壞死因子及其受體家族成員相關藥物正處于不同的臨床試驗階段。腫瘤壞死因子及其受體家族成為藥物開發中的明星家族，相信不久的將來會有更大的發展。腫瘤壞死因子及其受體家族成員中，大部分腫瘤壞死因子家族成員均可以表達為II型跨膜蛋白，包括氨基端的胞內區、跨膜區、羧基端的胞外區三部分。腫瘤壞死因子家族成員的胞外區結構比較類似，都是由多條反向平行的β折疊片層組成典型的β蛋卷結構，在與受體結合的幾個區域，氨基酸序列比較保守。大部分跨膜型TNF家族成員胞外區可以被特定的酶水解產生可溶性蛋白；可溶性與膜結合型TNF家族成員與受體結合能力相似，但是可以激活不同的信號途徑，介導不同的生理與病理作用。
[0004]到目前為止，大約有19種腫瘤壞死因子超家族的成員被克隆出來，有部分已經作為藥物使用如TNF a，TNF β，大部分還處于臨床階段，如FasL、TRAIL、TWEAK、RANKL等。其中，大部分腫瘤壞死因子家族成員(例如，FasL、TNF、TRAIL等)都是通過誘導細胞凋亡發揮其生物學及其治療功能。以下僅以腫瘤壞死因子相關凋亡配體為例，說明腫瘤壞死因子家族成員誘導細胞凋亡的作用、應用及其面臨的問題。
[0005]腫瘤壞死因子相關凋亡配體(TRAIL)是腫瘤壞死因子(TNF)超家族的又一成員，自從1995年被發現以來，因為其能誘導一系列的腫瘤細胞凋亡而不影響正常細胞而成為具有重要應用前景的抗腫瘤生物藥物(Walczak.H等，1999，Nat.Med5:157-163)。TRAIL是分子量為30KD的II型跨膜蛋白，能被半胱氨酸蛋白酶加工成分子量為20KD的可溶性蛋白(S.M.Mariani 等，1998，Eur.J.1mmono128:973-982)? TRAIL 的 N 端區域是不保守的，但C端與該家族的其它成員有高度的保守性。TRAIL是該家族唯一含有半胱氨酸Cys230的蛋白，該Cys230使三個TRAIL分子能相互作用。與該Cys結合的鋅離子對維持三聚體結構、可溶性以及正常的生物學功能具有重要的作用(Mongkolsapaya J等，Nat StructB1l6:1048-1053)。本發明中所稱的TRAIL是指可溶性的腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體，通常是指、但不局限于腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體114-281氨基酸序列，其中包括了由腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體衍生物(截短的、加長的、突變的突變體蛋白質)。TNF超家族的成員FasL以及TNFa的表達是嚴格控制的、并且只短暫表達于一些活化的細胞中Hmtrail在多種正常組織包括淋巴細胞，脾，胸腺，前列腺，卵巢以及腸等組織中組成型表達(在腦和肝臟中不表達)(Wiley, S.R.等，1995, Immunity3:673-682)。在體內，系統給藥時，FasL以及TNFa除了能誘導腫瘤細胞凋亡外還能引起炎癥反應以及肝毒性，但TRAIL不會(Ashkenazi, Α.等，1998，Science281:1305-1308)。因此，TRAIL 是一種有前景的抗腫瘤藥物。
[0006]凋亡主要由兩條通路引起，即胞外信號通路和胞內信號通路，但這兩條通路最終激活相同的凋亡效應半胱氨酸蛋白酶(Caspase)和凋亡效應分子。胞內凋亡信號通路是由嚴重的DNA損傷、缺氧以及其它壓力引起的(如化療和放療)。胞內信號通路很大程度上是由Bcl-2蛋白家族的凋亡與抗凋亡成員相互作用來介導和調控的(Wei，M.C.等，2001，Science292:727 - 730)。 胞外凋亡信號通路是由TNF超家族配體結合到相應的受體上引起的。TRAIL主要是通過胞外通路來誘導凋亡的(Scaffidi C.等，1998，EMBO J.17:1675 -1687)。與TNF超家族其它成員不同，TRAIL能與一系列受體結合，與不同受體結合的親和力不同，引起的結果也不同。TRAIL-Rl (DR4)和TRAIL-R2(DR5)是凋亡受體，能將TRAIL誘導的凋亡信號傳到細胞內(LeBlanc, H.N.等，2004, Cell Death DifferlO:66 - 75)0TRAIL-R3(DcRl)和TRAIL-R4 (DcR2)是假受體，可拮抗TRAIL的凋亡信號。TRAIL-R3沒有胞內區域而TRAIL-R4的死亡結構域是剪切了的，因此它們都不能傳導凋亡信號。此外，TRAIL還能與OPG結合，但親和力較低。
[0007]如同其它TNF超家族配體成員一樣，腫瘤壞死因子相關凋亡配體誘導凋亡的第一步是三聚體的TRAIL與TRAIL-Rl和TRAIL-R2的結合。TRAIL與其受體的相互作用促使受體成簇并招募接頭蛋白FADD, FADD通過死亡效應區域進一步招募Casapase8前體,進而形成死亡信號誘導復合物(DISC) (Kischkel FC 等，2000，Immunityl2:611 - 20)。Casapase8前體招募到DISC后，通過構象變化以及自我剪切而激活，激活后的Caspase8進一步剪切和活化效應CaSpaSe3，6，7從而執行細胞凋亡。根據是否需要胞內信號通路來執行凋亡可將細胞分為兩種類型即I型和II型。在I型細胞中，DISC完全活化CaspaseS并通過直接活化 Caspase3, 6，7 而誘導凋亡(Gonzalvez F.等，2010, 0ncogene29:4752 - 4765)。在 II 型細胞中,DISC活化的Caspase8不足以誘導凋亡因而需要胞內信號通路來放大凋亡信號。胞內信號通路是在Caspase8介導的Bid剪切成活性形式tBid后而激活的。tBid迅速移位到線粒體內并激活Bax和Bak，從而引起線粒體膜電位的改變。從而，凋亡因子如細胞色素C和Smac/DIABLO釋放到細胞質中。細胞色素C與接頭蛋白Apaf-1結合并將Caspase_9招募到凋亡復合物中。活化的Caspase-9進一步激活Caspase_3,從而引起完全的凋亡。
[0008]雖然很多報道證實腫瘤壞死因子相關凋亡配體能誘導多種腫瘤細胞凋亡，是一種有前景的抗腫瘤藥物，但是許多原發的腫瘤對TRAIL誘導的凋亡具有抵抗作用(Dyer，M.J.等，2007，J.Clin.0ncol.25:4505-4506)。這種抵抗機制發生在TRAIL誘導的凋亡通路中從受體到效應分子的多個水平。在受體水平，DR4或DR5重要區域如死亡受體區域和與TRAIL結合區域的突變會抑制TRAIL誘導的凋亡(MCDONALD ER3RD等，2001，J B1lChem276:14939 - 14945)。DcRl 與 DR4 和 DR5 競爭結合 TRAIL 而抑制 DISC 的形成，而 DcR2與DR5 一起被招募到DISC中并抑制起始caspase的激活(Merino D.等,2006, Mol CellB1l26:7046 - 7055)。在 TRAIL DISC 水平，cFLIP 與 Caspase8 競爭結合 FADD 從而抑制caspase 的活化(Kataoka T.等，2005, Crit.Rev.1mmunol.25:31 - 58)。XIAP 的高表達可直接抑制 Caspase3, 7, 9 (Deveraux, Q.L 等，1997, Nature388:300 - 304)。Bcl_2 家族的抗凋亡蛋白如Bcl-2，Bcl-X L以及Mcl-1可抑制線粒體膜電勢的改變而抑制凋亡(TaitS.W.等，2010,Nat.Rev.Mol.Cell B1lll:621_632)。此外，其他生存信號通路包括 AKT 和NF-κ B通路的激活也會導致對TRAIL誘導凋亡的抑制(LoPiccolo J等，2008，Drug ResistUpdatll:32 - 50)。腫瘤細胞對TRAIL的抵抗性限制了 TRAIL的使用，因此了解腫瘤細胞對TRAIL抵抗的胞內分子機制有助于基于TRAIL的抗腫瘤方法的發展。
[0009]目前，化療和放療與TRAIL聯合使用是較常用的增加腫瘤細胞對TRAIL敏感性的方法，但放療和化療對正常細胞也有一定的影響。此外，TRAIL不穩定容易變性，并且半衰期短，這些對其應用都有影響。因此，如何利用生物學的方法增加以腫瘤細胞為代表的疾病細胞或病理組織腫瘤細胞對TRAIL的敏感性？這對于TRAIL的應用具有重要的意義。對于以細胞凋亡活性為主要生物學功能的腫瘤壞死因子家族配體成員而言，誘導細胞凋亡是它們的主要生物學功能及藥學價值，在治療過程中被治療的靶細胞對于細胞凋亡的抵抗對于腫瘤壞死因子家族細胞凋亡蛋白的應用具有重要的意義。
[0010]膜聯蛋白(Annexins)是一大類鈣依賴的磷脂結合蛋白超家族,在結構上均具有保守C-端中心結構域，及其N -端結構域。被定義為膜聯蛋白的標準是，能夠在鈣離子存在條件下可逆地結合于細胞表面帶負電的磷脂；并且必須包含具有約70個氨基酸的重復序列，這種重復序列被稱作膜聯蛋白折疊。膜聯蛋白基因超家族具有獨特的、保守的四個同源重復序列，該結構具有鈣和磷脂結合能力。從序列比對和進化上看，膜聯蛋白1、2、3、9、10、3’ 6高度同源和相似，膜聯蛋白4、5 (V)、8、5’ 6高度同源和相似。但是膜聯蛋白I (膜聯蛋白I)的空間結構域膜聯蛋白V (Annexin5)幾乎完全重疊，顯示出膜聯蛋白在結構及功能(與細胞表面帶負電的磷脂結合)上的高度相似性。膜聯蛋白V (Annexin V)是膜聯蛋白(Annexin)家族的成員之一,在鈣離子存在的條件下可與磷脂酰絲氨酸(PS)結合。其表達較廣泛，特別是在骨骼，心臟，平滑肌，內皮細胞，軟骨細胞以及神經元。膜聯蛋白V參與了多種胞內胞外過程，包括凝血，信號轉導，抗炎癥反應，膜運輸以及離子通道活性(Rahman，Μ.Μ.等，1997, Anat.Embryoll9 5:31-39)。此外,最近的研究還發現,膜聯蛋白V可封閉腫瘤細胞自分泌的含有EGFR的微囊泡從而抑制腫瘤血管的新生(Khalid Al-Nedawi等，2009，Proc Natl Acad Scil06:3794 - 3799)。


【發明內容】

[0011]本發明的一個目的是提供一種以腫瘤壞死因子家族細胞凋亡蛋白為基礎的、克服靶細胞或者治療患者對于腫瘤壞死因子家族成員誘導的細胞凋亡抵抗的蛋白，它是膜聯蛋白(Annexin)或具有磷脂結合活性的膜聯蛋白衍生物與腫瘤壞死因子家族細胞凋亡蛋白或具有誘導細胞凋亡活性的腫瘤壞死因子家族細胞凋亡蛋白衍生物構成的融合蛋白。
[0012]本發明的另一個目的是提供一種以腫瘤壞死因子相關凋亡配體(TRAIL)為基礎的、克服以靶細胞(例如，一些腫瘤細胞)或者患者(例如，腫瘤患者)對TRAIL抵抗的蛋白，它是膜聯蛋白V (Annexin V)或具有磷脂結合活性的膜聯蛋白V衍生物與腫瘤壞死因子相關凋亡配體(TRAIL)或具有誘導細胞凋亡活性的腫瘤壞死因子相關凋亡配體衍生物構成的融合蛋白。
[0013]本發明的另一目的是提供編碼所述融合蛋白的DNA、含有該DNA序列的載體和含該載體的宿主細胞。
[0014]本發明的另一目的是提供一種成本低廉，效果顯著地生產所述融合蛋白的方法。
[0015]本發明的再一目的是提供所述的融合蛋白在制備包括抗腫瘤藥物在內的誘導細胞凋亡藥物中的應用。
[0016]在本發明的第一方面，提供了一種腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白，其特征在于它具有膜聯蛋白的氨基酸序列或具有磷脂結合活性的膜聯蛋白衍生物序列、腫瘤壞死因子家族細胞凋亡蛋白的氨基酸序列或具有誘導細胞凋亡活性的腫瘤壞死因子家族細胞凋亡蛋白衍生物序列、以及位于膜聯蛋白氨基酸序列和腫瘤壞死因子家族細胞凋亡蛋白氨基酸序列之間的連接肽序列，是通過基因工程方法構建由膜聯蛋白或具有磷脂結合活性的膜聯蛋白衍生物、連接肽、腫瘤壞死因子家族細胞凋亡蛋白或具有誘導細胞凋亡活性的腫瘤壞死因子家族細胞凋亡蛋白衍生物三個部分組成的腫瘤壞死因子相關凋亡配體變體融合蛋白質，即利用常規基因工程方法通過人工合成或者克隆構建融合蛋白的編碼基因、可溶性地重組表達和簡便地分離純化。
[0017]所述的膜聯蛋白是指具有磷脂結合活性的膜聯蛋白家族成員或具有磷脂結合活性的膜聯蛋白衍生物，所述的腫瘤壞死因子家族細胞凋亡蛋白是指腫瘤壞死因子家族中具有誘導細胞凋亡活性的成員蛋白質或具有誘導細胞凋亡活性的腫瘤壞死因子家族細胞凋亡蛋白衍生物。所述的連接肽序列是一段具有柔性結構的、不含支鏈氨基酸的短肽，其中，短肽長度為、但不局限于，1-30個氨基酸殘基，主要由甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸等不含支鏈的氨基酸組成。所述的衍生物是指具有磷脂結合活性的，截短的、加長的、突變的膜聯蛋白突變體，或具有誘導細胞凋亡活性的，截短的、加長的、突變的腫瘤壞死因子家族細胞凋亡蛋白突變體。
[0018]上述由膜聯蛋白或具有磷脂結合活性的膜聯蛋白衍生物與腫瘤壞死因子家族細胞凋亡蛋白或具有誘導細胞凋亡活性的腫瘤壞死因子家族細胞凋亡蛋白衍生物所構成的腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白可以是將膜聯蛋白或具有磷脂結合活性的膜聯蛋白衍生物置于腫瘤壞死因子家族細胞凋亡蛋白或具有誘導細胞凋亡活性的腫瘤壞死因子家族細胞凋亡蛋白衍生物的N端，中間添加一段含有但不局限于1-30個氨基酸殘基組成的連接肽；也可以將膜聯蛋白或具有磷脂結合活性的膜聯蛋白衍生物置于腫瘤壞死因子家族細胞凋亡蛋白或具有誘導細胞凋亡活性的腫瘤壞死因子家族細胞凋亡蛋白衍生物的C端，中間添加一段含有但不局限于1-30個氨基酸殘基組成的連接肽。
[0019] 優選的所述融合蛋白包括如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列。
[0020]在本發明的第二方面，還提供了一種腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白，其特征在于它具有膜聯蛋白V的氨基酸序列或具有磷脂結合活性的膜聯蛋白V衍生物的氨基酸序列、腫瘤壞死因子相關凋亡配體的氨基酸序列或具有誘導細胞凋亡活性的腫瘤壞死因子相關凋亡配體衍生物的氨基酸序列、以及位于膜聯蛋白V的氨基酸序列或具有磷脂結合活性的膜聯蛋白V衍生物的氨基酸序列和腫瘤壞死因子相關凋亡配體氨基酸序列或具有誘導細胞凋亡活性的腫瘤壞死因子相關凋亡配體衍生物的氨基酸序列之間的連接肽序列，是通過基因工程方法構建由膜聯蛋白V或具有磷脂結合活性的膜聯蛋白V衍生物、連接肽、腫瘤壞死因子相關凋亡配體或具有誘導細胞凋亡活性的腫瘤壞死因子相關凋亡配體衍生物三個部分組成的腫瘤壞死因子相關凋亡配體變體融合蛋白質，即利用常規基因工程方法通過人工合成或者克隆構建融合蛋白的編碼基因、可溶性地重組表達和簡便地分離純化。
[0021]所述的連接肽序列是一段具有柔性結構的、不含支鏈氨基酸的短肽，其中，短肽長度為、但不局限于，1-30個氨基酸殘基，主要由甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸等不含支鏈的氨基酸組成。
[0022]優選的所述融合蛋白包括如SEQ ID NO:1_5中所示的氨基酸序列。
[0023]上述由膜聯蛋白V與腫瘤壞死因子相關凋亡配體所構成的腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白可以是將膜聯蛋白V或具有磷脂結合活性的膜聯蛋白V衍生物置于腫瘤壞死因子相關凋亡配體或具有誘導細胞凋亡活性的腫瘤壞死因子相關凋亡配體衍生物的N端，中間添加一段含有但不局限于1-30個氨基酸殘基組成的連接肽；也可以將膜聯蛋白V或具有磷脂結合活性的膜聯蛋白V衍生物置于腫瘤壞死因子相關凋亡配體或具有誘導細胞凋亡活性的腫瘤壞死因子相關凋亡配體衍生物的C端，中間添加一段含有但不局限于1-30個氨基酸殘基組成的連接肽。
[0024]在本發明的第三方面，提供了一種分離的DNA分子，它編碼本發明上述的融合蛋白，較佳的，所述的DNA分子編碼包括SEQ ID NO:1_6中所示的氨基酸序列的融合蛋白。更加的，所述的DNA分子包括SEQ ID NO:7~12中所示的核苷酸序列。
[0025]在本發明的第四方面，提供含有上述DNA分子的載體；還提供了含有上述載體的宿主細胞。所述宿主細胞可以選用基因工程中常用的工程菌，優選的為大腸埃希菌BL21。
[0026]在本發明的第五方面，提供了一種產生本發明融合蛋白的方法，它包括如下步驟:
[0027]在適合表達所述融合蛋白的條件下，培養權利要求7所述的宿主細胞，從而表達出所述的融合蛋白；和分離所述的融合蛋白。
[0028]具體的，本發明提供了一種在大腸桿菌中可溶性表達、能夠方便地進行大規模分離純化的、高純度的腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白的方法。目前腫瘤壞死因子相關凋亡配體在大腸桿菌中表達多為無生物活性的包涵體產物，而本發明中的腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白的分子結構和分子量比野生型腫瘤壞死因子相關凋亡配體更為復雜，因此在大腸桿菌中表達時，其包涵體形成將更為嚴重、純化將更為復雜。本發明采用了低溫下培養和誘導表達腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白的表達方法，使得表達產物有效避免了包涵體的形成；本發明同時利用了腫瘤壞死因子相關凋亡配體具有鏊合金屬離子的生物功能，利用離子交換層析和金屬親和層析相結合使得腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白得到了有效的純化、獲得了高純度的蛋白質產物，而且純化產物具有高比例的聚體形式，因此具有非常好的生物活性。其中低溫指10°C-35°C。當然，利用高等生物的細胞(酵母、真菌、昆蟲細胞、哺乳動物細胞等)能夠比大腸桿菌更好地產生可溶性的融合蛋白質產物。
[0029]膜聯蛋白V與腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合后，能夠顯著提高腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白多聚體的比例，由于腫瘤壞死因子相關凋亡配體的活性依賴于多聚體(尤其是三聚體)的形成，因此腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白誘導細胞凋亡的活性得以顯著提高。
[0030]同時公開編碼腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白的cDNA，它可以通過腫瘤壞死因子相關凋亡配體的cDNA與膜聯蛋白V cDNA序列、以及連接肽的DNA序列制備。上述組成的腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白的cDNA可用于基因治療。
[0031]本發明的腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白可以通過采用聚乙二醇、脂肪酸化、重組加上抗體Fe片段或白蛋白等方法修飾，從而延長腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白的半衰期，達到更好的藥代動力學效果。
[0032]在本發明的第六方面，提供了如上所述的融合蛋白在制備腫瘤治療藥物中的應用。所述應用包括所述融合蛋白單獨用于制備腫瘤治療藥物，或與現有的腫瘤治療藥物組成組合物，或與現有化療、放療、中藥治療、生物治療等方法在腫瘤治療中聯合運用。
[0033]在本發明的第七方面，提供了一種藥物組合物，包括藥學上可接受的載體或賦形劑或稀釋劑，以及有效量的權利要求1所述的融合蛋白。
[0034]在本發明的第八方面，由于腫瘤壞死因子及其受體家族在進化、蛋白質結構及其作用方式、生物學功能等方面的高度同源和相似，因此，本發明公開的技術方案不僅僅局限于腫瘤壞死因子相關凋亡配體或具有誘導細胞凋亡活性的腫瘤壞死因子相關凋亡配體衍生物，也適用于腫瘤壞死因子家族其它成員或具有誘導細胞凋亡活性的腫瘤壞死因子家族細胞凋亡蛋白衍生物。
[0035]在本發明的第九方面，由于膜聯蛋白家族在進化、蛋白質結構及其作用方式、生物學功能等方面的高度同源和相似，因此，本發明公開的技術方案不僅僅局限于膜聯蛋白V或具有磷脂結合活性的膜聯蛋白V衍生物，也適用于膜聯蛋白家族其它成員或具有磷脂結合活性的膜聯蛋白衍生物。
[0036] 同已有的腫瘤壞死因子相關凋亡配體及其變體相比，本發明具有如下的有益效果:
[0037](I)更好的形成聚體的能力:與野生型腫瘤壞死因子相關凋亡配體單獨或者與膜聯蛋白V混合存在時相比較，腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白具有更高的多聚體存在形式，例如，腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8的三聚體形式比野生型腫瘤壞死因子相關凋亡配體高11倍。由于腫瘤壞死因子相關凋亡配體誘導凋亡的第一步是三聚體的TRAIL與其受體結合，因此，三聚體形式則必然使得腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白具有更高的誘導細胞凋亡的生物活性。
[0038](2)更為高效的誘導腫瘤細胞凋亡的效果:腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白呈現出比腫瘤壞死因子相關凋亡配體更高的誘導腫瘤細胞凋亡的效果。腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白能顯著誘導TRAIL敏感的、中度敏感的甚至TRAIL不敏感的腫瘤細胞凋亡，而且對于Colo-205和MDA-MB-231腫瘤細胞，進行測定EC50實驗時，腫瘤壞死因子相關凋亡配體僅僅需要作用細胞4小時，而不是像常規測定其他腫瘤細胞時需要作用24小時，由此可見腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白具有強烈增強的誘導腫瘤細胞凋亡的能力。
[0039]除誘導腫瘤細胞凋亡之外，腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白還具有長期的作用效應，它能顯著抑制腫瘤細胞的克隆形成，因此具有抑制腫瘤生長的能力。
[0040](3)可靠的選擇性作用:雖然腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白誘導腫瘤細胞凋亡的能力顯著增強，但腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白對腫瘤細胞的特異性并沒有改變，正常細胞系(如L02和293T)并不響應腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白誘導的細胞凋亡，即是說與TRAIL相比較，腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白不會帶來額外的毒副作用。腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白誘導腫瘤細胞凋亡的方式與TRAIL完全相同，均依賴于Caspase-8。TRAIL,膜聯蛋白V與腫瘤壞死因子相關凋亡配體混合物(AnnexinV+TRAIL)以及腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白與腫瘤細胞A549細胞表面的受體DR4/DR5的結合能力沒有差異。下游的信號分子(如DR4，DR5，DcR2以及與線粒體通路相關的蛋白如Bcl-XL,Bax,Bim,Noxa,Puma)的表達在經不同藥物處理后也無差異。但是Caspase-8,Caspase-3, PARP只有在經腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白處理后才被明顯激活。而且,Caspase-8抑制劑Z-1ETD-FMK可明顯減少腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白誘導的細胞凋亡，而Caspase-9抑制劑Z-LEHK-FMK對腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白誘導的凋亡無明顯影響。這充分說明，腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白與TRAIL具有完全一樣的作用機制，其安全性與TRAIL相同。
[0041](4)更為高效的抗腫瘤效果:由于本專利發明的腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白具有顯著增加的誘導TRAIL敏感的、中度敏感的甚至TRAIL不敏感的腫瘤細胞的細胞凋亡的能力，與野生型TRAIL、靶向于腫瘤細胞表面的整合素ανβ3、ανβ5的TRAIL變體RGD-L-TRAIL (中國發明專利申請號:200710133862.1)、靶向于腫瘤細胞表面的CD13的TRAIL變體NGR-L-TRAIL (中國發明專利申請號:200710133862.1)相比，無論在單獨使用、還是與現有的化療、放療、中藥治療、生物治療等方法聯合使用時都表現出具有更好的抗腫瘤效果。
[0042](5)更低的使用劑量:由于腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白比相同劑量的腫瘤壞死因子相關凋亡配體具有更好的抗腫瘤效果，因此在使用時，能夠在保證相同抗腫瘤療效的情況下，大大降低腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白的用量。腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白給藥劑量的降低將能夠克服腫瘤壞死因子相關凋亡配體在腫瘤治療中潛在的副作用，同時可以降低腫瘤患者的治療費用，達到高效、低毒副作用、低成本腫瘤治療的效果。
[0043](6)可溶性的表達和簡易的分離純化:盡管目前腫瘤壞死因子相關凋亡配體在大腸桿菌中表達時易形成無生物活性的包涵體產物，而本專利發明的腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白的分子結構和分子量比野生型腫瘤壞死因子相關凋亡配體更為復雜，因此依照常規條件在大腸桿菌中表達融合蛋白時，其包涵體形成將更為嚴重、純化難度更大。本發明采用了低溫下培養和誘導表達腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白的表達方法，使得表達產物有效避免了包涵體的形成；本發明同時利用了腫瘤壞死因子相關凋亡配體具有鏊合金屬離子的生物功能，將金屬親和層析和離子交換層析方法相結合使得腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白得到了有效的純化、獲得了高純度的蛋白質產物。本發明通過可溶性表達和簡易分離純化方法的優化最終導致純化產物具有高比例的聚體形式，從而保證了獲得的產物具有非常好的生物活性。生產高比例聚體形式的腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白，這是本發明與同類研究的顯著區別。本發明提供了一種有效表達和高效獲得高的聚體含量的腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白的表達方法和純化工藝。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0044]為了使本發明的內容更容易被清楚地理解，下面根據具體實施例并結合附圖，對本發明作進一步詳細的說明，其中
[0045]圖1.SDS-PAGE分析腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8純化結果及聚體形成情況。
[0046]圖1.1.Zn2+離子金屬親和層析與DEAE離子交換層析純化獲得的腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8:1.蛋白質分子量標準，2.純化后的腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8 ；
[0047]圖1.2.非還原 SDS-PAGE 分析 TRAIL 以及 Annexin V+TRAIL 中 TRAIL 單體、二聚體以及三聚體形成情況:1.蛋白質分子量標準，2.Annexin V, 3.TRAIL, 4.Annexin V+TRAIL ；21.TRAIL 三聚體，22.TRAIL 二聚體，23.TRAIL 單體；
[0048]圖1.3.非還原SDA-PAGE分析腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8單體、二聚體以及三聚體形成情況:31.TP8三聚體，32.TP8 二聚體，33.TP8單體。
[0049]圖2.不同細胞系對腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8敏感性分析。
[0050]圖2.1.不同濃度的腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8對正常的人源細胞293T的影響分析；
[0051]圖2.2.不同濃度的腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8對正常的人源細胞L02的影響分析。
[0052]圖3.等摩爾數的不同藥物處理A549相同時間后A549細胞形態、細胞凋亡分析以及克隆形成分析。
[0053]等摩爾數的Annexin V,TRAIL,Annexin V+TRAIL以及腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8處理A549相同時間后，以PBS作為陰性對照:
[0054]圖3.1.在顯微鏡下觀察細胞形態的變化:1.PBS ；2.Annexin V ；3.TRAIL ；
4.Annexin V+TRAIL ；5.TP8 ；
[0055]圖3.2.透射電鏡觀察經不同蛋白處理后細胞形態變化:1.PBS ;2.Annexin V ；
3.TRAIL ；4.Annexin V+TRAIL ；5.TP8 ；
[0056]圖3.3.流式細胞儀分析不同藥物處理后A549凋亡情況:1.PBS ；2.Annexin V ；
3.TRAIL ；4.Annexin V+TRAIL ；5.TP8 ；
[0057]圖3.4.不同藥物處理對A549克隆形成的影響:1.PBS ;2.Annexin V ；3.TRAIL ；
4.AnnexinV+TRAIL ；5.TP8。
[0058]圖4.腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8誘導人非小細胞肺癌細胞A549細胞凋亡的劑量及作用時間的關系分析。
[0059]圖4.1.流式細胞分析術分析A549凋亡與TP8劑量的關系:1.PBS;2.10ng/mlTP8 ;3.50ng/ml TP8 ;4.lOOng/ml TP8 ;5.200ng/ml TP8 ;6.400ng/ml TP8 ;7.600ng/mlTP8 ；8.800ng/ml TP8 ；
[0060]圖4.2.TP8處理時間與A549細胞凋亡的關系。
[0061]圖5.腫瘤壞死因子相關凋亡配體TRAIL、腫瘤壞死因子相關凋亡配體變體RGD-TRAIL、腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8以及TP8變體誘導人非小細胞肺癌細胞A549凋亡的效果比較。
[0062]圖5.1.腫瘤壞死因子相關凋亡配體TRAIL、腫瘤壞死因子相關凋亡配體變體RGD-TRAIL、腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8誘導人非小細胞肺癌細胞A549凋亡的效果比較。
[0063]圖5.2.腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8與腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8變體TP8-C230G誘導人非小細胞肺癌細胞A549凋亡的效果比較:1.未給藥對照組；2-6.100、200、400、600、800ng/ml腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8 (黑色柱狀)及腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8變體TP8-C230G (白色柱狀)。
[0064]圖6.TP8誘導A549凋亡機制分析
[0065]圖6.l.Western blotting分析凋亡通路中重要蛋白的變化情況:1.PBS組；2.Annexin V 組；3.TRAIL 組；4.Annexin V+TRAIL 組；5.TP8 組；
[0066]圖6.2.RT-PCR分析細胞凋亡信號通路中重要蛋白質的變化情況:1.PBS組；
2.Annexin V 組；3.TRAIL 組；4.Annexin V+TRAIL 組；5.TP8 組；
[0067]圖 6.3.流式細胞儀分析 Annexin V,TRAIL,Annexin V+TRAIL 以及 TP8 與 A549 細胞結合情況。蛋白經熒光染料標記后與A549 —起孵育，再經流式檢測；
[0068]圖6.4.流式細胞儀分析不同藥物處理后A549細胞表面的TRAIL受體DR4和DR5表達情況:1.DR5 ;2.DR4。
[0069]圖1.Caspase8 和 Caspase3 活性分析:
[0070]圖 7.1.Caspase8 活性分析:1.PBS 組；2.Annexin V 組；3.TRAIL 組；4.AnnexinV+TRAIL組；5.TP8組;**ρ〈0.01，ΤΡ8組與其它組比較；
[0071]圖 7.2.Caspase3 活性分析:1.PBS 組；2.Annexin V 組；3.TRAIL 組；4.AnnexinV+TRAIL組；5.TP8組;**ρ〈0.01，ΤΡ8組與其它組比較；
[0072]圖7.3.Caspase8和Caspase3抑制劑對TP8誘導的人非小細胞肺癌細胞A549細胞凋亡的影響分析；**p〈0.01，TP8與Caspase-8抑制劑同時處理組與TP8處理組比較。
[0073]圖8.腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8對不同腫瘤的抑瘤效果分析。
[0074]圖8.1.不同蛋白對A549腫瘤抑制作用比較:1.PBS ;2.Annexin V ；3.TRAIL ；
4.AnnexinV+TRAIL ;5.ΤΡ86.25mg/kg ;6.TP812.5mg/kg ;7.TP825mg/kg ;**P < 0.01 ；
[0075]圖8.2.不同蛋白對A549腫瘤倍增時間(即腫瘤體積增加一倍所需天數)和腫瘤生長延遲時間(即腫瘤體積長到100mm3時相對于PBS組所需天數)的比較:
[0076]圖 8.2.1.腫瘤倍增時間:1.PBS ;2.Annexin V ；3.TRAIL ；4.Annexin V+TRAIL ；
5.TP86.25mg/kg ；6.TP812.5mg/kg ；7.TP825mg/kg ;**P < 0.01，TP812.5mg/kg 組與 PBS 組比較；++<0.01，TP825mg/kg 組與 TP86.25mg/kg 組比較；
[0077]圖8.2.2.腫瘤生長延遲時間:1.PBS ;2.Annexin V ；3.TRAIL ；4.AnnexinV+TRAIL ；5.TP86.25mg/kg ；6.TP812.5mg/kg ；7.TP825mg/kg ;**P < 0.01,TP812.5mg/kg 組與 PBS 組比較；++<0.01，TP825mg/kg 組與 TP86.25mg/kg 組比較；
[0078]圖8.3.不同蛋白對 Bel7402 腫瘤抑制作用比較:1.PBS ;2.Annexin V ；3.TRAIL ；4.AnnexinV+TRAIL ;5.TP86.25mg/kg ;6.TP812.5mg/kg ;7.TP825mg/kg ;**P < 0.01 ；
[0079]圖8.4.不同蛋白對Bel7402腫瘤倍增時間和腫瘤生長延遲時間的比較:
[0080]圖 8.4.1.腫瘤倍增時間:1.PBS ;2.Annexin V ；3.TRAIL ；4.Annexin V+TRAIL ；
5.TP86.25mg/kg ；6.TP812.5mg/kg ；7.TP825mg/kg ;**P < 0.01，TP812.5mg/kg 組與 PBS 組比較；++<0.01，TP825mg/kg 組與 TP86.25mg/kg 組比較；
[0081]圖8.4.2.腫瘤生長延遲時間:1.PBS ;2.Annexin V ；3.TRAIL ；4.AnnexinV+TRAIL ；5.ΤΡ86.25mg/kg ；6.ΤΡ812.5mg/kg ；7.TP825mg/kg ;**Ρ < 0.01,ΤΡ812.5mg/kg 組與 PBS 組比較；++<0.01，TP825mg/kg 組與 TP86.25mg/kg 組比較；
[0082]圖8.5.不同蛋白對Colo205腫瘤抑制作用t匕較:1.PBS ；2.Annexin V ；
3.TRAIL ；4.Annexin V+TRAIL；5.TP86.25mg/kg ；6.TP812.5mg/kg ；7.TP825mg/kg ；*p〈0.05;**p〈0.01 ；
[0083]圖8.6.不同蛋白對Colo-205腫瘤倍增時間和腫瘤生長延遲時間的比較:
[0084]圖 8.6.1.腫瘤倍增時間:1.PBS ;2.Annexin V ；3.TRAIL ；4.Annexin V+TRAIL ；
5.TP86.25mg/kg ；6.TP812.5mg/kg ；7.TP825mg/kg ;**P < 0.01，TP812.5mg/kg 組與 PBS 組比較；++<0.01，TP825mg/kg 組與 TP86.25mg/kg 組比較；
[0085]圖8.6.2.腫瘤生長延遲時間:1.PBS ;2.Annexin V ；3.TRAIL ；4.AnnexinV+TRAIL ；5.ΤΡ86.25mg/kg ；6.ΤΡ812.5mg/kg ；7.TP825mg/kg ;**Ρ < 0.01,ΤΡ812.5mg/kg 組與 PBS 組比較；++〈0.01，TP825mg/kg 組與 TP86.25mg/kg 組比較。
[0086]圖9.腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8治療A549腫瘤的病理分析。
[0087]TUNEL法分析不同蛋白誘導的腫瘤凋亡情況:1.PBS ；2.Annexin V ；3.TRAIL ；
4.AnnexinV+TRAIL ；5.TP8。
[0088]圖10.腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8與聯合抑制人非小細胞肺癌細胞A549腫瘤效果評價。
[0089]1.PBS ；2.順鉬；3.TP8 ；4.TP8+ 順鉬;**ρ〈0.01。

【具體實施方式】
[0090]實施例1
[0091]腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白的設計、表達、制備與鑒定
[0092]利用計算機輔助結構模擬和分子設計，在SGI計算機工作站上，利用MSI公司的分子設計軟件(InsightI1、Discover等模塊),在腫瘤壞死因子相關凋亡配體和膜聯蛋白V晶體結構的基礎上，對腫瘤壞死因子相關凋亡配體和膜聯蛋白V融合蛋白，進行分子模建和分子設計，確定連接肽的氨基酸長度。
[0093]在腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白的計算機輔助分子設計中，發明人利用對腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白進行了結構模擬和分子設計，在腫瘤壞死因子相關凋亡配體和膜聯蛋白V晶體結構的基礎上，對腫瘤壞死因子相關凋亡配體與膜聯蛋白V之間的連接肽氨基酸序列和長度進行分子模建和分子設計，確定連接肽的氨基酸長度。結果發現:由于腫瘤壞死因子相關凋亡配體和膜聯蛋白V的N端及C端都暴露在分子的外表面，因此無論將2個分子的哪一個分子放在N端都能夠保持各自的空間結構，不影響2個分子與各自靶點或者受體的結合。在計算機分子設計時，發明人發現:在添加1-30個氨基酸短肽長度內，只要短肽由不含支鏈的、柔性較大的氨基酸殘基、例如:甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸等組成，都不會對腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白中的腫瘤壞死因子相關凋亡配體和膜聯蛋白V結構產生影響，也不會影響2者的功能；而且在分子動力學所計算的不含支鏈、柔性較大的30個氨基酸短肽長度范圍內，短肽長度越長，對腫瘤壞死因子相關凋亡配體和膜聯蛋白V的結構產生的擾動越小；因此，30個氨基酸以上的連接肽也不會影響腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白的功能。此外，即使在2個分子之間不添加連接肽將兩個蛋白質進行融合，兩個蛋白質也可以較好地保持各自的空間結構，2個分子與各自靶點或者受體的結合也可以基本不受影響，但是融合蛋白的活性還是會受到一定程度的影響。
[0094]在分子設計的基礎上，我們嘗試表達了連接肽為甘氨酸(SEQ ID N0:2)、丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-絲氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(SEQ ID N0:3)的短肽的腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白，含有以上三個重復的甘氨酸-(丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-絲氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸)_(丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-絲氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸)-(丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-絲氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸)的25個氨基酸殘基的腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白(SEQ ID NO:4)，以及含有甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸的短肽的腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白(SEQ ID NO:1 )，而且在每種連接肽情況下，都嘗試將腫瘤壞死因子相關凋亡配體和膜聯蛋白V分別置于N端(例如腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白PT8，SEQ ID NO:5)，都獲得了相似的結果和活性，從而證明了計算機分子設計的正確性。當然不同融合蛋白質的表達量會有一些差別，相形之下，添加了 14個氨基酸連接肽的腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白(Annexin V-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸_甘氨酸_絲氨酸_甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-TRAIL，代號TP8，即第8種融合蛋白)(SEQ ID NO:1)的表達水平最高，并且其表達產物可溶性表達水平最好，因此便于大規模制備和分離純化，其它融合蛋白質不是表達水平略低、就是表達產物的可溶性較差，不利于大規模分離純化用于動物實驗。因此，本專利著重呈現第8種融合蛋白(即TP 8)的實驗數據。
[0095]本專利還構建了由腫瘤壞死因子家族另一細胞凋亡蛋白腫瘤壞死因子(TNF)構成的腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白(Annexin V-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸_甘氨酸-絲氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-TNF) (SEQ ID NO:6)，也獲得了與TRAIL融合蛋白相似的結果。
[0096]腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8表達載體的構建:從NCBI數據庫中獲取人源的Annexin V和人源TRAIL可溶部分的mRNA序列，設計相應的PCR引物，并化學合成相應的引物，其中，Annexin V 上游引物:5’ -GTTCCATGGGCGCACAGGTTCT CAGAGGCA-3’，下游引物:5，-ACCACCACCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCGTCATCTTCTCCACAGAGCA-3，；TRAIL上游引物為:5’-GGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGT GTG AGAGAA-3’，下游引物為:5’ -TCCGCTCGAGTTAGCCAACTAAAAA GGCCC CG-3’。
[0097]以Annexin V表達質粒和TRAIL表達質粒為模板，用PCR的方法分別擴增得到AnnexinV和TRAIL序列。PCR反應的條件為:Annexin V基因:94°C熱變性I分鐘，60°C退火I分鐘，72C延伸1.5分鐘，共進行25個循環。TRAIL基因:94°C熱變性I分鐘，60°C退火I分鐘，72°C延伸I分鐘，共進行25個循環。以PCR擴增的AnnexinV和TRAIL為模板，以Annexin V上游引物和TRAIL下游引物為上下游引物，再次PCR擴增，得到TP8序列。PCR反應條件為:94°C熱變性I分鐘，65 °C退火I分鐘，72 °C延伸2分鐘，共進行26個循環。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳回收后進行Nco I/XhoI雙酶切，表達載體pET28a也經Nco I/XhoI雙酶切，使用T4DNA連接酶將兩條雙酶切回收片段進行連接，連接產物轉化大腸桿菌TOPlO菌株感受態細胞，用限制性內切酶酶切及PCR法篩選陽性克隆，得到質粒pET28a-TP8，經過DNA序列測序分析驗證序列的正確性。
[0098]腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8的表達純化:表達質粒pET28a_TP8轉化到埃希氏大腸桿菌BL21(DE3)宿主菌中，并在宿主菌中進行誘導表達。將平板中的新鮮轉化的菌接種到LB (卡那霉素)培養基中，在搖床上37°C培養過夜，然后轉入到新鮮的LB(卡那霉素)培養基中37°C培養2.5小時左右，0D600nm為0.6~0.8左右時將培養溫度降至28°C繼續培養0.5小時后，加入終濃度為ImM的IPTG誘導TP8表達4小時。誘導表達的菌體經50mM Tris, pH8.0重懸后,加入終濃度為lmg/ml的溶菌酶，20mM Cac12,65%的鹿糖，室溫下攪拌I小時。用50mM Tris, pH8.0, 20mM Cac12將菌液稀釋20倍并于室溫下攪拌I小時，離心去上清，沉淀用50mM Tris,pH8.0, 20mM EDTA解離后，超聲使核酸斷裂。離心回收可溶性蛋白，并用硫酸銨沉淀收集由10%-50%的硫酸銨沉淀下來的蛋白，經磷酸鹽緩沖液(50mM磷酸氫二鈉，1mM磷酸二氫鈉，300mM氯化鈉，pH7.6)溶解后用Zn-NTA親和柱進行純化。平衡緩沖液為50mM磷酸氫二鈉，1mM磷酸二氫鈉，300mM氯化鈉，pH7.6，洗脫緩沖液為50mM磷酸氫二鈉，1mM磷酸二氫鈉，300mM氯化鈉，60mM咪唑，pH7.6，收集洗脫峰。收集到的蛋白溶液對50mM Tris, pH8.0透析除去鹽離子后,用DEAE-Sepharose陰離子交換樹脂進一步純化。平衡緩沖液為50mM Tris, pH8.0, 1mM氯化鈉，洗滌緩沖液為50mMTris，pH8.0，70mM氯化鈉，洗脫緩沖液為50mM Tris,pH8.0, 220mM氯化鈉，收集洗脫峰。蛋白溶液對PBS透析，除去Tris，過濾除菌，分裝，保存于_80°C。
[0099]純化好的TP8蛋白分布用12%的還原性SDS-PAGE和8%的還原性SDS-PAGE電泳，并用考馬斯亮藍染色檢測。還原性SDS-PAGE用于分析蛋白的純度，非還原性SDS-PAGE用于分析二聚體以及三聚體形成情況。
[0100]在以往的報道中，野生型腫瘤壞死因子相關凋亡配體在大腸桿菌中表達時，常常會以無生物活性的包涵體產物形式存在；本專利發明的腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白在TRAIL的基礎上又增加了 318個氨基酸，該融合蛋白在大腸桿菌中表達時應當比野生型腫瘤壞死因子相關凋亡配體更加容易形成無生物活性的包涵體產物、純化將更為困難。本發明通過優化表達條件和分離純化過程、成功地實現了腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白以可溶性形式表達，而且經過硫酸銨沉淀、鎳金屬親和層析和離子樹脂層析，純化獲得了具有生物活性的、高純度的腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白，純度高達98%以上(圖1.1)。而且在本專利的表達條件和純化工藝下，腫瘤壞死因子相關凋亡配體TRAIL及TP8具有很高的聚體比例(圖1.3)，這一點在腫瘤壞死因子相關凋亡配體表達和純化的同類工作中是難得一見的。腫瘤壞死因子超家族蛋白都有形成單體、二聚體和三聚體的特性，并且它們的生物學活性依賴于二聚體和三聚體形式，腫瘤壞死因子相關凋亡配體也不例外。為了檢測與Annexin V融合后是否對腫瘤靶向性腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白形成聚體的能力產生影響，非變性非還原聚丙烯酰胺凝膠電泳分析顯示:野生型腫瘤壞死因子相關凋亡配體單獨或者與膜聯蛋白V混合存在時，有70.14%為單體形式，27.25%為二聚體形式，2.62%為三聚體形式。而腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8的單體形式僅在31.69%，38.70%為二聚體形式，三聚體形式則高達29.61%，三聚體形式比野生型腫瘤壞死因子相關凋亡配體高11倍。Annexin V增強了融合蛋白TP8的二聚體和三聚體形成能力，這與TP8較TRAIL有更強的誘導凋亡的能力相關。重組腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白具有形成聚體的能力。以上結果證明:本專利表達、純化的腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白確實具有正確的空間結構、比以往報道的大腸桿菌表達的TRAIL具有更好的生物活性。
[0101]實施例2
[0102]人源的不同腫瘤細胞系對腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8的敏感性檢測
[0103]將不同的人源腫瘤細胞株:結腸癌Colo-205、乳腺癌MDA-MB-231、宮頸癌Hela、小細胞肺癌H446、肝癌PLC、非小細胞肺癌H1229、肝癌Bel7402、非小細胞肺癌A549、乳腺癌MCF-7、淋巴瘤U937、肝癌H印G2、結腸癌HT29、乳腺癌高轉移細胞MDA-MB-435、舌鱗癌TCA8113、結腸癌HCT116、胰腺癌SW1990、K562細胞，慢性髓原白血病K562等在含10%新生牛血清的DMEM(含100U/ml青霉素和100 μ g/ml鏈霉素)中，并放置37°C，5% C02的培養箱中生長。K562和Colo205在含10%新生牛血清的RPMI1640(含100U/ml青霉素和100 μ g/ml鏈霉素)中，并放置37°C，5% C02的培養箱中生長。所有細胞均購自ATCC。取處于對數生長期的細胞，胰酶消化后，接種于12孔板中，加入1.5ml培養液，將培養板移入培養箱中進行培養。待細胞密度長到70%時加藥，濃度為10ng/ml，30ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，200ng/ml, 400ng/ml, 600ng/ml, 800ng/ml,每個濃度三個孔重復，藥物處理18小時后，經胰酶消化后從孔中吸出，PBS洗兩遍，4°C 800rpm離心5分鐘，去上清，用200 μ I結合緩沖液重懸細胞，加入終濃度為2 μ g/ml的EGFP-Annexin V室溫孵育20分鐘后，加入300 μ I結合緩沖液并轉入流式管中，每管加入I μ g碘化吡啶(PI)，在30分鐘內用流式細胞儀分析。由于研究的人腫瘤細胞株數量眾多，下面僅以非小細胞肺癌A549為例，簡要描述研究腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8體外、體內的抗腫瘤活性及其作用機制的方法:
[0104]細胞形態分析:取處于對數生長期的細胞，胰酶消化后，接種于12孔板中，加入1.5ml培養液，將培養板移入培養箱中進行培養。待細胞密度長到70%時用不同的藥物處理，藥物及其濃度如下:Annexin V (360ng/ml) , TRAIL (180ng/ml) , Annexin V (360ng/ml)+TRAIL (180ng/ml)以及TP8 (600ng/ml),以PBS作為對照，處理6小時后，用PBS洗兩遍，在顯微鏡下觀察。
[0105]不同藥物對誘導A549凋亡的分析:取處于對數生長期的細胞，胰酶消化后，接種于12孔板中，加入1.5ml培養液，將培養板移入培養箱中進行培養。待細胞密度長到70%時用不同的藥物處理，藥物及其濃度如下:Annexin V(360ng/ml), TRAILC 180ng/ml), AnnexinV (360ng/ml) +TRAIL (180ng/ml)以及 TP8 (600ng/ml)，以 PBS 作為對照，處理 6 小時后，經胰酶消化后從孔中吸出，PBS洗兩遍，4°C 800rpm離心5分鐘，去上清，用200μ I結合緩沖液重懸細胞，加入終濃度為2 μ g/ml的EGFP-Annexin V室溫孵育20分鐘后，加入300 μ I結合緩沖液并轉入流式管中，每管加入I μ g碘化吡啶(PI)，在30分鐘內用流式細胞儀分析。
[0106]藥物作用劑量對誘導A549凋亡的分析:取處于對數生長期的細胞，胰酶消化后，接種于12孔板中，加入1.5ml培養液，將培養板移入培養箱中進行培養。待細胞密度長到70%時用不同濃度的腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8處理即10ng/ml, 30ng/ml,50ng/ml, 100ng/ml, 200ng/ml, 400ng/ml, 600ng/ml, 800ng/ml,處理 6 小時后，經膜酶消化后從孔中吸出，PBS洗兩遍，4°C 800rpm離心5分鐘，去上清，用200 μ I結合緩沖液重懸細胞，加入終濃度為2 μ g/ml的EGFP-Annexin V室溫孵育20分鐘后，加入300 μ I結合緩沖液并轉入流式管中，每管加入I μ g碘化吡啶(PI )，在30分鐘內用流式細胞儀分析。
[0107]藥物處理時間對誘導A549凋亡的分析:取處于對數生長期的細胞，胰酶消化后，接種于12孔板中，加入1.5ml培養液，將培養板移入培養箱中進行培養。待細胞密度長到70%時用600ng/mlTP8分別處理I小時，2小時，4小時，6小時，8小時，10小時后經胰酶消化后從孔中吸出，PBS洗兩遍，4°C 800rpm離心5分鐘，去上清，用200 μ I結合緩沖液重懸細胞，加入終濃度為2 μ g/ml的EGFP-Annexin V室溫孵育20分鐘后，加入300 μ I結合緩沖液并轉入流式管中，每管加入I μ g碘化吡啶(PI )，在30分鐘內用流式細胞儀分析。
[0108]TRAIL、RGD-TRAIL以及TP8誘導A549凋亡的效果比較:取處于對數生長期的細胞，胰酶消化后，接種于12孔板中，加入1.5ml培養液，將培養板移入培養箱中進行培養。待細胞密度長到70%時用等摩爾數的TRAIL，RGD-TRAIL以及TP8處理，處理6小時后，經胰酶消化后從孔中吸出，PBS洗兩遍，4°C 800rpm離心5分鐘，去上清，用200 μ I結合緩沖液重懸細胞，加入終濃度為2 μ g/ml的EGFP-Annexin V室溫孵育20分鐘后，加入300 μ I結合緩沖液并轉入流式管中，每管加入I μ g碘化吡啶(PI )，在30分鐘內用流式細胞儀分析。
[0109]本發明在體外比較了一系列腫瘤細胞對TRAIL和TP8敏感性的差異。TP8較TRAIL有更強的誘導腫瘤細胞凋亡的能力，其能誘導TRAIL敏感的、中度敏感的甚至TRAIL不敏感的腫瘤細胞凋亡。腫瘤壞死因子相關凋亡配體對于結腸癌細胞Colo-205的EC50 (半有效劑量)是1.67nM，腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8的EC50則為0.61nM，活性提高2.74倍；腫瘤壞死因子相關凋亡配體對于乳腺癌細胞MDA-MB-231的EC50是2.96nM，腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8的EC50則為0.57nM,活性提高5.19倍；腫瘤壞死因子相關凋亡配體對于宮頸癌細胞Hela的EC50是33.75nM，腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8的EC50則為0.84nM，活性提高40.18倍；腫瘤壞死因子相關凋亡配體對于小細胞肺癌細胞H446的EC50是48.63nM，腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8的EC50則為0.85nM，活性提高57.21倍；腫瘤壞死因子相關凋亡配體對于肝癌細胞PLC的EC50是78.97nM，腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8的EC50則為0.46nM，活性提高171.67倍；腫瘤壞死因子相關凋亡配體對于非小細胞肺癌細胞H1229的EC50是67.71nM，腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8的EC50則為l.0lnM，活性提高67.04倍；腫瘤壞死因子相關凋亡配體對于肝癌細胞Bel7402的EC50是389.5nM，腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8的EC50則為1.58nM，活性提高246.52倍；腫瘤壞死因子相關凋亡配體對于非小細胞肺癌細胞A549的EC50大于1000.0nM (即本發明所設實驗條件下無法檢出)，腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8的EC50則為5.82nM，活性至少提高171.82倍以上；腫瘤壞死因子相關凋亡配體對于乳腺癌細胞MCF-7的EC50大于1000.0nM (即本發明所設實驗條件下無法檢出)，腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8的EC50則為0.57nM，活性至少提高1754.39倍以上；腫瘤壞死因子相關凋亡配體的EC50對于淋巴瘤細胞U937的EC50大于1000.0nM (即本發明所設實驗條件下無法檢出)，腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8的EC50則為2.96nM，活性至少提高337.84倍以上；腫瘤壞死因子相關凋亡配體對于肝癌HepG2細胞的EC50大于1000.0nM (即本發明所設實驗條件下無法檢出)，腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8的EC50則為3.82nM，活性至少提高261.87倍以上。
[0110]由上述結果可見，腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白能誘導TRAIL敏感的、中度敏感的甚至TRAIL不敏感的腫瘤細胞凋亡，而且對于Colo-205和MDA-MB-231腫瘤細胞，進行測定EC50實驗時，腫瘤壞死因子相關凋亡配體僅僅需要作用細胞4小時，而不是像常規測定其他腫瘤細胞時需要作用24小時，由此可見腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白具有強烈增強的誘導腫瘤細胞凋亡的能力。而且，無論是對TRAIL高度敏感細胞，TRAIL中度敏感細胞，還是TRAIL抵抗細胞，腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白的EC50都不超過6nM，這充分說明腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白強大的誘導細胞凋亡活性。
[0111]雖然誘導凋亡的能力增強了，但TP8對腫瘤的特異性沒有改變，因為正常細胞系L02和293T不受TP8的影響，即是說TP8不會帶來額外的毒副作用(圖2.1，2.2)。為了確定TP8誘導了腫瘤細胞凋亡，經等摩爾數的Annexin V，TRAIL, Annexin V+TRAIL以及TP8處理的A549細胞分別流式細胞儀檢測凋亡情況以及用顯微鏡和透射電鏡觀察細胞形態變化。流式結果表明，僅TP8誘導了明顯的凋亡(圖3.3)。與流式結果一致，A549細胞只在TP8處理后才有明顯的凋亡形態(圖3.1,3.2)。TP8誘導的A549凋亡具有時間和劑量依賴性(圖4.1,4.2)。除誘導腫瘤細胞凋亡之外，腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白還具有長期的作用效應，它能顯著抑制腫瘤細胞A549的克隆形成(圖3.4)，因此具有抑制腫瘤生長的能力。
[0112]RGD-TRAIL是本課題組研發的一個腫瘤靶向性的腫瘤壞死因子相關凋亡配體變體蛋白，其誘導腫瘤細胞凋亡的活性顯著好于野生型TRAIL (中國發明專利號:ZL200710133862.1)。等摩爾數的 TRAIL、RGD-TRAIL、TP8 在誘導 A549 凋亡時，RGD-TRAIL較TRAIL效果好，但是TP8的效果最好、為RGD-TRAIL的2倍以上。RGD-TRAIL和TP8誘導的凋亡隨著濃度的升高而增加，TRAIL隨著濃度的升高在誘導凋亡的效果上沒有明顯變化(圖 5.1.)。
[0113]由Annexin V-TNF構成的腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白(SEQ ID NO:6)也在標準的TNF測活細胞L929上表現出類似的增強的誘導細胞凋亡活性。
[0114]實施例3
[0115]腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白的作用機制分析
[0116]Western Blot從蛋白水平檢測與凋亡通路相關的重要蛋白表達情況:將A549細胞置于6孔細胞培養板生長至80%密度，根據要求加等摩爾數的藥物進行處理，繼續培養6小時后，收取細胞，用預冷的PBS將細胞沉淀洗滌一次后，加入適量細胞裂解液(含蛋白酶抑制劑，Roche公司)懸浮混勻，冰上放置30分鐘后，4°C，12000rpm離心15分鐘，吸取上清，利用考馬斯亮藍法(Bradford法)測定蛋白濃度,調整蛋白濃度，加入4X loading buffer并在沸水浴中煮樣5分鐘，樣品置于一 20°C保存備用。
[0117]按照分子克隆中的配方配制12% SDS-PAGE gel，通過測定的樣品蛋白含量計算，使各組樣品上樣量保持一致，上樣量為50 μ g。濃縮膠采用80伏恒壓進行壓縮，分離膠采用120伏電壓分離，然后使用半干法將SDS-PAGE膠中蛋白轉印至PVDF (polyvinylidenefluoride)膜上，10伏恒壓電轉2_3小時。轉印結束后根據預染Marker確定轉印效率。然后將轉印后的膜放在新鮮配制的5%脫脂奶粉(PBST配制)中進行封閉，室溫孵育I小時。封閉結束后,根據抗體說明用含5%脫脂奶粉的PBST溶液稀釋一抗(primary antibody)至最佳工作濃度，將膜包被于一抗中置于4°C作用過夜。然后將膜用PBST置于搖床上輕輕搖蕩洗滌3次，每次5-10分鐘。洗滌完成后包被二抗，將HRP (辣根過氧化物酶)標記的二抗用含5%脫脂奶粉的PBST溶液按1:2000稀釋，與膜共同孵育I小時，同樣以PBST洗滌3次，每次5-10分鐘。最后，按照產品說明配制發光底物溶液(ECL化學發光底物)滴加于PVDF膜上，室溫放置I分鐘，用濾紙將多余發光液吸干，將膜用保鮮膜包被后放入壓片夾移入暗房，取X光片置于膜上曝光1-5分鐘后，沖洗膠片，根據曝光條帶判斷蛋白的表達結果。
[0118]RT-PCR從mRNA水平檢測與凋亡通路相關的重要蛋白表達情況:
[0119](1)細胞mRNA提取:所有物品均提前用DEPC處理并滅菌(或購買的RNase free產品)。將細胞消化計數后分裝于六孔細胞培養板，置細胞培養箱培養，待細胞生長至80%密度后，加藥進行處理，繼續培養6小時后，PBS洗滌一次。加入1ml Trizol，用移液槍吹打至細胞完全溶解。室溫放置5分鐘。加入200 μ I的氯仿/ml Trizol，振蕩15秒后室溫放置2-3分鐘，然后于4°C，12000g離心15分鐘。吸取上層(約400 μ I )，轉移至另一新印pendorf管中，加入500 μ I異丙醇，混勻，放置10分鐘，4°C，12000g離心10分鐘。可見RNA沉淀。棄去上清，加入lml75%乙醇洗滌沉淀，7500g離心5分鐘，在空氣中晾干RNA沉淀，加入30 μ I DEPC處理的DDW溶解，測定RNA濃度及純度，取一部分立即進行逆轉錄，剩余RNA凍存于-70°C，備用。
[0120](2) RNA逆轉錄:采用20 μ I逆轉錄體系，將提取的模板RNA約2 μ g與5Xbuffer4y 1,2 μ I dNTP(1mM)，I μ I oligo (dT) 18 (10 μ Μ)，RNase Inhibitorl μ 1，逆轉錄酶Rever-Tra Ace- α-1 μ 1，混勻后37°C 30分鐘，85°C水浴反應5秒。
[0121](3)半定量PCR:取逆轉錄的cDNA作為模板，以GAPDH為內標，采用其引物進行PCR,調整模板的使用量，然后利用調整后的模板同時擴增目的基因和GAPDH基因，以GAPDH為參照，觀察不同加藥處理對與凋亡通路相關蛋白基因RNA轉錄水平的影響。PCR采用20 μ I PCR反應體系:2μ IlOXTaq buffer，2y I dNTPs,2y I Mg2+，I μ I 上游引物，I μ I 下游引物，I μ I cDNA 模板，0.5 μ I rTaq polymerase，用 DDW 補足到 20 μ I。PCR 條件:94°C熱變性4min，94°C變性40s，55°C退火40s，72°C延伸40s，循環數為20-32個，最后72°C延伸分鐘。PCR產物進行I %瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外觀測儀下觀察，拍照記錄。
[0122]所用特異性引物為:DR4上游引物:5 ’ -CAGAACGTCCTGGAGCCTGTAAC-3，，下游引物:5’-ATGTCCATTGCCTGATTCTTTGTG-3’ ；DR5 上游引物:5 ’-GGGAAGAAGATTCTCCTGAGATGTG-3 ’，下游引物:5’-ACATTGTCCTC AGCCCCAGGTCG-3’；DcR2 上游引物:5’_CTTCAGGAAACCAGAGCTTCCCTC-3’，下游引物 5’ -TTCTCCCGTTTGCTTA-TCACACGC-3’ ；Bcl-xl 上游引物:5’ -TTGGACAATGGACTGGTTGA-3’，下游引物:5’ -GTAGAGTGGATGGTC AGTG-3’ ；Bax 上游引物:5’ -AAGAAGCTGAGCGAGTGT-3’，下游引物:5’ -GGAGGAAGTCCAATGTC-3’ ；Bim 上游引物:5’ -ATGAGAAGATCCTCCCTGC T-3’，下游引物:5’ -AATGCATTCTCCACACCAGG-3’;Noxa 上游引物:5’ -GTGCCCTTGGAAACGGAGA-3’，下游引物為:5’ -CCAGCCGCCCAGTCTAATC A_3’;Puma 上游引物:5’ -CAGACTGTGAATCCTGTGCT-3’，下游引物為:5’ -ACAGTATCTTACAGGCTGGG-3’ ；GAPDH上游引物:5’ -ACCACAGTCCAT GCCATCAC-3’，下游引物:5’ -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’ ；
[0123]不同蛋白與A549結合能力分析:熒光染料FAM標記的蛋白FAM-AnnexinV，FAM-TRAIL, FAM-Annexin V+FAM-TRAIL, FAM-TP8 與 A549 于 37°C孵育 30 分鐘，胰酶消化，收集細胞，經PBS洗3遍后，用流式細胞儀分析。以FAM-BSA作為陰性對照。
[0124]DR4 和 DR5 表達水平的流式分析:A549 細胞經 PBS、Annexin V、TRAIL、AnnexinV+TRAIL、TP8處理6小時后，收細胞后，用含有0.2%FBS的PBS洗一遍。細胞與用含有0.2%FBS的PBS稀釋后的熒光標記的抗體在4°C避光孵育I小時。用含有0.2%FBS的PBS將與抗體孵育后的細胞洗3遍后，細胞由4%多聚甲醛固定并用流式細胞儀進行檢測和分析。以與含有0.2%FBS的PBS孵育的細胞作為陰性對照。
[0125]Caspase8 和 Caspase3 活性分析:A549 細胞經 PBS、Annexin V、TRAIL、AnnexinV+TRAIL、TP8處理6小時后，收細胞后Caspase8和Caspase3活性分別用碧云天的Caspase8和CaSpaSe3活性檢測試劑盒進行分析。用試劑盒提供的底物和標準品繪制標準曲線。活性檢測的具體操作如下:
[0126]胰酶消化并收集細胞，600g4°C離心5分鐘，并用PBS洗一次。加入裂解液,冰上裂解15分鐘。4°C 16，000-20，OOOg離心10-15分鐘，上清轉入預冷的離心管中，立即測定cspase活性。將蛋白裂解液加入底物中，37°C孵育I小時至2小時，顏色變化較明顯時，測定A405,同標準曲線對比即可得出caspase活性。
[0127]腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白誘導腫瘤細胞凋亡的方式與TRAIL完全相同，均依賴于Caspase-8。TRAIL, Annexin V+TRAIL以及腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白與腫瘤細胞A549細胞表面的受體DR4/DR5的結合能力沒有差異(圖6.3)。下游的信號分子(如DR4, DR5, DcR2以及與線粒體通路相關的蛋白如Bcl-XL, Bax, Bim, Noxa, Puma)的表達在不同藥物處理后也無差異(圖6.1,6.2,6.4)。但是Caspase-8, Caspase-3, PARP只有在經腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白處理后才被明顯激活(圖6.1,7.1,7.2)。而且，Caspase-8抑制劑Z-1ETD-FMK可明顯減少腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白誘導的細胞凋亡，而Caspase-9抑制劑Z-LEHK-FMK對腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白誘導的凋亡無明顯影響(圖7.3)。這充分說明，腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白與TRAIL具有完全一樣的作用機制，其安全性與TRAIL相同。
[0128]此外，我們還構建、表達和制備了腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白的變體，在該變體中腫瘤壞死因子相關凋亡配體的活性中心-TRAIL第230位的半胱氨酸(Cys230)變突變為甘氨酸。如圖5.2所示，腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白變體就不再具有誘導細胞凋亡的活性，這充分說明腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白是通過增加腫瘤細胞對腫瘤壞死因子相關凋亡配體敏感性、即通過腫瘤壞死因子相關凋亡配體誘導細胞凋亡的信號通路發揮抗腫瘤作用的。腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白并未增加了其它誘導細胞凋亡的作用方式，因此其具有與腫瘤壞死因子相關凋亡配體相同的安全性。
[0129]實施例4
[0130]腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白在腫瘤動物模型的抗腫瘤療效實驗
[0131]小鼠背部皮下腫瘤模型制備:5-6周齡的雌性裸鼠購于北京軍事研究所。取指數生長期的A549或Bel7402或Colo205細胞，經胰酶消化后，用PBS于800 Xg離心洗滌2次。計數后PBS重懸并調整細胞濃度至17細胞/ml然后每只小鼠右側背部皮下經皮下注射100 μ L (16細胞)，一周左右，腫瘤大小生長至50mm3左右，將小鼠分成8組，每組8只。分別用PBS、Annexin V、TRAIL、Annexin V+TRAIL、TP8以及化療藥物給藥，蛋白類藥物及PBS經腹腔注射給藥，每天注射一次，共治療14天。化療藥物經尾靜脈給藥，每四天注射一次，共治療14天。從開始治療后每兩天測量腫瘤大小，并按下列公式計算腫瘤體積:0.5XL1X (L2)2,其中LI為腫瘤長軸，L2為腫瘤短軸。治療第15天,處死小鼠。
[0132]腫瘤組織切片⑶31染色分析:給藥結束后，處死老鼠，立即剖取出腫瘤組織用OTC包埋后，用冰凍切片機切片，切片厚度為5 μ m。切片完成后，風干，在冰丙酮中固定10分鐘，室溫晾干。用PBST洗片三次，擦干邊緣，用油筆沿組織切片外緣畫圈，用羊血清封閉液室溫封閉30min。用抗體稀釋液稀釋一抗(⑶311:50)。PBST沖洗片子后包被一抗4°C過夜。PBST沖洗3-5次，擦干邊緣。包被二抗，37°C，45min。PBST洗三次。擦干邊緣。DAPI染細胞核，用熒光顯微鏡鏡檢。
[0133]腫瘤組織切片TUNEL分析:給藥結束后，處死老鼠，立即剖取出腫瘤組織用OTC包埋后，用冰凍切片機切片，切片厚度為5 μ m。切片完成后，風干，在冰丙酮中固定10分鐘，室溫晾干。用PBST洗片三次，擦干邊緣，用油筆沿組織切片外緣畫圈，用蛋白酶K室溫孵育5分鐘，TBS洗一次。3%H202室溫孵育5分鐘后，TBS洗一次。TdT Equilibrat1n Buffer室溫孵育 15 分鐘，吸干 TdT buffer,滴加 TdT labeling react1n mixture, 37°C孵育 1.5 小時，TBS洗三次并吸干，加入stop buffer室溫孵育10分鐘，吸干stop buffer,加入conjugatebuffer,室溫孵育30分鐘，TBS洗一次并吸干，滴加DAB在組織表面，室溫孵育15分鐘后，ddH20洗一次并吸干，在組織表面滴加甲基綠室溫孵育3分鐘，吸去甲基綠，在組織表面滴加100%乙醇三次至組織表面無綠色。在組織表面迅速滴加二甲苯，并迅速吸干，重復一次，用甘油封片，在熒光顯微鏡下觀察。
[0134]本發明采用了三種腫瘤模型，即對TRAIL不敏感的A549腫瘤模型，對TRAIL中度敏感的Bel7402腫瘤模型以及對TRAIL敏感的Colo-205腫瘤模型評估了腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8的抗腫瘤效果。在A549腫瘤模型中，腹腔注射TRAIL (5mg/kg/天)，Annexin V (7.5mg/kg/天)，TRAIL (5mg/kg/天)+Annexin V (7.5mg/kg/天)，腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8 (6.25mg/kg/天、12.5mg/kg/天、25mg/kg/天)。與陰性對照組(磷酸緩沖液組)相比(腫瘤倍增時間為5.3天),Annexin V, TRAIL, Annexin V+TRAIL未能有效抑制腫瘤生長，三組的腫瘤倍增時間分別為:6.1天、6.1天、6.0天；與陰性對照組相比，三組的腫瘤生長延滯時間(體積達到100mm3時，相對于PBS組所需時間)分別為:0天、0.6天、1.1天。而不同劑量的腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8均能明顯抑制腫瘤生長，且這種抑制作用隨著腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8劑量的增加而增強，三個劑量組的腫瘤倍增時間分別為:6.5天、7.4天、7.9天；與陰性對照組相比，三組的腫瘤生長延滯時間分別為:2.8天、6.9天、12.8天(圖8.1、8.2)。
[0135]在Bel7402 腫瘤模型中，腹腔注射 TRAIL (5mg/kg/天)，Annexin V (7.5mg/kg/天)，TRAIL (5mg/kg/天)+Annexin V (7.5mg/kg/天),腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8 (6.25mg/kg/天、12.5mg/kg/天、25mg/kg/天)。腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8 (12.5mg/kg組)抑制腫瘤生長的效果較陰性對照組(磷酸緩沖液組),Annexin V組，TRAIL組以及Annexin V+TRAIL組要明顯，且這種抑制作用隨著腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8劑量的增加而增強。與陰性對照組(磷酸緩沖液組)相比(腫瘤倍增時間為7.3天)，Annex in V，TRAIL, Annexin V+TRAIL未能有效抑制腫瘤生長，三組的腫瘤倍增時間分別為:7.8天、8.0天、7.6天；與陰性對照組相比，三組的腫瘤生長延滯時間分別為:4天、5.4天、5.0天。而不同劑量的腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8均能明顯抑制腫瘤生長，且這種抑制作用隨著腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8濃度的增加而增強，三個劑量組的腫瘤倍增時間分別為:9.0天、9.3天、10.1天；與陰性對照組相比，三組的腫瘤生長延滯時間分別為:9.3天、10.0天、18.5天(圖8.3,8.4)。
[0136]在Colo-205 腫瘤模型中，腹腔注射 TRAIL (5mg/kg/天)，Annexin V (7.5mg/kg/天)，TRAIL (5mg/kg/天)+Annexin V (7.5mg/kg/天),腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8 (6.25mg/kg/天、12.5mg/kg/天、25mg/kg/天)。腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8 (12.5mg/kg組)抑制腫瘤生長的效果較陰性對照組(磷酸緩沖液組)、Annexin V組、TRAIL組以及Annexin V+TRAIL組要明顯，且這種抑制作用隨著腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8劑量的增加而增強。與陰性對照組(磷酸緩沖液組)相比(腫瘤倍增時間為10.0天)，Annexin V, TRAIL, Annexin V+TRAIL未能有效抑制腫瘤生長,三組的腫瘤倍增時間分別為:10.2天、12.5天、10.4天；與陰性對照組相比，三組的腫瘤生長延滯時間分別為:0.9天、4.6天、3.1天。而不同劑量的腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8均能明顯抑制腫瘤生長，且這種抑制作用隨著腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8濃度的增加而增強，三個劑量組的腫瘤倍增時間分別為:14.5天、15.0天、14.0天；與陰性對照組相比，三組的腫瘤生長延滯時間分別為:12.2天、18.3天、22天(圖8.5,8.6)。
[0137]用TUNEL對腫瘤組織切片中的腫瘤細胞凋亡進行了評估。與體外實驗結果一致，僅TP8組能夠明顯地誘導腫瘤細胞的凋亡(圖9)。
[0138]實施例5
[0139]腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8與順鉬聯用抑制腫瘤生長的療效評價實驗
[0140]接種在皮下的A549腫瘤大小生長至50-100mm3左右，將小鼠分成8組，每組8只。分別用PBS、TP8 (6.25mg/kg/day)以及順鉬(5mg/kg/day)進行治療。TP8與PBS經腹腔注射給藥，每天注射一次，共治療14天。順鉬經尾靜脈給藥，每四天注射一次，共治療14天。從開始治療后每兩天測量腫瘤大小，并按下列公式計算腫瘤體積:0.5XL1X (L2)2，其中LI為腫瘤長軸，L2為腫瘤短軸。
[0141]與PBS陰性對照組相比，腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白TP8、順鉬以及TP8-順鉬聯用均能抑制A549腫瘤的生長。TP8和順鉬聯用時，抑制A549腫瘤生長的效果明顯好于TP8、以及順鉬單獨使用時的治療效果。PBS組腫瘤倍增時間為16.1天，順鉬組腫瘤倍增時間為31.35天，TP8組腫瘤倍增時間為30.96天，TP8與順鉬聯用組腫瘤倍增時間為40.92天。腫瘤生長延遲時間(即腫瘤體積達到100mm3時相對PBS組所需時間)順鉬組為15.25天，TP8組為14.87天，TP8與順鉬聯用組為24.83天(圖10)。
[0142]本發明還嘗試將腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白與抗腫瘤生物治療藥物，如重組內皮抑素(Endostatin)、血管抑素(Vasostatin)等聯合使用，也取得了相似的協同治療效果。
[0143]本發明還嘗試將腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白與抗腫瘤中藥成分，如雷公藤內酯醇等聯合使用，也取得了相似的協同治療效果。
[0144]本發明還嘗試將腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白與本實驗室前期已經研究多年的抗腫瘤減毒沙門氏菌VNP20009聯合使用，也取得了相似的協同治療效果。
[0145]本發明還嘗試利用腫瘤靶向性的減毒沙門氏菌VNP20009為基因治療載體，利用本實驗室前述開發的技術(《治療基因在厭氧組織靶向性遞送和選擇性穩定表達方法及應用》中國發明專利申請號:201010565011.6)進行腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白的基因治療。利用減毒沙門氏菌VNP20009將腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白基因的表達質粒在腫瘤動物中進行基因治療，取得了比單獨用減毒沙門氏菌VNP20009治療更好的治療效果。
[0146]以膜聯蛋白和腫瘤壞死因子相關凋亡配體為主要成分而構成的腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白具有顯著強大的抗多種腫瘤的生物活性、能夠克服多種腫瘤細胞對細胞凋亡的不敏感或者抵抗，并且能夠與化療藥物、生物藥物、基因治療、微生物藥物、中藥等治療方法聯合應用，產生更好的治療效果。
[0147]因此，由具有磷脂結合活性的膜聯蛋白家族成員蛋白質或具有磷脂結合活性的膜聯蛋白家族成員蛋白質衍生物與腫瘤壞死因子家族中具有誘導細胞凋亡活性的成員蛋白質或具有誘導細胞凋亡活性的腫瘤壞死因子家族細胞凋亡蛋白衍生物構成的腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白具有顯著增強的誘導細胞凋亡的生物活性、能夠克服目前廣泛存在的包括腫瘤細胞在內的多種病理細胞對細胞凋亡的不敏感或者抵抗，并且能夠與現有的誘導細胞凋亡的藥物或者治療方法(化療藥物、生物藥物、基因治療、微生物藥物、中藥等)聯合應用，產生更好的治療效果。
[0148]在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考一樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上訴講授內容后，本領域技術人員可以對本發明作各種修改或改動，這些等價形式均應包含在本發明的保護范圍之內。
[0149]

【權利要求】
1.一種腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白，其特征在于:它包括膜聯蛋白的氨基酸序列、腫瘤壞死因子家族細胞凋亡蛋白的氨基酸序列、以及位于膜聯蛋白氨基酸序列和腫瘤壞死因子家族細胞凋亡蛋白氨基酸序列之間的連接肽序列3部分，其中所述的膜聯蛋白是指具有磷脂結合活性的膜聯蛋白家族成員或具有磷脂結合活性的膜聯蛋白家族成員衍生物，所述的腫瘤壞死因子家族細胞凋亡蛋白是指腫瘤壞死因子家族中具有誘導細胞凋亡活性的成員蛋白質或具有誘導細胞凋亡活性的腫瘤壞死因子家族成員衍生物。
2.一種腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白，其特征在于:它包括膜聯蛋白V的氨基酸序列或具有磷脂結合活性的膜聯蛋白V衍生物序列、腫瘤壞死因子相關凋亡配體的氨基酸序列或具有誘導細胞凋亡活性的腫瘤壞死因子相關凋亡配體衍生物序列、以及位于膜聯蛋白V的氨基酸序列和腫瘤壞死因子相關凋亡配體氨基酸序列之間的連接肽序列3部分。
3.根據權利要求1或2所述的腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白，其特征在于:所述連接肽序列由1-30個氨基酸殘基構成。
4.根據權利要求1或2所述的腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白，其特征在于:所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1-6中所示。
5.一種分離的DNA分子，其特征在于:它編碼權利要求1所述的融合蛋白。
6.根據權利要求5所述的DNA分子，其特征在于:其核苷酸序列如SEQID NO:7~12中所示。
7.—種載體,其特征在于:它含有權利要求5或6所述的DNA分子。
8.一種宿主細胞，其特征在于:它含有權利要求7所述的載體。
9.根據權利要求8所述的宿主細胞，其特征在于:它包括重組大腸埃希菌BL21。
10.一種制備權利要求1-4任一項所述的融合蛋白的方法，其特征在于，它包括如下步驟:在適合表達所述融合蛋白的條件下，培養權利要求7所述的宿主細胞，從而表達出所述的融合蛋白；和分離所述的融合蛋白。
11.根據權利要求10所述的制備方法，其特征在于:所述宿主細胞在低溫下進行培養和誘導表達，所述低溫指10-35°c。
12.根據權利要求10所述的制備方法，其特征在于:所述分離融合蛋白采用離子交換層析和金屬親和層析。
13.根據權利要求1或2所述的一種腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白在制備誘導細胞凋亡的治療藥物中的應用。
14.根據權利要求1或2所述的一種腫瘤壞死因子相關凋亡配體融合蛋白在制備腫瘤治療藥物中的應用。
15.根據權利 要求1或2所述的應用，其特征在于:所述應用包括將所述融合蛋白單獨用于制備腫瘤治療藥物，或與現有的腫瘤治療藥物聯合用藥，或與現有的腫瘤治療藥物組成組合物，或與現有化療、放療、中藥治療、生物治療等方法在腫瘤治療中聯合應用。
16.一種藥物組合物，其特征在于:包括藥學上可接受的載體或賦形劑或稀釋劑，以及有效量的權利要求1或2所述的融合蛋白。
【文檔編號】C12N15/63GK104177500SQ201310432137
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2013年9月22日 優先權日:2013年5月24日
【發明者】華子春, 邱樊, 胡敏進 申請人:江蘇靶標生物醫藥研究所有限公司