一種調控水稻籽粒大小和粒重的方法
【專利摘要】本發明公開了一種調控水稻籽粒大小和粒重的方法，包括OsABC1-2基因過量表達載體的構建步驟和OsABC1-2過表達轉基因植株的獲得步驟。本發明通過在粳稻中過量表達OsABC1-2基因，顯著提高了種子大小和粒重，并增強了對黑暗處理誘導葉片衰老的抗性。因而，該基因是水稻粒型性狀的一個新的調控因子，在提高水稻的種子大小和粒重以及增加作物產量上具有潛在的工業應用價值，產生更高的經濟效益。
【專利說明】一種調控水稻籽粒大小和粒重的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程【技術領域】，具體涉及一種調控水稻籽粒大小和粒重的方法。【背景技術】
[0002]水稻是最重要的糧食作物之一，養活了全世界一半以上的人口。隨著人口的增長和生活水平的提高，人們對稻米無論從產量還是品質上均提出越來越高的要求。據推算，至2025年，全球人口將超過80億，以稻米為主食的人口數量將增至35億。按最保守的估計，由于人口增長而導致稻米需求量的增加至少達3億噸。水稻產量的提高，依靠擴大種植面積的潛力已很有限。由于受水資源和耕地面積的限制，加上經濟發展和城市化的推進，不少產稻國家的水稻種植面積實際上已有所下降。為此，今后將主要依賴于單位面積產量的提高來進一步提高水稻產量。[0003]粒形性狀包括粒長、粒寬、粒厚、粒重和長寬比等，是水稻產量的重要構成因子。控制水稻粒形遺傳的數量性狀基因座(QTLs)的定位、相關基因的克隆和應用已有較多研究報道。是一個控制水稻粒長的主效基因，定位在第三號染色體著絲粒附近。該基因由五個外顯子組成，其第二個外顯子的一個無義突變導致蛋白C端的缺失，從而引起大粒品種的籽粒變大。通過RNA干涉抑制GS3的表達顯著提高了小粒品種川7的粒長和粒重。GW2和qS勝/G勝均為控制水稻粒寬的QTL。其中GW2定位在水稻第2號染色體的短臂上，編碼一個新的泛素蛋白連接酶。GW2功能的缺失增加了穎殼細胞的數目，導致穎殼變大、粒寬和粒重增加。通過分子標記選擇將大粒品種的02?基因導入小粒品種中，其粒重和單株產量分別增加了 49.8 %和20 %。q5F5/-1勝定位于水稻第5號染色體短臂。該基因編碼一個由144個氨基酸殘基組成的蛋白，通過泛素蛋白酶體途徑負調控水稻穎殼細胞的數目，進而控制粒寬、粒重和產量。目前所分離的粒形基因多為控制粒形性狀的負調控因子。近來，Li等(Li Y-B, Fan C-C, Xing Y-Z, Jiang Y-H, Luo L-J, Sun L, Shao D, Xu C-J, Li X-H,Xiao J-Hj He Y-Qj Zhang Q-F.Natural variation in GS5 plays an important role inregulating grain size and yield in rice.Nature Genetics.2011， 43: 1266-1269)克隆了一個控制水稻籽粒大小的QTL，GS5。該基因編碼一個推定的絲氨酸羧肽酶，正調控粒寬、籽粒灌漿和粒重。在粳稻品種中花11中過量表達顯著提高了水稻籽粒的大小和產量。
【發明內容】
[0004]發明目的:針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種調控水稻籽粒大小和粒重的方法，通過在粳稻中過量表達基因，顯著提高了種子大小和粒重，并增強了對黑暗處理誘導葉片衰老的抗性，以使其滿足使用要求。
[0005]技術方案:為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下:
一種調控水稻籽粒大小和粒重的方法，包括以下步驟:
I) OsABCl-2基因過表達載體的構建以野生型粳稻品種中花11 CDNA為模板，設計一對引物，擴增基因，引物序列如下:
在引物兩端分別引入了限制性內切酶ifeMl I和分e I的識別位點；PCR擴增產物用膠回收試劑盒(TaKaRa，805A)純化，并利用及I和分e I酶切后，連入用相同限制性酶切割的x￡AMBIA1301-UbiN0SmM ;重組質粒采用熱擊轉化法轉化大腸桿菌DH5 α，轉化物在含卡那霉素的LB平板上篩選，挑選陽性克隆，提取質粒后測序驗證正確，獲得OsABCl-2過表達載體；其中，之基因序列如SEQ ID N0.1所示；
2) OsABCl-2過表達轉基因植株的獲得
將測序正確的過表達載體通過電擊法轉入農桿菌菌株EHA105中；將粳稻品種中花11未成熟種子帶殼滅菌，在超凈工作臺上分離出未成熟胚，接種在誘導愈傷培養基上；暗培養6d后挑選生長旺盛，顏色淺黃的胚性愈傷組織，作為轉化的受體；將帶有OsABC1-2過表達重組質粒的農桿菌EHA105菌株培養至對數生長期，離心收集菌體，并用加入乙酰丁香酮的AAM培養基重懸后倒入愈傷組織進行侵染；侵染結束后的愈傷組織在共培養基上培養3d，然后在含有50 mg I/1潮霉素的選擇培養基上篩選抗性愈傷組織，經兩代篩選以后，將抗性愈傷組織進行預分化處理和分化再生；再生小苗轉入1/2MS培養基上生根壯苗；小苗經練苗處理后移入大田種植。
[0006]所述的調控水稻籽粒大小和粒重的方法，所述-J?基因表達蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0007]用于realtime PCR檢測說V-之基因的特異性引物0sABCl_2F和0sABCl_2R，弓丨物序列如下:
0sABCl-2F:5’ -AAGTCAGATGGTGCCAAGAG-3，
0sABCl-2R:5’ -AACAGCATACCGACCTAACC-3’。
[0008]可用現有的植物表達載體構建含有所述基因的重組表達載體。
[0009]所述植物表達載體包括雙元農桿菌載體(如pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、PCAMBIA3301、pCAMBIA1301_UbiN、pCAMBIA1300等)和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農桿菌冠癭瘤誘導(Ti)質粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉錄的非翻譯區均具有類似功能。
[0010]使用所述基因構建重組植物表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子、組成型啟動子或誘導型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動子、玉米的泛素啟動子(Ubiquitin)、脅迫誘導型啟動子Rd29A等,它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用；此外，使用本發明的基因構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，這些增強子區域可以是ATG起始密碼子或鄰接區域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域或結構基因。[0011]為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產生顏色變化的酶或發光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等)或是抗化學試劑標記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉化植株。
[0012]攜帶有所述基因的表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導等常規生物學方法轉化植物細胞或組織，并將轉化的植物組織培育成植株。
[0013]有益效果:與現有技術相比，本發明通過在粳稻中過量表達基因，顯著提高了種子大小和粒重，并增強了對黑暗處理誘導葉片衰老的抗性。因而，該基因是水稻粒型性狀的一個新的調控因子，在提高水稻的種子大小和粒重以及增加作物產量上具有潛在的工業應用價值，產生更高的經濟效益。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1是OsABCl-2基因過表達載體的構建示意圖；
圖2是OsABCL基因在野生型中花11 (ZHll)和過表達轉基因株系(OE)中的相對表達情況；
圖3是野生型中花11和過表達轉基因植株種子大小比較圖；
圖4是野生型中花11和過表達轉基因植株黑暗處理下的抗性比較圖。
[0015]具體實施方法
下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。
[0016]以下實施例中所使用的實驗方法若無特殊說明，均為常規操作方法，所使用的材料、試劑等，若無特殊說明，均可從商業途徑獲得。所述的百分含量，如無特別說明，均為質量百分含量。
[0017]實施例1-J?過表達轉基因株系的獲得及表型分析
1)OsABC1-2過表達載體的構建
采用RNAsimple總RNA提取試劑盒(Tiangen，DP419)提取粳稻品種中花11葉片總RNA，利用 PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa,6110A)試劑盒方法反轉錄成cDNA。反轉錄步驟如下:取RNA樣品3 μ g,分別加入50 μ mol L-1 OligodT primer I μ I和 IOmmol L-1 dNTP mixture I μ I,用 RNase free dH20補足體積 10 μ 1,65℃保溫5111；[11后，冰上迅速冷卻;變性后的反應液分別加入5XPrimeScript Buffer 4 μ I, 40U μ L-1 RNaseInhibitor 0.5 μ I, 200U μ L-1 PrimeScript RTase I μ I,用 RNase free dH20 補足體積20μ 1，緩慢混勻；按下列條件進行反轉錄反應:42°C 60min,70°C 15min，冰上放置。以cDNA 為模板，設 ii 對引物，利用 PrimeSTAR HS DNA Polymerase with GC Buffer (TaKaRa,044A)擴增OsABCl-2基因編碼區片段，引物序列如下:
0sABCl-20E-F:5’ -AAAAGGATCCCGCCCTCGCGATGTCGGCC-3’，
0sABCl-20E-R:5’ -AAAAACTAGTCCGATGGCTATGCTACAACG-3’，
PCR 反應體系:2XPrimeSTAR GC Buffer 25 μ 1,2.5mmol L-1 dNTP mixture 4μ I,10 μ mol L-1 0sABCl-20E-F、0sABCl_20E-R 引物各 2 μ 1，cDNA 模板 2 μ 1，2.5 U μ L-1PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μ I，用滅菌蒸懼水補足體積 50 μ I。
[0018]PCR反應條件:95°C變性5min ;然后98°C變性10s，68°C延伸3min，擴增35個循環；最后在72°C下延伸lOmin。
[0019]在引物兩端分別引入了限制性內切酶I和SPE I的識別位點。PCR擴增產物用膠回收試劑盒(TaKaRa，805A)純化，并利用及I和分e I酶切后，連入用相同限制性酶切割的P以遍以A?似-油iMW載體(圖1)。連接反應是利用T4 DNA Ligase (TaKaRa,2011A)進行。反應體系和條件為:IOXT4 DNA Ligase Buffer 2.5 μ 1，酶切回收后的基因片段300ng,載體DNA片段IOOng, 350U μ L-1 Τ4 DNA Ligase 1μ I,用滅菌蒸懼水補足體積25 μ 1，16°C過夜連接。重組質粒采用熱擊轉化法轉化大腸桿菌DH5 α。具體步驟為:將DH5a感受態細胞放置于冰上融化；將連接產物10 μ 1、感受態細胞50 μ I置于1.5mL滅菌管中，輕輕混勻后于冰上放置30min ;將上述混合物于42°C水浴鍋中熱擊45s，立即放回冰上，靜置2min ;在超凈工作臺上加LB液體培養基800 μ 1，37°C振蕩培養Ih ;吸取上述轉化物涂布在含卡那霉素的LB平板上過夜篩選。挑選陽性克隆，提取質粒后測序，獲得OsABCl-2過表達載體。
[0020]測序獲得的序列如SEQ ID N0.1所示，即為調控水稻籽粒大小和粒重的基因
表達的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0021]2) OsABC1-2過表達轉基因植株的獲得和表型分析
將測序正確的OsABC1-2過表達載體通過電擊法轉入農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株EHA105中，利用農桿菌介導法轉化粳稻品種中花11。轉化的具體方法是將粳稻品種中花11未成熟種子帶殼滅菌，在超凈工作臺上分離出未成熟胚，尖頭朝下接種在誘導愈傷培養基N6D2上；暗培養6d后挑選生長旺盛，顏色淺黃的胚性愈傷組織，作為轉化的受體；將帶有過表達重組質粒的農桿菌EHA105菌株培養至對數生長期，離心收集菌體，并用AAM培養基重懸；倒入愈傷組織浸泡15-20min，并不時搖動；侵染結束后的愈傷組織在N6D2C培養基上于28°C暗培養3d，然后分別在CXD2S1和CXD2S2選擇培養基上進行兩代篩選；將抗性愈傷組織轉入CCA培養基上于24-26°C暗培養條件下進行預分化處理IOd ;經預分化處理的愈傷組織轉入MSR培養基在25°C光培養下分化再生；再生小苗轉入1/2MS培養基上生根壯苗；小苗在陰涼處用涼開水練苗3d后移入大田種植，按常規方法進行管理和收獲。
[0022]參照Liu Q-Q, Chen X-H, Wang X-ff, Peng L-T, Gu M-H.A rapid simplemethod of assaying hygromycin resistance in transgenic rice plants.Journal ofAgricultural Biotechnology (農業生物技術學報)，2001, 9 (3):264-265 (in Chinese)所提供的方法對轉基因再生植株進行潮霉素抗性檢測，共獲得了 16株轉基因陽性植株。
[0023]采用RNAsimple總RNA提取試劑盒(Tiangen，DP419)分別提取野生型中花11和過表達轉基因株系總 RNA,利用 PrimeScript RT reagent Kit with gDNAEraser (TaKaRa, 047A)試劑盒所述方法反轉錄成cDNA，以基因編碼區特異性引物0sABCl-2F和0sABCl-2R進行realtime PCR,以水稻Actinl基因作為內參。引物序列如下:
0sABCl-2F:5’ -AAGTCAGATGGTGCCAAGAG-3，
0sABCl-2R:5’ -AACAGCATACCGACCTAACC-3’ActinlF:5’ - CCCCTCCTGAAAGGAAGTA-3’
ActinlR:5’ -GGTCCGAAGAATTAGAAGCA-3，
PCR 反應利用 SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRa, 820A)在 7500 realtime PCR 儀(Applied Biosystems)上進行。PCR體系為:2XSYBR位 Taq II 25 μ 1,10 μ molL 1上下游引物各2 μ 1, 50XROX Reference Dye II I yl,cDNA模板4 μ 1，滅菌蒸懼水16 μ I,總體積 50 μ I。
[0024]PCR條件為:95°C 30s 預變性；95°C 5s 變性，50°C 30s 退火，72°C 30s 延伸，40 個循環。
[0025]Realtime PCR結果表明，As仙67-之基因的表達上調了 3倍以上(圖2)。田間種植的過表達轉基因植株表型與野生型中花11無顯著差異。然而過表達株系種子顯著大于野生型(圖3)。過表達株系種子粒長平均比野生型增加了 0.69 mm，粒寬平均增加了 0.36 mm,千粒重平均增加了 1.05 g (表1)，表中，粒長和粒寬為隨機選擇的30粒種子的平均值，千粒重為10個單株種子的平均值。
[0026]表I野生型中花η和OsABC卜2過表達轉基因株系種子對比。_
【權利要求】
1.一種調控水稻籽粒大小和粒重的方法，其特征在于，包括以下步驟: I) OsABCl-2基因過表達載體的構建 以野生型粳稻品種中花11 cDNA為模板，設計一對引物，擴增基因，引物序列如下:
0sABCl-20E-F:5’ -AAAAGGATCCCGCCCTCGCGATGTCGGCC-3’，
0sABCl-20E-R:5’ -AAAAACTAGTCCGATGGCTATGCTACAACG-3’， 在引物兩端分別引入了限制性內切酶ifeMl I和分e I的識別位點；PCR擴增產物用膠回收試劑盒(TaKaRa，805A)純化，并利用及I和分e I酶切后，連入用相同限制性酶切割的x￡AMBIA1301-UbiN0SmM ;重組質粒采用熱擊轉化法轉化大腸桿菌DH5 α，轉化物在含卡那霉素的LB平板上篩選，挑選陽性克隆，提取質粒后測序驗證正確，獲得OsABCl-2過表達載體；其中，之基因序列如SEQ ID N0.1所示； 2 ) OsABCl-2過表達轉基因植株的獲得 將測序正確的過表達載體通 過電擊法轉入農桿菌菌株EHA105中；將粳稻品種中花11未成熟種子帶殼滅菌，在超凈工作臺上分離出未成熟胚，接種在誘導愈傷培養基上；暗培養6d后挑選生長旺盛，顏色淺黃的胚性愈傷組織，作為轉化的受體；將帶有OsABC1-2過表達重組質粒的農桿菌EHA105菌株培養至對數生長期，離心收集菌體，并用加入乙酰丁香酮的AAM培養基重懸后，倒入愈傷組織進行侵染；侵染結束后的愈傷組織在共培養基上培養3d，然后在含有50 mg I/1潮霉素的選擇培養基上篩選抗性愈傷組織，經兩代篩選以后，將抗性愈傷組織進行預分化處理和分化再生；再生小苗轉入1/2MS培養基上生根壯苗；小苗經練苗處理后移入大田種植。
2.根據權利要求1所述的調控水稻籽粒大小和粒重的方法，其特征在于:所述
基因表達蛋白的氣基酸序列如SEQ ID N0.2所不。
3.根據權利要求1所述的調控水稻籽粒大小和粒重的方法，其特征在于:用于realtime PCR檢測OsABC1-2基因的特異性引物OsABCl_2F和OsABCl_2R，引物序列如下:
OsABCl-2F:5’ -AAGTCAGATGGTGCCAAGAG-3，
OsABCl-2R:5’ -AACAGCATACCGACCTAACC-3’。
【文檔編號】C12N15/29GK103451228SQ201310421680
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月17日 優先權日:2013年9月17日
【發明者】高清松, 楊立明, 劉廷武, 張云峰 申請人:淮陰師范學院