一種測定發酵乳活菌總數的方法
【專利摘要】本發明提供了一種測定發酵乳活菌總數的方法，所述方法是通過向發酵乳樣品中加入預稀釋體積分數為2-6%的2g/L?EDTA溶液，然后稀釋發酵乳樣品并調節pH值為6.8-8.8，進行菌落計數，計算發酵乳樣品活菌總數。本發明能使發酵乳稀釋液在短時間內變澄清，菌體細胞均勻分散，免去測定過程中對樣品稀釋液振蕩20min左右的步驟且測定結果的精密度要高于GB4789.35-2010測定結果的精密度。
【專利說明】一種測定發酵乳活菌總數的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種食品檢測方法，具體地說，涉及一種測定發酵乳活菌總數的方法。【背景技術】
[0002]益生菌具有多種調節生理功能的作用，如促進消化作用，調節胃腸道菌群平衡，糾正腸道的功能紊亂，調節免疫，降低血清膽固醇等。益生菌進入人體并發揮上述功效的主要產品載體是益生菌發酵乳。因此，益生菌發酵乳中的活菌數是保證其功能特性的關鍵因素，要獲得理想的效果，益生菌必需達到足夠多的數量。判斷市售產品以及文獻方法制備的發酵乳產品品質的一項重要指標就是測定其中的活菌總數。
[0003]目前乳酸菌活菌計數的方法主要采用GB4789.35-2010 (國標法)中改良MRS固體培養基平板傾注法。其方法主要適用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的檢驗，步驟主要是將樣品用生理鹽水稀釋成1:10的樣品勻液，而在實驗室進行具體操作步驟中，其制備過程一般需要用手或放于搖床上振蕩20min左右，使樣品中的微生物細胞分散。然后逐級稀釋成一系列的稀釋菌液，選擇2-3個稀釋度采用傾注法進行培養，并對培養基中形成的菌落進行計數(GB4789.35-2010.食品安全國家標準:食品微生物學檢驗[S].北京:中國標準出版社，2010)。
[0004]有文獻采用直接鏡檢計數法來測定活性酸乳中的活菌總數。方法是將樣品適當稀釋后涂片染色，在顯微鏡下計數一定面積內定量樣品中乳酸菌的數量，再根據取樣量和稀釋倍數計算每毫升樣品所含乳酸菌總數。通過與國標檢測方法測得的結果相比較，該方法可快速、準確、直接地計數乳酸菌總數(辛若竹，劉洋來，魏昆民.活性酸乳中乳酸菌的直接鏡檢計數法[J].中國衛生檢驗雜志，2007，17 (3):476-477.)。
[0005]上述方法用于測定發酵乳活菌總數的時候，則存在一定的問題。由于發酵的過程中，產生的乳酸使酪蛋白發生凝集沉淀，采用國標法測定的過程中，使用生理鹽水稀釋發酵乳的時候，很難保證在振蕩的過程中使菌體分散均勻，而且振蕩20min分鐘以后，若不馬上移取稀釋液，則會出現分層的現象。采用直接鏡檢計數法來測定活性酸乳中的活菌總數時同樣難以保證稀釋的發酵乳中菌體的均勻分散性。這不僅給后期取樣的測定帶來一定困難，而且當菌體分散不均勻的時候，將會降低測定結果的準確性。
[0006]有文獻采用平板計數的方法，研究了不同振蕩時間對合生素中芽孢桿菌檢出量的影響，結果表明當振蕩時間為40min后產品中的菌含量基本穩定。采用適當振蕩時間才能更精確的顯示產品中有效菌的含量。因為菌體從載體上解析并均勻分散到溶液中需要一定的時間。振蕩充分才能避免因菌體未完全釋放而引起結果中細菌含量偏低的現象(孫笑非，李超.細菌菌落總數檢測常見誤差原因分析[J].飼料研究，2010 (6):72-73)。
[0007]乙二胺四乙酸(EDTA)是一種能與Mg2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+等二價金屬離子結合的一種螯合劑。有文獻根據發酵乳中酪蛋白酸鈣ca2+在堿性條件下與鹽類絡合而使發醉乳凝膠均勻分散成溶液狀態的原理，將296EDTA液與乳樣以9:1的比例混合后，在堿性條件(pH=ll-12)使乳凝膠均勻分散，并在波長為410mn下進行比色，來測定乳中乳酸菌的生長程度一生物量。經實驗表明:乙二胺四乙酸絡合鈣離子能力強，對溶液的分散程度及菌體細胞的穩定性都優于其它試劑，而且EDTA對細胞的裂解作用極其輕微，可忽略不計(呂力平，董曉波，肖銳.發酵乳品中乳酸菌生物量測定方法的研究[J].肉品衛生，1997 (2):3-7)。
[0008]當環境的pH值超過了乳酸菌保持胞內pH動態平衡的能力時，細胞內的pH值也會隨之變化，因而乳酸菌的生長受到抑制，甚至死亡(熊素玉，姚新奎，譚小海，等不同溫度及PH條件對乳酸菌生長影響的研究[J].新疆農業科學，2006，43 (6):533-538)。本發明通過大量的實驗證明，當周圍的環境PH值大于11時，部分菌體將會死亡，使測定的活菌總數下降。OD值測定的是活菌和死菌的總吸光度，因此文獻采用堿性條件(pH=ll-12)測定OD值，并不適用于活菌總數的測定。
[0009]另外，文獻表明，EDTA對細胞的裂解作用極其輕微，可忽略不計。但是并沒有證明高濃度的EDTA不會破壞細胞的滲透壓平衡而導致細胞的死亡。本發明通過大量的實驗證明，加入體積分數為2-6%的EDTA溶液測定的活菌總數比加入體積分數大于6%的EDTA溶液測定的活菌總數要大。文獻中采用EDTA液與乳樣以9:1的比例測定OD值時，對維持菌體的滲透壓平衡有很大的影響，會造成部分菌體的死亡，并不合適活菌總數的測定。
【發明內容】
[0010]為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的是提供一種測定發酵乳活菌總數的方法。
[0011]為了實現本發明目的，本發明提供了一種測定發酵乳活菌總數的方法，所述方法是通過向發酵乳樣品中加 入預稀釋體積分數為2-6%的2g/L EDTA溶液，然后稀釋發酵乳樣品并調節PH值為6.8-8.8，進行菌落計數，計算發酵乳樣品活菌總數。
[0012]進一步地，所述方法包括如下步驟:
[0013]I)配制 2g/L EDTA 溶液；
[0014]2)向發酵乳樣品中加入預稀釋體積分數為2-6%的2g/L EDTA溶液；
[0015]3)用 IMNaOH 溶液調節 pH 值為 6.8-8.8 ；
[0016]4)將步驟3)得到的發酵乳稀釋液搖勻，待稀釋液中沒有乳濁狀的顆粒后，靜置30s左右，即成KT1稀釋液，整個操作過程不超過2min ;連續制成一系列稀釋度菌液供平板接種用，選擇lO'lO'lO—W個稀釋度采用傾注法在37°C條件下培養48h左右，且每個稀釋度做2個MRS瓊脂平板，最后對培養基中形成的菌落進行計數；
[0017]5)根據計數結果計算發酵乳活菌總數。
[0018]優選地，向發酵乳樣品中加入預稀釋體積分數為2-3%的2g/LEDTA溶液。
[0019]優選地，稀釋發酵乳樣品并調節pH值為7-8。
[0020]優選地，所述EDTA溶液的pH值為11.8-13.2。
[0021]優選地，發酵乳樣品被稀釋10倍。
[0022]更為具體地，所述方法包括如下步驟:
[0023]I)配置固液比為2g/L的EDTA溶液:準確稱取2g左右的EDTA (分析純，國藥集團化學試劑有限公司生產，10009617,乙二胺四乙酸)，為使EDTA充分溶解，加入60_70mL左右的Imol/LNaOH溶液以及蒸餾水，使液體加入量為1L，得到pH值為11.8-13.2的EDTA溶液。[0024]2)將上述EDTA溶液，試驗過程中用到的試劑(生理鹽水、NaOH溶液等)以及玻璃器皿在121 °C的條件下滅菌15min。
[0025]3)在超凈工作臺上，于干凈的錐形瓶中加入2-6%(總體積為250mL)上述滅菌EDTA溶液，以及25mL待測發酵乳，迅速加入滅菌的生理鹽水至總體積為245mL，得到發酵乳稀釋液。用lmol/L滅菌的NaOH溶液調節發酵乳稀釋液pH值在6.8-8.8。最后加入生理鹽水使發酵乳稀釋液的總體積為250mL，測定溶液最終pH值。
[0026]4)將步驟3)得到的最終pH值為6.79-8.79的發酵乳稀釋液迅速搖勻，待稀釋液中沒有乳濁狀的顆粒后，靜置30s左右，即成KT1稀釋液，整個操作過程不超過2min。再用ImL無菌吸管吸取KT1稀釋液ImL移入9mL無菌生理鹽水中，吹吸或振蕩數次，即成10_2稀釋液，按此方法，連續制成一系列稀釋度菌液供平板接種用。選擇lO'lO'lO—W個稀釋度采用傾注法在37 °C條件下培養48h左右，且每個稀釋度做2個MRS瓊脂平板，最后對培養基中形成的菌落進行計數。
[0027]5)計算待測發酵乳活菌總數。
[0028]必要情況下，參照GB4789.35-2010所述方法進行乳酸菌菌種鑒定。
[0029]選取菌落數在30CFU-300CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計數菌落總數。每個稀釋度的菌落數采用兩個平板的平均數。若只有一個稀釋度平板上的菌落數在30CFU-300CFU之間，則樣品中活菌總數的計數按公式(I)計算:
【權利要求】
1.一種測定發酵乳活菌總數的方法，其特征在于，所述方法是通過向發酵乳樣品中加入預稀釋體積分數為2-6%的2g/L EDTA溶液，然后稀釋發酵乳樣品并調節pH值為6.8-8.8，進行菌落計數，計算發酵乳樣品活菌總數。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: 1)配制2g/LEDTA溶液； 2)向發酵乳樣品中加入預稀釋體積分數為2-6%的2g/LEDTA溶液； 3)用IMNaOH溶液調節pH值為6.8-8.8 ； 4)將步驟3)得到的發酵乳稀釋液搖勻，待稀釋液中沒有乳濁狀的顆粒后，靜置30s，即成10—1稀釋液，整個操作過程不超過2min ;連續制成一系列稀釋度菌液供平板接種用，選擇10' 10_9、10,3個稀釋度采用傾注法在37°C條件下培養48h，且每個稀釋度做2個MRS瓊脂平板，最后對培養基中形成的菌落進行計數； 5)根據計數結果計算發酵乳活菌總數。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，向發酵乳樣品中加入預稀釋體積分數為 2-3% 的 2g/L EDTA 溶液。
4.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，稀釋發酵乳樣品并調節pH值為7-8。
5.根據權利要 求1或2所述的方法，其特征在于，所述EDTA溶液的pH值為11.8-13.2。
6.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，發酵乳樣品被稀釋10倍。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述發酵乳活菌包括嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、雙歧桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌。
【文檔編號】C12Q1/06GK103451264SQ201310415852
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月13日 優先權日:2013年9月13日
【發明者】劉成國, 易文芝, 周輝 申請人:湖南農業大學