一種沉默人c2orf68基因的shRNA及其醫(yī)藥用途

一種沉默人c2orf68基因的shRNA及其醫(yī)藥用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種抑制c2orf68基因表達(dá)的shRNA及其在醫(yī)藥方面的應(yīng)用，本發(fā)明提供的shRNA片段特異性干擾c2orf68基因，如序列表中SEQIDNO.1所示，靶序列為c2orf68的第460~478位，其脫氧核酸見序列表中的SEQIDNO.3，針對靶序列設(shè)計(jì)的shRNA的核苷酸為序列表中SEQIDNO.2。本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證明，利用shRNA轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌細(xì)胞，細(xì)胞中c2orf68的mRNA轉(zhuǎn)錄水平降低，同時，干擾c2orf68后抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡。因此，針對c2orf68的shRNA可應(yīng)用于制備抑制結(jié)腸癌生長的藥物，為治療結(jié)直腸癌新藥的開發(fā)提供新的途徑。
【專利說明】—種沉默人c2orf68基因的shRNA及其醫(yī)藥用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體為一種能降低你基因表達(dá)的shRNA序列；以及利用該shRNA序列對c2orf68基因特異性干擾后抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和凋亡。
【背景技術(shù)】
[0002]結(jié)直腸癌是人類較為常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生、發(fā)展是一個多基因改變，多階段致癌的復(fù)雜過程，包括癌基因的激活、抑癌基因的失活或缺失、錯配修復(fù)基因的突變等。最近幾年調(diào)查顯示，結(jié)直腸癌的發(fā)病居消化道惡性腫瘤的第二位，在我國發(fā)病率較高，而且呈現(xiàn)逐年增高的趨勢。因此，研究結(jié)直腸癌發(fā)病相關(guān)的基因，可以為結(jié)直腸癌的分子診斷、治療及預(yù)后提供潛在有效靶標(biāo)。
[0003]RNA 干擾(RNA interference, RNAi)是指雙鏈 RNA (double-strand RNA, dsRNA)在細(xì)胞內(nèi)特異性地誘導(dǎo)與之同源互補(bǔ)的mRNA的降解，使相應(yīng)的基因的表達(dá)關(guān)閉，從而引發(fā)基因轉(zhuǎn)錄后水平的沉默現(xiàn)象。RNAi技術(shù)具有高度的特異性、沉默效率高、轉(zhuǎn)化效率高等優(yōu)點(diǎn)，該技術(shù)廣泛應(yīng)用于功能基因組的研究領(lǐng)域。利用短發(fā)卡shRNA來抑制特定基因的表達(dá)，由此可以用于制備治療結(jié)直腸癌的藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種新型的短發(fā)夾shRNA，并證明所述shRNA片段可在制備治療結(jié)直腸癌的藥物中應(yīng)用。
[0005]人cJor/你基因已在GenBank注冊，注冊號ΝΜ_001013649.3，定位于2ρ11.2，全長4283bp，編碼166個氨基酸，其核苷酸序列為序列表中SEQ ID N0:1所述。人你基因的組織表達(dá)譜分析顯示:該基因在結(jié)直腸癌等胃腸腫瘤中均有表達(dá)。
[0006]本發(fā)明所述在人結(jié)直腸癌細(xì)胞中特異表達(dá)的RNA干擾靶點(diǎn)來源于序列表中SEQ IDNO: I所述的人你基因，是SEQ ID NO:1中第460位至478位核苷酸序列組成的基因片段，其核苷酸序列見序列表中SEQ ID N0:3。
[0007]本發(fā)明所述在人結(jié)直腸癌細(xì)胞中特異表達(dá)的RNA干擾靶點(diǎn)的短發(fā)夾shRNA由人工設(shè)計(jì)合成，其核苷酸序列為序列表中SEQ ID N0:2所述。
[0008]實(shí)驗(yàn)表明，將所述shRNA轉(zhuǎn)染入人直腸癌細(xì)胞，shRNA片段作用于人c2orf68基因中的RNA干擾靶點(diǎn)可導(dǎo)致結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡并抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，因此，本發(fā)明所述短發(fā)夾shRNA在制備治療結(jié)直腸癌的藥物中的應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1為熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中人基因引物的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0010]圖2為熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中人內(nèi)參狗(670?基因引物的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0011]圖3為轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480_siRNA(轉(zhuǎn)染干擾shRNA片段的人結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480)、SW480_ng (轉(zhuǎn)染陰性shRNA片段的人結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480)、空白對照組SW480(未轉(zhuǎn)染shRNA片段的人結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480)的c2orf68基因表達(dá)的柱狀圖。
[0012]圖4為轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW620_si(轉(zhuǎn)染干擾shRNA片段的人結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW620)、SW620_ng (轉(zhuǎn)染陰性shRNA片段的人結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW620)、空白對照組SW620(未轉(zhuǎn)染shRNA片段的人結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW620)的c2orf68基因表達(dá)的柱狀圖。
[0013]圖5為轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌細(xì)胞株LS174T_siKNA (轉(zhuǎn)染干擾shRNA片段的人結(jié)直腸癌細(xì)胞株LS174T)、LS174rNC (轉(zhuǎn)染陰性shRNA片段的人結(jié)直腸癌細(xì)胞株LS174T)、空白對照組LS174T (未轉(zhuǎn)染shRNA片段的人結(jié)直腸癌細(xì)胞株LS174T)的基因表達(dá)的柱狀圖。
[0014]圖6為流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌細(xì)胞株LS174T_siKNA (轉(zhuǎn)染干擾shRNA片段的人結(jié)直腸癌細(xì)胞株LS174T)、LS174rNC (轉(zhuǎn)染陰性shRNA片段的人結(jié)直腸癌細(xì)胞株LS174T)、空白對照組LS174T (未轉(zhuǎn)染shRNA片段的人結(jié)直腸癌細(xì)胞株LS174T)的c2orf68凋亡圖。
[0015]圖7為流式細(xì)胞儀檢測LS174rsiKNA、LS174rNG、LS174T凋亡率柱狀圖。
[0016]圖8為MTT實(shí)驗(yàn)LS174rsiKNA、LS174rNC、LS174T三株細(xì)胞的生長曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017]下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。下述實(shí)施例中，凡未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的，均為按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)條件、實(shí)驗(yàn)室手冊(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press, 1989)中的條件、按照制造廠商所建議的條件。
[0018]實(shí)施例1:針對c2orf68基因shRNA的設(shè)計(jì)與合成:根據(jù)c2orf68基因全長mRNA序列，經(jīng)分析設(shè)計(jì)，我們以c2orf68基因全長mRNA序列(GeneBank AccessionNumber:NM_001013649.3)第460~478位為靶位點(diǎn)，該片段有19個核苷酸，即序列表中的SEQID N0.3ο根據(jù)shRNA引物設(shè)計(jì)原則,應(yīng)用siRNA在線設(shè)計(jì)軟件(http://www.anbion.com)設(shè)計(jì)特異性shRNA序列，其核苷酸序列見序列表SEQ ID N0.2，該合適的目標(biāo)序列進(jìn)行化學(xué)合成，委托廣州銳博生物科技有限公司合成shRNA序列。
[0019]實(shí)施例2: shRNA的干擾效率實(shí)驗(yàn)
1、細(xì)胞培養(yǎng)
用胎牛血清的體積比為10%的DMEM高糖培養(yǎng)基(從HyClone公司購買)于37°C、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人結(jié)直腸癌SW480、SW620、LS174T細(xì)胞株(SW480、SW620、LS174T從美國ATCC公司購買)至鋪滿培養(yǎng)瓶。
[0020]2、shRNA 轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌 SW480、SW620 和 LS174T 細(xì)胞
2.1分別取培養(yǎng)瓶中1/6人結(jié)直腸癌SW480、SW620和LS174T細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板的每一孔中；
2.224h后細(xì)胞培養(yǎng)板覆蓋率約達(dá)70%~80%，丟棄原培養(yǎng)基。將6孔板中的細(xì)胞用2mlDMEM高糖培養(yǎng)基(無血清，無抗生素)培養(yǎng)4h ；
2.3A液配置:5 μ I (20 μ mol/L)shRNA+250ul DMEM培養(yǎng)基(無血清，無抗生素)，混合均勻；
B 液配置:Lipofectamine 2000 (invitrogen 公司)+250ul DMEM 培養(yǎng)基(無血清，無抗生素)，混合均勻；室溫靜置5min ；
C液配置:A液+B液，混合均 勻，室溫靜置25min ；2.4丟棄細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)原有的培養(yǎng)基，每孔各加入新鮮的1.5ml DMEM高糖培養(yǎng)基(無血清，無抗生素)；
2.5將C液逐滴逐滴的加入到培養(yǎng)板中，每孔各500 μ I ;
2.6將轉(zhuǎn)染shRNA的SW480、SW620、LS174T細(xì)胞放入37°C、5% C02細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育；實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個組，分別為實(shí)驗(yàn)組、空白對照組、陰性對照組；
2.7 6h后，棄細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)原有的培養(yǎng)基，每孔各加入2ml含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基；放入37°C、5% C02細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育。
[0021]3、總RNA的提取
3.1取轉(zhuǎn)染shRNA片段48h后的結(jié)直腸癌SW480、SW620、LS174T細(xì)胞，加入TRIzol試劑 (invitrogen公司)lml，然后轉(zhuǎn)移至Ij 1.5ml的Eppendorf管中，室溫靜置5min ；
3.2加入0.2ml的氯仿，蓋緊蓋子，搖勻15秒左右，室溫靜置2_3min，4°C離心機(jī)中離心(12000r/min,15min)；
3.3將上清轉(zhuǎn)移至新管(1.5ml的Eppendorf管)中，加入0.5ml的異丙醇,充分混勻，室溫靜置lOmin，4°C離心機(jī)中離心(12000g/min，15min)，棄上清，在管底部可見乳白色小沉淀物，即為RNA ；
3.4加入Iml質(zhì)量濃度75%的乙醇，混合震蕩，4°C離心機(jī)中離心(7500g/min) 5min，棄上清，通風(fēng)，室溫中干燥5min，讓乙醇揮發(fā)；然后加入50 μ I質(zhì)量濃度0.1%的DEPC處理水溶解RNA ；
3.5凝膠電泳和分光光度計(jì)檢測濃度和純度，保證每個樣本的0D260/0D280的值在
1.8~2.0之間，并通過瓊脂糖電泳檢測每個樣本的28S及18S條帶的灰度值來進(jìn)一步嚴(yán)格控制RNA質(zhì)量，并且每個樣本的RNA均使用DNA酶進(jìn)行處理以去除基因組污染。
[0022]4、cDNA第一鏈的合成
取總RNA樣品I μ g，Oligo dT 1μ I入PCR反應(yīng)管，再加質(zhì)量濃度0.1%的DEPC處理水至總體積12 μ 1,65°C,反應(yīng)5分鐘，反應(yīng)結(jié)束后取出置于冰上孵育2min，再加入緩沖液(Buffer ) 4 μ 1，RNA抑制劑I μ 1，，濃度10mmol/L的dNTP 2 μ 1，逆轉(zhuǎn)錄酶I μ I至總體積達(dá)到20 μ I，將混合液置于37°C反應(yīng)60分鐘，再于70°C反應(yīng)5分鐘，之后冰上冷卻終止反應(yīng)，-20°C保存。
[0023]5、熒光定量PCR實(shí)驗(yàn) 5.1熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)
根據(jù)人(價激？cifer/你基因全長cDNA的開放讀碼框(Open Reading Frame,
0RF)序列，設(shè)計(jì)熒光定量PCR所需引物。所用軟件為Primer Premier 5.0&01ig6。保證PCR產(chǎn)物長度在IOObp-250bp。引物設(shè)計(jì)好后，進(jìn)一步在NCBI上通過BLAST比對驗(yàn)證引物的特異性是否良好。采用人sapiens)gapdh (脫氧核苷酸序列見NCBI數(shù)據(jù)庫)作為內(nèi)參，引物序列見下表。
[0024]表1定量PCR引物5.2熒光定量PCR擴(kuò)增
采用SYBR GREEN染料法來進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，并根據(jù)熒光定量PCR試劑盒操作說明書(TakaRa company)控制實(shí)驗(yàn)規(guī)范性。依次取2 μ I的步驟4合成的cDNA模板、25 μ I的SYBR MIX (定量PCR試劑盒)、21μ I的去核酸水、I μ I的上游引物、I μ I的下游引物，反應(yīng)總體積50 μ 1，然后放入印pendorf熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，和參gapdh擴(kuò)增斜率為-3.329，Y軸截距為25.38，擴(kuò)增效率為1.00，相關(guān)系數(shù)為0.999。目的基因c2orf68擴(kuò)增斜率為-3.397，Y軸截距為26.17，擴(kuò)增效率為0.97，相關(guān)系數(shù)為0.999。分別檢測實(shí)驗(yàn)組、空白對照組、陰性對照組c2orf68基因的mRNA的表達(dá)水平。[0025]反應(yīng)完畢后對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，c2orf68的基因引物標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見圖1, gapah基因引物標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見圖2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞RNA干擾后，c2orf68基因表達(dá)水平比空白對照組下降50.95%(見圖3);結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞RNA干擾后你基因表達(dá)水平比空白對照組下降59.31% (見圖4);結(jié)直腸癌LS174T細(xì)胞RNA干擾后c2orf68基因表達(dá)水平比空白對照組下降49.85% (見圖5)。
[0026]實(shí)施例3:shRNA對人結(jié)直腸癌細(xì)胞株LS174T凋亡的影響
采用流式細(xì)胞術(shù)來檢測LS174T細(xì)胞的凋亡情況。將處于生長指數(shù)期的LS174T細(xì)胞株，于6孔板中培養(yǎng)，24 h后細(xì)胞培養(yǎng)板覆蓋率約達(dá)70%~80%，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，步驟同實(shí)施例2中的步驟I。每種細(xì)胞株分別設(shè)置三個組:實(shí)驗(yàn)組〔用脂質(zhì)體Lipofectamine2000 (invitrogen公司)轉(zhuǎn)染shRNA〕、陰性對照組〔用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染negative control-shRNA〕、空白對照組(轉(zhuǎn)染時只加脂質(zhì)體Lipofectamine 2000)。轉(zhuǎn)染24h后，收集細(xì)胞，在離心機(jī)上以2000r/min離心5分鐘，棄培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度為3 X IO5個/管。PBS洗滌細(xì)胞兩次，用400μ I結(jié)合緩沖液(凱基生物)重懸細(xì)胞，加入5μ I AnnexinV-FITC (凱基生物)，混勻，室溫反應(yīng)10 min，然后加入5μ1 Propidium iodide (PI)(凱基生物)，4°C避光孵育30min。用流式細(xì)胞儀(BD FACSAria II Cell Sorter，美國)檢測分析，每個樣本收集10000個熒光信號。檢測結(jié)果見圖6，轉(zhuǎn)染shRNA片段的人結(jié)直腸癌細(xì)胞株LS174rsifflA,陰性對照細(xì)胞株LS174T_ng，未轉(zhuǎn)染shRNA片段的人結(jié)直腸癌細(xì)胞株LS174T的細(xì)胞凋亡率分別為18.13%, 12.17%, 11.83%，通過T檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的凋亡率顯著高于陰性對照組及空白對照組(P=0.037，P=0.044)，而陰性對照組與空白對照組的凋亡率無明顯差異(P=0.507)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抑制基因的表達(dá)能夠明顯促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞LS174T的凋亡。
[0027]實(shí)施例4:shRNA對結(jié)直腸癌細(xì)胞株LS174T增殖情況的影響
采用MTT實(shí)驗(yàn)來檢測結(jié)直腸癌細(xì)胞LS174T的增殖情況。將處于生長指數(shù)期的LS174T細(xì)胞株，在96孔板中培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞濃度為IXlO4個/孔，24 h后細(xì)胞培養(yǎng)板覆蓋率約達(dá)70%~80%，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，步驟同實(shí)施例2中的步驟I。每種細(xì)胞株分別設(shè)置三個組:實(shí)驗(yàn)組〔用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 (invitrogen公司)轉(zhuǎn)染shRNA〕、陰性對照組〔用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染negative control-shRNA〕、空白對照組(轉(zhuǎn)染時只加脂質(zhì)體Lipofectamine 2000),每組設(shè)6個孔。分別于轉(zhuǎn)染后6h, 12h, 24h, 36h, 48h在每個反應(yīng)孔加入15ulMTT (5mg/ml,用PBS配制，過濾除菌)，繼續(xù)孵育4h。吸棄原液，加入150ulDMS0。37°C孵育15min后用酶標(biāo)儀檢測各孔490 nm波長處的吸光值(0D)，用各組吸光值的均值表示細(xì)胞的增殖情況。檢測結(jié)果見圖8。[0028]MTT實(shí)驗(yàn)顯示:干擾24小時以后，與空白對照組及陰性對照組相比，實(shí)驗(yàn)組LS174T細(xì)胞株出現(xiàn)明顯的增殖抑制，在LS174T中抑制率為21.2%(P=0.002)，說明抑制c2orf68基因的表達(dá)能夠明顯抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞LS174T的增殖。
【權(quán)利要求】
1.一種抑制人結(jié)直腸癌基因表達(dá)的ShRNA，其特征在于，其結(jié)直腸癌靶序列脫氧核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，位于c2orf68基因第460~478位。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性shRNA，其特征在于，由人工合成的短發(fā)卡shRNA核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示的siRNA核苷酸序列。
3.一種如權(quán)利要求1所述的針對基因設(shè)計(jì)特異性shRNA，其特征在于能夠抑結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和促進(jìn)凋亡。
4.通過實(shí)時熒光定量PCR分析結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞RNA干擾后，c2orf68基因抑制率為50.01% (見圖3);結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞RNA干擾后cJor/你基因抑制率為`49.69% (見圖4);結(jié)直腸癌LS174T細(xì)胞RNA干擾后你基因抑制率為50.15% (見圖`5);采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)直腸癌LS174T細(xì)胞增殖情況，LS174T_siENA細(xì)胞的增殖受到明顯的抑制作用；采用流式細(xì)胞術(shù)測結(jié)直腸癌LS174T細(xì)胞凋亡情況，LS174T_siKNA細(xì)胞凋亡率明顯高于LS174T細(xì)胞，上述的針對你基因設(shè)計(jì)特異性shRNA可用于制備新的抗腫瘤基因藥物和抗腫瘤生物制劑。`
【文檔編號】C12N15/113GK103484463SQ201310412332
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月12日
【發(fā)明者】陳堯, 蔣婷婷 申請人:四川大學(xué)