一種紙制品細菌菌落檢測方法
【專利摘要】本發明提供一種紙制品細菌菌落檢測方法，包括以下步驟：1）制備TGEA培養基或者LB培養基；2）滅菌；3）制備紙漿懸浮液；4）接種培養；5）CO2生成量的檢測并計算細菌菌落數量。本發明嚴格限定了培養基的種類和紙漿懸浮液的濃度，加速了CO2的生成速度和生成量，從而減少了檢測紙制品中細菌菌落數量所用的時間，提高了檢測效率。
【專利說明】一種紙制品細菌菌落檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種紙制品細菌檢測方法，尤其涉及一種用于衛生紙的細菌檢測方 法。
【背景技術】
[0002] 在紙產品生產過程中，生產原料、工具設備、工藝流程、操作者的衛生狀況以及生 產的消毒狀況等很多方面都會造成衛生紙的細菌污染。受污染的衛生紙會給人體健康帶來 極大的安全隱患，所以對衛生紙中的細菌含量必須進行嚴格地控制。快速、準確、高效地檢 測衛生紙中的細菌含量，對及時了解并保證產品使用的安全性具有重要的指導意義。
[0003] 目前，在用于檢測紙與紙板細菌含量的方法中，均采用經典的平板菌落計數法。但 是由于該法在培養菌落的過程中，可受到如操作不熟練、培養基溫度過高損傷細胞及環境 衛生條件不嚴格等的影響而引起污染，因此其測定結果誤差很大。另外，由于細菌在適宜的 固體培養基中形成菌落通常需要較長的時間(如24小時)才能在平板上進行計數，因此大大 影響了樣品中細菌含量的檢測效率。
[0004] 目前，國家衛生機構已將大腸菌群作為評價生活用紙衛生質量的重要指標之一。 在衛生紙以及衛生紙原紙的國家標準及一次性使用衛生用品衛生標準中，大腸菌群檢測指 標均為不應檢出（即：檢出為不合格)。隨著人們生活質量的提高，生活用紙的需求量也越來 越大。因此，大腸菌群快速準確的檢測，對監測生活用紙產品質量進而保障消費者的生命健 康，具有重要的現實意義。
[0005] 早在1997年，Gardinia等人提出了采用頂空氣相色譜研究細菌生長規律的方法， 它通過檢測微生物代謝過程中二氧化碳（CO2)的釋放量來實現對微生物細胞活性和繁殖能 力的監測。由于氣相色譜的熱導檢測器對CO 2較靈敏、方便，因此可以大大提高檢測的效率。 2008年，柴欣生等人采用一種多次頂空抽提氣相色譜技術，實現了對細菌生長規律的自動 化原位檢測，從而克服了取樣的不確定性并使樣品檢測的準確性顯著提高。然而，關于采用 頂空氣相色譜技術替代傳統的檢測批量產品細菌數量指標及大腸菌群指標的方法的研究 還未見報道。
【發明內容】
[0006] 本發明要解決的技術問題是根據上述現有技術之不足，提供一種精確度高而又快 捷的檢測方法。
[0007] 為了解決上述技術問題本發明采取如下技術方案： 一種紙制品細菌菌落檢測方法，包括以下步驟： 1) 制備TGEA培養基或者LB培養基； 2) 將培養基、頂空瓶(包括墊片與鋁蓋)、壓蓋器、剪刀等器材置于高壓蒸汽滅菌鍋中滅 菌，當溫度降至l〇〇°C以下時，將其取出放于無菌室冷卻。
[0008] 3)在無菌操作條件下，稱取一定量紙樣，剪成碎片，加入裝有滅菌培養基的打散 杯中打散，或者加入裝有滅菌培養基和玻璃珠的錐形瓶中，充分搖勻，制成濃度為0. 5? 5g/100ml的紙漿懸浮液； 4) 用移液槍移取IOmL的紙漿懸浮液置于頂空瓶中并壓蓋密封，將頂空瓶放于培養箱 培養8小時后迅速用注射器向頂空瓶中注入ImL濃度為2mol/L的硫酸； 5) 將培養后的頂空瓶置于頂空氣相色譜儀器檢測CO2含量，記錄下檢測器測得的CO2氣 相色譜峰的面積并計算出細菌菌落總數。
[0009] 使用上述方法只需8小時即可檢測出細菌菌落數量，較現有技術中的24小時，大 大縮短了檢測時間，另外，本發明加入硫酸，也進一步加快了二氧化碳的釋放，避免對二氧 化碳的吸收，提1? 了檢測精度。
[0010] 所述TGEA培養基制備方法為：準確稱取牛肉浸膏3 g、胰蛋白胨5 g、D-葡萄糖1 g、吐溫-80 0.02mL溶于IL蒸餾水中，混合均勻，用lmol/L的NaOH中和至pH為7.0±0.2 ; 所述LB培養基的制備方法為：準確稱取酵母浸膏2.5 g、胰蛋白胨5 g、D-葡萄糖I g、吐 溫-80 0. 02mL溶于IL的蒸餾水中，混合均勻，用lmol/L的NaOH中和至pH為7. 0±0. 2。 本申請選用特定培養基，加速了 CO2的生產兩，縮短了檢測時間，提高了檢測精度。
[0011] 本方法步驟2)所述高壓蒸汽滅菌溫度為121°C，滅菌時間為20min。
[0012] 進一步的，本方法步驟3)中，稱取I. 5g紙樣，剪成IcmX2cm的碎片并加入裝有 300mL滅菌培養基的打散杯中打散lmin，制成質量濃度為0. 5g/100ml的紙漿懸浮液；或者 稱取15g紙樣，剪成IOmmX IOmm的碎片并加入裝有300mL滅菌培養基和玻璃珠的錐形瓶 中，充分搖勻，制成質量濃度為5g/100ml的紙漿懸浮液。
[0013] 進一步的，步驟4)中的紙漿懸浮液在培養箱培養后，如不能立即去頂空氣相色譜 儀檢測CO 2含量，需要將頂空瓶放入-4°C的冰箱中冷凍，檢測前再解凍。
[0014] 更進一步的，步驟5)所述頂空氣相色譜檢測條件為：平衡溫度60°C，平衡時間 20min，色譜柱溫度45°C，檢測時間3min。
[0015] 本發明嚴格限定了培養基的種類和紙漿懸浮液的濃度，加速了 CO2的生成速度和 生成量，從而減少了檢測紙制品中細菌菌落數量所用的時間，提高了檢測效率。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016] 圖1是不同濃度紙漿懸浮液與C02生成量和生產時間曲線圖； 圖2是不同濃度紙漿懸浮液與C02生成量的關系曲線圖； 圖3是紙漿懸浮液的纖維分散效果圖：其中，（a)為通過加玻璃珠搖勻下的纖維分散效 果圖；（b)為通過打散杯打散下的纖維分散效果圖； 圖4是紙漿懸浮液制備方式對檢測結果的影響效果圖。
【具體實施方式】
[0017] 下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。
[0018] 實施例1 本實施例以衛生紙為例，按如下步驟對衛生紙中細菌菌落總數進行檢測： 1)制備TGEA培養基 準確稱取牛肉浸膏3 g、胰蛋白胨5 g、D-葡萄糖I g、吐溫-80 0.02mL溶于IL的蒸餾 水中，混合均勻，用lmol/L的NaOH中和至pH為7. O±0. 2,分裝待用。
[0019] 2)滅菌 將培養基、以及本方法所涉及的頂空瓶(包括墊片與鋁蓋)、壓蓋器、剪刀等器材置于高 壓蒸汽滅菌鍋中在121°C條件下滅菌20min，當溫度降至KKTC以下時，將其取出放于無菌 室冷卻。
[0020] 3)紙漿懸浮液的制備 在無菌操作條件下，在超凈工作臺上稱量被測紙樣I. 5g，剪成IcmX2cm的碎片并加入 裝有300mL滅菌培養基的打散杯中打散lmin，制成質量濃度為0. 5%的紙漿懸浮液。
[0021] 4)接種培養 用移液槍移取IOmL的紙漿懸浮液置于頂空瓶中壓蓋密封，將頂空瓶放于培養箱培養8 小時后立即用注射器向頂空瓶中注入ImL濃度為2mol/L的硫酸。
[0022] 5) CO2生成量的檢測 將培養后的頂空瓶置于頂空氣相色譜儀器檢測CO2含量，記錄下檢測器測得的CO2氣相 色譜峰的面積。
[0023] 頂空氣相色譜主要檢測條件如下：平衡溫度60°C，平衡時間20min，色譜柱溫度 45°C，檢測時間3min。
[0024] 如步驟4)中經過培養箱培養后的紙漿懸浮液不能立即去頂空氣相色譜儀檢測CO2 含量，則需要將頂空瓶放入-4°C的冰箱中冷凍，檢測前再解凍。
[0025] 6)細菌菌落總數的計算 由于C02的釋放量與頂空氣相色譜信號峰面積之間的關系為線性關系，因此，衛生紙 中細菌菌落總數按照以下公式進行計算：
【權利要求】
1. 一種紙制品細菌菌落檢測方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 制備TGEA培養基或者LB培養基； 2) 將培養基、頂空瓶(包括墊片與鋁蓋)、壓蓋器、剪刀等器材置于高壓蒸汽滅菌鍋中滅 菌，當溫度降至l〇〇°C以下時，將其取出放于無菌室冷卻； 3) 在無菌操作條件下，稱取一定量紙樣，剪成碎片，加入裝有滅菌培養基的打散杯中打 散，或者加入裝有滅菌培養基和玻璃珠的錐形瓶中，充分搖勻，制成濃度為〇. 5?5g/100ml 的紙漿懸浮液； 4) 用移液槍移取10mL的紙漿懸浮液置于頂空瓶中并壓蓋密封，將頂空瓶放于培養箱 培養8小時后迅速用注射器向頂空瓶中注入lmL濃度為2mol/L的硫酸； 5) 將培養后的頂空瓶置于頂空氣相色譜儀器檢測C02含量，記錄下檢測器測得的C02氣 相色譜峰的面積，并計算出細菌菌落總數。
2. 根據權利要求1所述紙制品細菌菌落檢測方法，其特征在于，所述TGEA培養基制備 方法為：準確稱取牛肉浸膏3 g、胰蛋白胨5 g、D-葡萄糖1 g、吐溫-80 0.02mL溶于1L蒸 餾水中，混合均勻，用lmol/L的NaOH中和至pH為7. 0±0. 2 ; 所述LB培養基的制備方法為：準確稱取酵母浸膏2.5 g、胰蛋白胨5 g、D-葡萄糖1 g、 吐溫-80 0. 02mL溶于1L的蒸餾水中，混合均勻，用lmol/L的NaOH中和至pH為7. 0 ±0. 2。
3. 根據權利要求1所述紙制品細菌菌落檢測方法，其特征在于，步驟2)所述高壓蒸汽 滅菌溫度為121°C，滅菌時間為20min。
4. 根據權利要求1所述紙制品細菌菌落檢測方法，其特征在于，步驟3)中，稱取1. 5g 紙樣，剪成lcmX2cm的碎片并加入裝有300mL滅菌培養基的打散杯中打散lmin，制成 0. 5g/100ml的紙漿懸浮液；或者 稱取15g紙樣，剪成10mmX 10mm的碎片并加入裝有300mL滅菌培養基和玻璃珠的錐形 瓶中，充分搖勻，制成5g/100ml的紙楽懸浮液。
5. 根據權利要求1所述紙制品細菌菌落檢測方法，其特征在于，步驟4)中的紙漿懸浮 液在培養箱培養后，如不能立即去頂空氣相色譜儀檢測C02含量，需要將頂空瓶放入-4°C的 冰箱中冷凍，檢測前再解凍。
6. 根據權利要求1所述紙制品細菌檢測方法，其特征在于，步驟5)所述頂空氣相色譜 檢測條件為：平衡溫度60°C，平衡時間20min，色譜柱溫度45°C，檢測時間3min。
【文檔編號】C12Q1/06GK104419745SQ201310411622
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月11日 優先權日:2013年9月11日
【發明者】柴欣生, 陳春霞, 彭云云, 陳潤權, 王玉峰 申請人:廣東省東莞市質量監督檢測中心