一種提高植物對多環芳烴的耐受性和降解能力的方法
【專利摘要】本發明公開了一種提高植物對多環芳烴的耐受性和降解能力的方法，具體過程是：利用改造的P450單加氧酶基因和合成的楊樹UDP-葡萄糖苷糖基轉移酶（UGT）基因來構建二價基因植物表達載體，然后將二價基因表達載體通過農桿菌介導轉化到植物中。利用本發明，使獲得的轉基因植物對多環芳烴的耐受性和降解能力提高，種植這種轉基因植物有利于修復被多環芳烴污染的土壤環境。
【專利說明】一種提高植物對多環芳烴的耐受性和降解能力的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于環境科學領域，具體涉及一種提高植物對多環芳烴的耐受性和降解能力的方法。
【背景技術】
[0002]多環芳烴(PAHs)大多是石油、煤等化石燃料以及木材、天然氣、汽油、重油、有機高分子化合物、紙張、作物秸桿和煙草等含碳氫化合物的物質經不完全燃燒或在還原性氣氛中經熱分解而生成的。高分子量PAHs在環境中比較穩定，能以其為唯一碳源和能源進行代謝的降解菌的研究報道甚少。大多數微生物對四環及以上多環芳烴的礦化作用一般是以共代謝方式開始的。共代謝過程中微生物優先利用一種較易攝取的基質獲取能量，進而完成另一種基質的代謝，只有在初級碳源和能源存在的條件下，微生物才能進行有機物降解。Mahaffey等的實驗表明，在有聯苯、水楊酸作為共代謝底物時，拜葉林克氏菌(Bei jerinckia,現在歸屬鞘氨醇單孢菌Sphingomonas yanoikuyae)可以分解原本不被其作為碳源和能源的苯并蒽。共代謝作用可以提高微生物降解多環芳烴的效率，增大微生物對碳源和能源的利用范圍(Mahaffey 等 Applied and Environmental Microbiology1988，54,2415-2423)。
[0003]細胞色素P450是一類以血紅素為輔基的B族細胞色素超家族蛋白酶。P450是一種末端加氧酶，從NAD (P) H獲得電子后，催化單加氧反應。P450能夠在生物體內催化多種內源性物質的生物合成，還參與許多外源性難降解有機物的生物氧化和降解。
[0004]P450在原核和真核生物中廣泛存在。真核生物中的P450為膜結合狀態，原核生物中的P450為游離狀態，為一種可溶性蛋白。不同物種間P450具有同源性。如不同P450形成螺旋傾向的位置十分匹配，疏水性狀也極為相似，對P450編碼蛋白的分子結構的對比分析發現，在C末端的血紅素結合區，存在高度保守的FXXGXXXCXG結構，螺旋K區存在保守的EXXR結構，螺旋I區有一高度保守的蘇氨酸。根據氨基酸序列相似性，P450蛋白質分類并命名為家族(CYP1，2...)、亞家族(A,B^…入單個基因(Al，2...)，它們的氨基酸序列同源性分別為:>40%、>55%、>97%。截至2005年I月，已發現并命名4504條來自動物(1581條)、植物(1740條)和微生物(1180條)的P450基因序列。
[0005]Poulos 等首次報導了 P450CAM 的 X-晶體衍射結構(Journal of MolecularBiology 1987,195,687-700)。該分子為三角形，其中血紅素平面與三角平面近似平行，血紅素輔基深埋于疏水腔內，晶體結構顯示Cys-357是血紅素中Fe (III)的結合部位。氨基酸序列對比顯示P450分子中有兩段相似的核心序列存在活性中心區域。第一段含有Cys-357血紅素中Fe(III)的結合部位，第二段含有Thr-252，與02結合密切相關。酶的活性中心為六配位，加入底物后，六配位變為五配位，Fe(III)由低自旋變為高自旋并引起條件電位的顯著增加，最后還原為F (II)并與O2結合。不同P450底物結合區域的序列存在較大差異，P450底物結合部位的細微變化可以改變P450的底物特異性和催化效率，因此通過對P450酶底物結合部位進行重新設計，一方面可以使P450結合和作用于非天然底物，從而用于特定的環境污染物的生物凈化；另一方面可以提高環境污染物的凈化效率。
[0006]Fowler ( Journal of the Chemical Society, ChemicalCommunications.1994，2761 - 2762)和 Stevenson (Journal of the American ChemicalSociety, 1996，118，12846-12847)發現P450cam的底物結合部位中酪氨酸Y96突變可以改變其底物的特異性。Y96A突變體能夠氧化不被天然P450酶氧化的物質二苯基甲烷，Y96A突變體的底物結合部位具有更大的空間，表示它對底物的要求可能具有更大的可塑性。Y96F突變體使原來底物樟腦的氧化區域和立體選擇性發生了變化，但是提高了多環芳烴萘和芘氧化區域專一性，I位和2位萘酚的比例達到93:3。另一個位點F87參與了蛋白質與底物的結合，F87A(L)與Y96F雙突變體提高了 P450cam對多環芳烴菲、芘和苯并芘的氧化效率。P450BM-3在ω I和ω 3位催化C12-C20飽和或不飽和脂肪酸的氧化。對枯草桿菌(Bacillusmegaterium)的P450BM-3中底物結合位點R47L/Y51F進行雙突變，使該區域疏水性加強后，對多環芳烴的氧化活性提高了 40倍；將3個位點A74G/F87V/L188Q進行突變，對多環芳烴萘、芴、二氫苊和苊的氧化活性分別提高到160、53、109和287/min，底物的氧化速率比野生型 P450BM-3 提高了數百倍(Li 等 Applied Biochemistry and Biotechnology 2008,144，27-36)。P450BM-3能在大腸桿菌中高效表達，并具有結構穩定性，因此，該基因被認為最適合用于構建多環芳烴氧化的工程菌株。最近,Brezna等又從分枝桿菌(Mycobacteriumvanbaalenii PYR-1)中克隆獲得了 3 個 P450 基因 cypl51 (pipA)、cypl50 和 cyp51,將這些基因在大腸桿菌中表達后，能夠有效地分解二苯并噻吩、7-甲基苯并[α]蒽和芘。表明Ρ450在很多細菌中參與了多環芳經的代謝(Applied Microbiology and Biotechnology2006，71，522-532)。
[0007]哺乳動物細胞色素P450單加氧酶在肝臟解毒中作用巨大，將這些基因轉化到植物中能降解很多有機污染物。研究發現人P450單加氧酶CYPlAl能夠有效地氧化苯并[a]芘等高分子量PAHs，因此根 據Gleba等人的方法，用分泌性信號肽使該基因在植物中大量表達后，分泌到根表面及土壤中，使根系周圍PAHs羥化，從而提高植物對高分子量PAHs吸收效率(Proceedings of the National Academy of Sciences 1999,96,5973-5977)。此外，羥化的多環芳烴一般都會通過與葡萄糖醛酸、葡萄糖或甲基結合轉移到細胞器中進一步代謝，其中依賴UDP-葡萄糖苷糖基轉移酶(UGT)是酚類化合物轉移的重要酶類。擬南芥中存在118個不同的UGT，三氯苯酚和四氯苯酚等酚類化合物都能通過UGT催化糖基化后轉移分解。本實驗室通過基因芯片和表達譜分析，確證3個UGT基因受到萘的誘導，表明這些基因可能參與萘在植物細胞中的轉運。
【發明內容】
[0008]本發明的目的在于提供一種提高植物對多環芳烴耐受性和降解能力的方法，通過該方法能夠拓寬植物修復多環芳烴污染土壤的范圍，加快吸收效率。
[0009]為達到上述目的，本發明的技術方案是:
[0010]一種提高植物對多環芳烴的耐受性和降解能力的方法:將改造的P450單加氧酶基因和楊樹UDP-葡萄糖苷糖基轉移酶(UGT)基因構建二價基因植物表達載體；將所述構建的二價基因植物表達載體通過農桿菌介導轉化到植物中。
[0011]優選地，所述P450單加氧酶基因來自于人肝。[0012]優選地，所述P450單加氧酶基因的改造方法是:通過定點突變方法消除P450單加氧酶(cyplAl)基因的129位NcoI切點和1436位EcoRI切點。
[0013]優選地，所述楊樹UDP-葡萄糖苷糖基轉移酶(UGT)基因按植物偏愛密碼通過合成方法獲得，所合成的楊樹Μ)Ρ-葡萄糖苷糖基轉移酶(UGT)中的388和1104位EcoRI，460位HindIII，428位NcoI酶切位點全部消除。
[0014]所述P450單加氧酶基因和UDP-葡萄糖苷糖基轉移酶基因構建二價基因植物表達載體的方法為:通過T4DNA連接酶將兩個基因與含有雙35S啟動子和NOS終止子的PYPX245 (Genbank AY178049.1)質粒連接；酶切鑒定和序列測定表明獲得了 P450單加氧酶基因和UDP-葡萄糖苷糖基轉移酶基因植物表達單元；將兩個表達單元酶切后依次插入PCAMBIA1301植物表達載體，構建二價基因植物表達載體pCYPUGT。
[0015]所述構建的二價基因植物表達載體pCYPUGT通過電擊法導入到根癌農桿菌中，所述根癌農桿菌優選為EHA105或LBA4404或GV3101。
[0016]優選地，通過所述根癌農桿菌將構建的二價基因植物表達載體pCYPUGT轉化到擬南芥和水稻中。
[0017]本發明的有益效果如下:
[0018]1，當植物中轉化了 P450單加氧酶基因(cyplAl)和UDP-葡萄糖苷糖基轉移酶(UGT)基因的表達載體后，通過表達產生的P450單加氧酶將多環芳烴氧化，然后再通過表達產生的m)P-葡萄糖苷糖基轉移酶將其和葡萄糖連接，轉移到植物細胞器中進一步分解。因此利用本發明構建的體系可以提高植物對菲或芘的耐受性和降解能力。
[0019]2，該套體系能在植物中安全高效表達，對環境影響較小。
`[0020]3，利用該套體系獲得的轉基因植物能夠有效修復被多環芳烴污染的土壤環境。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]圖1為本發明實施例中構建的P450單加氧酶基因(cyplAl)和UDP-葡萄糖苷糖基轉移酶(UGT)基因雙價基因植物表達載體。
【具體實施方式】
[0022]以下實施例中涉及的構建二價基因植物表達載體pCYPUGT，其具體的構建方法如下:
[0023]1、構建改造的P450單加氧酶基因(cyplAl)
[0024]從人肝中克隆P450單加氧酶基因并利用定點突變方法將129位NcoI切點，1436位EcoRI切點消除。
[0025]129 位 NcoI 切點突變引物:129Z:AGGGCCTTGGGGCTGGCCTCTGATTGG (SEQ ID N0.1所示)；129F:CCAATCAGAGGCCAGCCCCAAGGCCCT (SEQ ID N0.2 所示)。
[0026]1436 位 EcoRI 切點突變引物:1436Z:ACGGGTGGAGTTCAGCGTGCCACTGG(SEQ ID N0.3所示)；1436F:CCAGTGGCACGCTGAACTCCACCCGT (SEQ ID N0.4 所示)。
[0027]人肝總RNA，cDNA合成試劑盒為Clontech公司產品；DNA柱回收試劑盒購置Amersham公司；試劑RNA抽提試劑盒RNeasy Plant Mini Kit為QIAGEN公司產品；各種限制性內切酶和T4DNA Ligase均購自上海Takara公司。總RNA采用QIAGEN公司的RNeasyPlant Mini Kit 提取。
[0028]取約50 μ I人肝總RNA進行cDNA合成，cDNA的合成按Clontech公司SMART cDNALibrary Construction Kit說明書操作進行第一鏈合成。
[0029]以合成的cDNA 第一鏈為模板，以此 cyplOlZ:AAGGATCCATGCTTTTCCCAATCTCCATG(SEQ ID N0.5 所示)和 cyplOlF:AAGAGCTCCTAAGAGCGC AGCTGCATTTGGAAGTG (SEQ ID N0.6所示)為引物，利用PCR進行cDNA擴增，擴增條件為:94°C，預熱Imin ;94°C，30s，60°C，30s，72°C，3min。共25個循環。PCR結束后，采用酚:氯仿抽提，再加入2倍體積的無水乙醇進行沉淀。沉淀用30 μ I水溶解，取I μ I為模板，以引物cyplOlZ和129F ；129Z和1436F ；1436Z 和 cyplOlF 進行 PCR 擴增，擴增條件為:94°C 預熱 Imin ;94°C，30s，60°C，30s，72°C，lmin。共25個循環，PCR結束后，DNA片斷用10%丙烯酰胺膠回收，將上述3個回收的DNA片斷取IO-1OOng為模板混合，以cyplOlZ和cyplOlF為引物將上述片斷拼接，擴增條件為:94°Cd；^^lmin;94°C，30s，60°C，30s，72°C，4min。共 25 個循環。
[0030]PCR結束后，酚:氯仿抽提，再加入2倍體積的無水乙醇進行沉淀。各加入SacI和BamHI酶切消化，DNA柱回收酶切片斷。將酶切處理好片段進行定向克隆，獲得質粒Tl，并將質粒Tl高效轉化到大腸桿菌DH5 α感受態細胞中。
[0031]2、合成楊樹UDP-葡萄糖苷糖基轉移酶基因
[0032]以基因合成方法(NucleicAcids Research, 2004, 32, e98)獲取楊樹 UDP-葡萄糖苷糖基轉移酶基因。合成的楊樹Μ)Ρ-葡萄糖苷糖基轉移酶基因中388和1104位EcoRI，460位HindIII，428位NcoI酶切位點全部消除。
[0033]設計的引物為:
[0034]PtUGTl:
[0035]GGATCCATGGCAGAGACTGACTCTCCACCACATGTTGCCATCTTGCCATCTCCAGGTATG (SEQ ID N0.7 所示)
[0036]PtUGT2:
[0037]CMGTCTCTTAGCCMCTCMCCAGTGGGATCAGATGACCCATACCTGGAGATGGCMGA (SEQ ID N0.8 所示)
[0038]PtUGT3:
[0039]TGAGTTGGCTMGAGACTTGTTCACCMCACMCCTGTCOGTCACCTTCATCATTCCMC (SEQ ID N0.9 所示)
[0040]PtUGT4:
[0041]TCCAAGAAOGCTTCTTTGAGCTTTGGATGGAGAGCCATOGGTTGGAATGATGAAGGTGACCSEQ ID N0.10 所示)
[0042]PtUGT5:
[0043]CTCMAGMGCGTTCTTGGATCTCTTCCATCTACCATTCACTCOGTCTTTCTTCCACCAG(SEQ ID N0.11 所示)
[0044]PtUGT6:
[0045]GTCTOGATCTTGACATCTTCTGGAAGATCAGACAAGTTGACTGGTGGAAGAAAGAOGGAGCSEQ ID N0.12 所示)
[0046]PtUGT7:
[0047]GMGATGTCMGATOGAGAOOCTGATCTCTCTGACTGTTGCTAGATOC CTT0CTTCTCTC (SEQ ID N0.13 所示)
[0048]PtUGT8:
[0049]CTCTGCTTOCAGAGGCGACMGAGMGACAGMCATCTCTGAGAGMGGMGGGATCTAG (SEQ ID N0.14 所示)
[0050]PtUGTO:
[0051]TGTOXrrCTGGAACCAGAGTTGTTGCCTTGGTTGTTGATCTGTTTGGCACTGATGCATTCSEQ ID N0.15 所示)
[0052]PtUGTlO:
【權利要求】
1.一種提高植物對多環芳烴的耐受性和降解能力的方法，包括如下步驟: 步驟1，將改造的P450單加氧酶基因和楊樹UDP-葡萄糖苷糖基轉移酶(UGT)基因構建二價基因植物表達載體； 步驟2，將所述構建的二價基因植物表達載體通過農桿菌介導轉化到植物中。
2.如權利要求1所述的提高植物對多環芳烴的耐受性和降解能力的方法，其特征在于:所述P450單加氧酶基因來源于人肝。
3.如權利要求1或2所述的提高植物對多環芳烴的耐受性和降解能力的方法，其特征在于:所述P450單加氧酶基因的改造方法是，消除P450單加氧酶(cyplAl)基因的129位NcoI切點和1436位EcoRI切點。
4.如權利要求1所述的提高植物對多環芳烴的耐受性和降解能力的方法，其特征在于:所述楊樹Μ)Ρ-葡萄糖苷糖基轉移酶(UGT)基因按植物偏愛密碼通過合成方法獲得，其中388和1104位EcoRI，460位HindIII，428位NcoI酶切位點全部消除。
5.如權利要求1所述的提高植物對多環芳烴的耐受性和降解能力的方法，其特征在于:所述農桿菌為根癌農桿菌EHA105或根癌農桿菌LBA4404或根癌農桿菌GV3101。
6.如權利要求1所述的提高植物對多環芳烴的耐受性和降解能力的方法，其特征在于:所述多環芳烴為菲、芘。
7.如權利要求1所述的提高植物對多環芳烴的耐受性和降解能力的方法，其特征在于:所述植物為擬南芥、水稻。`
【文檔編號】C12N15/84GK103509819SQ201310410523
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年9月10日 優先權日:2013年9月10日
【發明者】彭日荷, 姚泉洪, 王榮談, 付曉燕, 田永生, 趙偉, 嚴培蘭, 丁衛星 申請人:上海市農業科學院, 上海瑞豐農業科技有限公司