黃瓜單拷貝基因的染色體物理定位方法
【專利摘要】本發明公開了黃瓜單拷貝基因在染色體上物理定位的方法，它是通過PCR擴增獲得黃瓜單拷貝基因，然后對產物進行凝膠電泳回收純化，以純化產物為模板進行第二次PCR擴增，然后將第二次PCR產物標備探針。分別取黃瓜根尖和盛花期植株上的花蕾進行酶解，涂片法制片，挑選分散度高的片子，并進一步進行胃蛋白酶處理后，備用。最后將標好的探針雜交到處理好的載玻片上，在熒光顯微鏡下觀察信號。本發明采用PCR擴增后切膠回收，之后再進行二次PCR擴增的方法，不僅可以去除基因組DNA的干擾，而且解決了切膠回收率低的問題；另外涂片法結合胃蛋白酶處理制作背景清晰且分散度高的片子可以提高信號的分辨率；通過此方法，可在染色體上直接檢測到的最短長度為2kb的單拷貝基因，為黃瓜的細胞遺傳學研究提供了可靠的保證。
【專利說明】黃瓜單拷貝基因的染色體物理定位方法
一、【技術領域】
[0001]本發明公開了利用熒光原位雜交技術直接將黃瓜單拷貝基因在染色體上進行物理定位的方法，有利于開展黃瓜的細胞遺傳學研究，屬于植物生物【技術領域】。
二、技術背景
[0002]黃瓜881:1^118 , 2X1 = 14)是世界上最重要的蔬菜作物之一。黃瓜具有一些特殊的性狀，如性別表型多樣化、線粒體的父性遺傳性等；同時黃瓜的基因組相對較小(約37014，染色體數目少，僅為14條，使得黃瓜成為近年來分子細胞遺傳學研究的模式物種之一。
[0003]細胞遺傳圖譜是指遺傳上標記的探針在染色體上的位置，涉及了細胞學上的標志，例如著絲粒、端粒、異染色質區和核仁組織區等。伴隨著基因組研究的進步，細胞遺傳圖譜不僅對于整合遺傳、分子和細胞學的信息具有重要的價值，并且能為染色體水平上觀察基因組結構提供一種獨特的研究思路。
[0004]基因或特定序列的染色體物理定位是細胞遺傳相關研究的重要內容之一。傳統的？1別技術對目標片段長度有一定的要求，一般片段至少在10?以上才能檢測到可見的信號。目前基因染色體物理定位的主要方法是利用包含該基因的大片段克隆進行染色體熒光原位雜交，從而進行相應基因的物理定位，這些大片段克隆主要有8八0、^081111(1等。該方法依賴于大片段文庫的構建、以及利用相應的分子標記篩選獲得特寫的克隆，才能用于基因的物理定位。
[0005]構建細胞遺傳圖譜最直接、最有效的方式是通過？13?直接將單拷貝基因定位到染色體上，多數基因的長度在10?以下，這對？13?的檢測精度提出了新的挑戰。在植物染色體上，短片段序列的檢測更為很難，主要是由于植物細胞壁碎片和濃厚的細胞質不易去除，背景較高，同時阻止了靶0嫩的順利進入，最終導致了相對低的信噪比。迄今，單拷貝基因的？13?檢測僅來自于少數幾個實驗室的報道。例如1--%等人(1996年)在矮牽牛的有絲分裂中期染色體上用1.4^大小的探針定位了查耳酮合酶基因八^0^1(10等人(1998年)在水稻有絲分裂中期染色體上定位了一個1.29?大小的序列:1^1118(2006)等在玉米粗線期染色體上能檢測到3?的基因信號。然而，由于技術上的難度，單拷貝基因的染色體物理定位在植物中仍未見廣泛的應用。
[0006]目前，單拷貝基因在黃瓜中期和粗線期染色體上的定位仍未見報道，我們通過改進制片技術，并利用純化的單拷貝基因進行檢測，能在染色體上看到明顯的單拷貝基因的信號，最小能檢測到2?的基因片段，從而實現了單拷貝基因在染色體上的直接物理定位。
三、
【發明內容】
[0007]技術問題
[0008]本發明黃瓜單拷貝基因在染色體上的物理定位方法的目的，是針對以往黃瓜單拷貝基因無法在黃瓜染色體上進行直接定位等缺陷，發明能通過？13?在黃瓜中期和粗線期染色體上檢測到小至2?長度的單拷貝基因的信號，為制作高分辨率的黃瓜染色體的物理圖譜奠定了基礎，加快了黃瓜的細胞遺傳學研究進展。
[0009]技術方案
[0010]本發明所提供的黃瓜單拷貝基因在染色體上的物理定位，其特征在于:在黃瓜中期和粗線期染色體上觀察到了清晰明顯的且片段小至2?的單拷貝基因探針的信號。
[0011]上述黃瓜單拷貝基因能夠定位在染色體上，是通過以下方法獲得的:
[0012]取黃瓜植株根尖以及盛花前期和盛花期大小的花蕾，分別用固定液固定備用。
[0013]取出固定好的根尖和花蕾，處理之后酶解，然后用涂片法制片，鏡檢，進一步用胃蛋白酶進行細胞質的去除，然后用乙醇梯度干燥，備用。
[0014]根據黃瓜基因組數據庫，隨機選擇黃瓜單拷貝基因，利用0設計引物，利用長片段酶進行擴增，擴增產物在1 %的瓊脂糖凝膠中電泳，然后進行切膠回收。
[0015]將得到的回收產物作為0嫩模版，再進行二次擴增。
[0016]將二次產物標成探針備用，通過？1別，將探針雜交到黃瓜染色體上，在熒光顯微鏡下觀察信號。
[0017]有益效果
[0018]本發明與現有技術相比，具有如下優點和積極效果:
[0019]1)黃瓜單拷貝基因通過？1別能夠在黃瓜中期和粗線期染色體檢測到信號(圖1和2)，且檢測到的探針信號的最小片段小于21^(圖4)，與現有技術相比，充分提高了靶信號的靈敏度。
[0020]2)現有的技術在定位目標基因時，主要利用大片段文庫進行？13?定位，這需要事先構建好相應的文庫，需要特定的條件。同時還需要在文庫中篩選獲得包含目標基因的克隆，程序相當繁瑣。而使用現在的方法可以直接進行基因的定位，檢測到的最小探針長度為2吐，適合于絕大多數基因的定位需要。
[0021]3)在材料準備方面，制作分散度高的片子，這樣可以使雜交上去的探針信號更加清晰，提高了定位的準確性，加快了實驗進程。
[0022]4)將擴增出來之后，進行切膠回收，這樣可以去除基因組0嫩的干擾，使得目標探針信號在染色體上清晰可辨。
四、【專利附圖】
【附圖說明】
[0023]圖1:利用本發明制作的單拷貝基因在黃瓜粗線期染色體上的定位，單拷貝基因的信號明顯，無重復序列的干擾。
[0024]圖2:單拷貝基因在黃瓜五號染色體中期染色體上的定位，中期染色體分散度高，很容易分辨出信號的定位。
[0025]圖3:三個單拷貝基因在黃瓜五號染色體粗線期染色體上的定位，能清晰的分辨出目標信號在染色體上的分布。
[0026]圖4:2.0^的單拷貝基因片段在黃瓜四號中期染色體上的定位，充分顯示了黃瓜靶信號靈敏度的提高。五、
【具體實施方式】
[0027]本發明黃瓜單拷貝基因在染色體上的定位的實施程序包括:
[0028](1)9(?產物的切膠回收:以黃瓜0嫩為模版，按照體系進行第一次？⑶擴增，然后將產物全部加到瓊脂糖凝膠中進行檢測，針對不同的產物，分別切膠，然后根據試劑盒進行回收，回收完之后對回收后的產物進行檢測，得到不同的產物不同的濃度。
[0029](2)第二次？⑶擴增及標探針:根據產物的濃度不同，調整體系混樣。擴增之后對產物進行檢測。挑選濃度較高的第二次產物，分別標成紅色和綠色的探針，備用。
[0030](3)材料準備:在黃瓜植株上取適當的根尖以及在盛花前期和盛花期取適當大小的花蕾，分別放入體積比為3: 1的(甲醇:冰醋酸)3:(}(乙醇:冰醋酸)固定液中固定至少24小時，超過一周的話可將根尖和花蕾換到70%的乙醇中，酶解好備用。
[0031](4)制片:①取出酶解好的其中的一個花藥，放入另一新的1.51111離心管中，加入約100111的2 4固定液，將花藥搗碎，吸出約30111的含粗線期染色體的液體，涂于載玻片上，再加上100111的2:6固定液，在酒精燈上燒片干燥制片；②取出酶解好的其中一個根尖，放在干凈的載玻片上用鑷子敲碎，再加上100111的1:6固定液，在酒精燈上燒片干燥制片。
[0032]根據？1別程序，將探針加到載玻片上進行雜交過夜，第二天進行洗片，壓片。然后在熒光顯微鏡下觀察單拷貝基因的信號即可。
【權利要求】
1.黃瓜單拷貝基因的染色體物理定位，其特征在于: 通過熒光原位雜交(FISH)，能在黃瓜中期和粗線期染色體上檢測到片段小至2.0kb的單拷貝基因的FISH信號。
2.根據權利要求1所述的在黃瓜中期和粗線期染色體上檢測到最短長度為2kb的單拷貝基因的FISH信號，是通過以下方法獲得的: 1)黃瓜染色體上的單拷貝基因利用基因組DNA作模板，進行PCR擴增之后，1%的瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收； 2)利用切膠回收的DNA標探針，若回收產物不夠，可以切膠回收的DNA為模板，再進行二次PCR擴增，利用擴增后的產物標探針； 3)取酶解好的花藥或根尖，加入適量固定液制成懸濁液涂片，再利用涂片法制片，鏡檢，挑選染色體分散度高的制片，進一步利用胃蛋白酶消化去除細胞質后，干燥備用； 4)將標好的探針雜交到黃瓜染色體上，通過FISH檢測信號。
3.根據權利要求1所述的在黃瓜中期和粗線期染色體上檢測到了片段長度最小達.2.0kb的單拷貝基因的FISH信號，是由于探針既沒有基因組DNA的干擾，并經過第二次PCR擴增之后，濃度較高，而且經過預處理的載玻片背景較干凈，易于探針雜交上去。
【文檔編號】C12Q1/68GK104419763SQ201310409784
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月11日 優先權日:2013年9月11日
【發明者】婁群峰, 張云霞, 陳勁楓, 何玉華, 賈利, 程春燕, 李季 申請人:南京農業大學