一種轉人血清白蛋白水稻品系114-7-2的側翼序列的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種轉人血清白蛋白水稻品系114-7-2的側翼序列及其鑒定方法。本發明所提供的鑒定方法包括如下步驟：以待測水稻的基因組DNA為模板，利用特異性的引物對進行PCR檢測，確定所述待測水稻是否為轉人血清白蛋白水稻品系114-7-2；所述引物對的按照如下（1）或（2）的方法設計得到的：（1）分別依據序列1的第1-379位，以及第380-525位設計所述引物對中的正向引物和反向引物；（2）分別依據序列2的第1-533位，以及第534-785位設計所述引物對中的正向引物和反向引物。實驗證明，本發明所提供的鑒定待測水稻是否為轉人血清白蛋白水稻品系114-7-2的方法準確率高、特異性強、靈敏度高、耗時短，這為轉基因安全提供了保證。
【專利說明】—種轉人血清白蛋白水稻品系114-7-2的側翼序列
[0001]本申請是申請號為201210313098.7、申請日為2012年8月29日、發明創造名稱為“轉人血清白蛋白水稻品系114-7-2的側翼序列及其鑒定方法”的分案申請。
【技術領域】
[0002]本發明涉及一種轉hsa基因表達人血清蛋白水稻品系114-7-2的側翼序列及其鑒定方法，具體涉及用于鑒定或輔助鑒定待測水稻是否為轉人血清白蛋白水稻品系114-7-2的引物對的設計方法，轉人血清白蛋白水稻品系114-7-2的鑒定方法，以及轉人血清白蛋白水稻品系114-7-2外源插入片段的側翼序列。
【背景技術】
[0003]水稻是我國乃至全世界最重要的糧食作物之一，是世界上食用人口最多、歷史最悠久的農作物。隨著生物技術的發展，轉基因技術正廣泛地應用于農作物改性，其中2009年我國已批準了轉基因水稻Bt63的安全證書。目前，還有多個轉基因品系已進入環境釋放和生產性試驗階段。
[0004]轉人血清白蛋白水稻品系114-7-2是由武漢大學楊代常教授利用水稻胚乳細胞的蛋白體，采用水稻胚乳特異性表達的啟動子和信號肽，介導重組人血清白蛋白進入水稻胚乳細胞的內膜系統，并儲存到水稻胚乳的蛋白體中，從而使重組人血清白蛋白能在水稻種子內大量積累的轉基因水稻品系，所導入外源基因是人血清白蛋白(HSA)。轉人血清白蛋白水稻品系114-7-2作為一個高效蛋白質表達技術平臺，可以用于表達包括醫藥、食品添加劑、美容、營養和工業用等各種用途的蛋白質或多肽，使傳統的蛋白藥物的工業發酵生產方式變為農業生產方式生產，具有極高地推廣價值和應用前景，可以產生巨大的經濟和社會效應。
[0005]在轉基因生物安全受到越來越廣泛關注的當今社會，以生物技術為基礎的轉基因檢測方法成了監管轉基因植物及食品的有效手段。實時熒光PCR (Real time PCR)就是其中一個最常用最有效的方法。實時熒光PCR是在常規PCR基礎上加入熒光標記探針，通過對PCR擴增反應中每一個循環產物熒光信號的實時檢測實現對起始模板定量及定性的分析，具有高特異性和高靈敏度的優點。
[0006]目前已經有部分專利和文獻報道了轉基因植物外源插入載體旁側序列，例如:彭于發等人于2007年利用基因步移和LD-PCR方法分析了水稻品系科豐6號的外源插入片段的旁側序列，建立了轉基因水稻科豐6號的品系特異性檢測方法。然而，在對現有的專利和文獻的分析中發現，還沒有任何關于轉hsa基因表達人血清蛋白水稻品系114-7-2的外源插入片段的旁側序列的文章和專利報道。
【發明內容】
[0007]本發明的一個目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測水稻是否為轉人血清白蛋白水稻品系114-7-2的PCR引物對的設計方法。[0008]本發明所提供的鑒定或輔助鑒定待測水稻是否為轉人血清白蛋白水稻品系114-7-2的PCR引物對的設計方法，為如下(I)或(2):
[0009](I)依據序列表中序列2的第1-379位設計所述引物對中的正向引物，依據序列表中序列2的第380-525位設計所述引物對中的反向引物；
[0010](2)依據序列表中序列I的第1-533位設計所述引物對中的正向引物，依據序列表中序列I的第534-785位設計所述引物對中的反向引物。
[0011]其中，序列I和序列2分別為轉人血清白蛋白水稻品系114-7-2的兩個側翼序列。序列I為位于水稻基因組第5染色體上的5’端側翼序列，全長785bp，前533bp為水稻基因組序列片段(GenBank:NC008398的第2496104-2496636位)，后252bp為轉化載體上T-DNARBS序列片段。序列2為位于水稻基因組第4染色體上的5’端側翼序列，全長525bp，前379bp 為水稻基因組序列片段(GenBank:NC008397 的第 30911165-30911543 位)，后 146bp為轉化載體上T-DNA RBS序列片段。
[0012]本發明的另一個目的是提供一種檢測或輔助檢測待測水稻是否為轉人血清白蛋白水稻品系114-7-2的方法。
[0013]該方法包括如下步驟:以所述待測水稻的基因組DNA為模板，利用根據上述方法(即鑒定或輔助鑒定待測水稻是否為轉人血清白蛋白水稻品系114-7-2的PCR引物對的設計方法)設計得到的引物對進行PCR檢測，從而確定所述待測水稻是否為轉人血清白蛋白水稻品系114-7-2。
[0014]在本發明的一個`實施例中，所述引物對具體由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA分子組成。
[0015]其中，序列3由17個核苷酸組成；序列4由20個核苷酸組成。
[0016]為了增加鑒定結果的準確度、靈敏度等，所述PCR可為實時熒光PCR。
[0017]所述實時熒光PCR所采用的探針可為TaqMan熒光探針，在本發明中，所述探針的核苷酸序列具體如序列表中序列5所示。
[0018]其中，序列5由21個核苷酸組成。
[0019]TaqMan熒光探針是一種寡核苷酸探針，報告熒光基團連接在探針的5’末端，淬滅熒光基團連接在探針的3’末端。PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’_3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。
[0020]所述報告熒光基團可為Fam (FAM)、Hex(HEX)、Tet (TET)、Joe (JOE)、Vic(VIC)、Fite(FITE)、Cy3 (CY3)或 Cy5 (CY5)。所述淬滅熒光基團可為 Tamra (TAMRA)、Rox (ROX)、Dabcy (DABCY) ,Bhql (BHQl)或Bhq2 (BHQ2)。在本發明中，所述探針5’端標記的報告熒光基團具體為FAM熒光基團，3’端標記的淬滅熒光基團具體為TAMRA熒光基團。
[0021]所述實時熒光PCR的PCR體系中，所述引物對中的兩條引物以及所述探針的摩爾比可為2:2:1。
[0022]在本發明的一個實施例中，反應起始時，所述引物對中的兩條引物的濃度均為
0.2 μ mol/L,所述探針的濃度為0.1 μ mol/L。[0023]所述實時熒光PCR的退火溫度可為60°C。
[0024]在本發明的一個實施例中，所述實時熒光PCR的反應參數具體如下:50°C 2min ；95°C IOmin ；95°C 5s,60°C lmin，共 40 個循環。
[0025]本發明的再一個目的是提供轉人血清白蛋白水稻品系114-7-2外源插入片段的側翼序列。
[0026]本發明所提供的轉人血清白蛋白水稻品系114-7-2外源插入片段的側翼序列的核苷酸序列具體為序列表中的序列I或序列2。
[0027]其中，序列I和序列2分別為轉人血清白蛋白水稻品系114-7-2的兩個側翼序列。序列I為位于水稻基因組第5染色體上的5’端側翼序列，全長785bp，前533bp為水稻基因組序列片段(GenBank:NC008398的第2496104-2496636位)，后252bp為轉化載體上T-DNARBS序列片段。序列2為位于水稻基因組第4染色體上的5’端側翼序列，全長525bp，前379bp 為水稻基因組序列片段(GenBank:NC008397 的第 30911165-30911543 位)，后 146bp為轉化載體上T-DNA RBS序列片段。
[0028]利用上述方法(鑒定或輔助鑒定待測水稻是否為轉人血清白蛋白水稻品系114-7-2的PCR引物對的設計方法)設計得到的鑒定或輔助鑒定待測水稻是否為轉人血清白蛋白水稻品系114-7-2的PCR引物對法也屬于本發明的保護范圍。
[0029]實驗證明，本發明通過實時熒光PCR的方法，利用根據轉hsa基因表達人血清蛋白水稻品系114-7-2的側翼序列設計得到由序列表中序列3和序列4所示的引物對，以及序列5所示的探針可以檢測待測水稻是否為轉hsa基因表達人血清蛋白水稻品系114-7-2，且該方法準確率高、特異性強、靈敏度高、耗時短。這為轉基因安全提供了保證。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0030]圖1為HSA基因表達盒圖譜。
[0031]圖2為實時熒光PCR檢測品系特異性結果。其中，Λ Rn是Rn扣除基線后得到的標準化結果(Λ Rn=Rn -基線)。Rn (Normalized reporter)是突光報告基團的突光發射強度與參比染料的熒光發射強度的比值。標記I處所示線條表示轉人血清白蛋白水稻品系114-7-2 ο
[0032]圖3為實時熒光PCR檢測轉人血清白蛋白水稻品系114-7-2的靈敏度實驗結果。【具體實施方式】
[0033]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0034]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0035]轉HSA基因水稻(GM0+)，即轉人血清白蛋白水稻品系114_7_2:Large-scaleproduction of functional human serum albumin from transgenic rice seeds.Proceedings of the National Academy of Sciencesl0.1073/pnas.1109736108。
[0036]非轉基因水稻臺北309(GM0_):水稻醇溶蛋白4a基因啟動子在轉基因水稻中的特異性表達.農業生物技術學報,JOURNAL OF AGRICULTURAL BIOTECHNOLOGY，1999 年 03 期。
[0037]轉基因番茄“華番I號”:黃文勝陳紅運趙文軍陳穎徐寶梁朱水芳.轉基因延熟番茄〃華番一號〃的品系特異性檢測方法[J].植物檢疫，2005，(6):321-324.[0038]轉基因水稻“克螟稻”:植酸酶基因定性PCR檢測方法及陽性質粒分子的構建.作物學報 ACTA AGR0N0MICA SINICA2012，38 (4): 639-647.1SSN0496-3490。
[0039]轉基因水稻“科豐6號”:植酸酶基因定性PCR檢測方法及陽性質粒分子的構建.作物學報 ACTA AGR0N0MICA SINICA2012，38 (4): 639-647.1SSN0496-3490。
[0040]轉基因水稻“華恢I號”:轉Bt基因抗蟲水稻對稻田生物群落的影響四川農業大學學報 2003，21 (2):185-186
[0041]轉基因水稻Bt63:植酸酶基因定性PCR檢測方法及陽性質粒分子的構建.作物學報ACTA AGR0N0MICA SINICA2012，38(4):639-647.1SSN0496-3490。
[0042]轉Bt基因抗蟲棉:轉Bt抗蟲棉各器官毒蛋白的含量及表達.農業生物技術學報，2002年第3期。
[0043]轉基因玉米M0N810:植酸酶基因定性PCR檢測方法及陽性質粒分子的構建.作物學報 ACTA AGR0N0MICA SINICA2012，38 (4): 639-647.1SSN0496-3490。
[0044]轉基因玉米M0N88017:植酸酶基因定性PCR檢測方法及陽性質粒分子的構建.作物學報 ACTA AGR0N0MICA SINICA2012，38 (4): 639-647.1SSN0496-3490。
[0045]轉基因玉米NK603:植酸酶基因定性PCR檢測方法及陽性質粒分子的構建.作物學報 ACTA AGR0N0MICA SINICA2012，38 (4): 639-647.1SSN0496-3490。
[0046]實施例1、轉人血清白蛋白水稻品系114-7-2的外源插入片段側翼序列的克隆
[0047]一、實驗材料
[0048]1、植物材料
[0049]轉基因水稻:轉HSA基因水稻(GM0+)，即轉人血清白蛋白水稻品系114_7_2，該轉基因水稻的轉化載體含有如圖1所示HSA基因表達盒。
[0050]常規水稻:非轉基因水稻臺北309 (GM0-)。
[0051]2、酶與試劑
[0052]熒光定量ABMIx試劑購自ABI公司，其他分子生物學試劑，如Extaq DNA聚合酶、DL2000Marker購自大連寶生物生物工程有限公司。其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。引物由上海生工生物技術有限公司合成。
[0053]3、實驗儀器
[0054]PCR擴增儀:Veriti?96孔梯度PCR儀(ABI公司)
[0055]核酸電泳儀:DYY_ III型核酸電泳儀(北京六一儀器廠)
[0056]其它儀器包括:離心機、電子天平、培養箱等。
[0057]二、實驗方法
[0058]1、植物基因組DNA提取和檢測
[0059](I)植物DNA的提取方法
[0060]a取轉基因水稻(或常規水稻)葉片約0.1g于研缽中，加入液氮迅速研磨至粉末狀。
[0061]b將葉片粉末迅速轉入到事先加入700 μ I CTAB緩沖液(CTAB15g ；1MTris *Cl(pH8.0) 75ml ；0.5M EDTA30ml ；NaC161.4g ;ddH20 補足到 1000ml)的 2ml 離心管中，輕輕混勻后，65°C水浴保溫30分鐘。每隔十分鐘小心搖晃混勻。
[0062]c取出離心管，待冷至室溫后(25°C)，加入700 μ I等體積比的酚/氯仿(即酚和氯仿各350μ I)。上下顛倒充分混合，抽提5分鐘。
[0063]d室溫下，12000rpm離心10分鐘,用剪去頭部的Iml槍頭將上清轉移到另一個新的離心管中，加 2μ I RNaseA (10mg/ml)。
[0064]e加入與上清等體積的氯仿(700μ 1)，上下顛倒充分混合，抽提5分鐘。
[0065]f室溫下，12000rpm離心10分鐘，吸取上清到另一新的離心管中。
[0066]g加入等體積的異丙醇(700 μ I),充分混勻，常溫放置10分鐘后可見沉淀。為沉淀完全，可在_20°C放置1-2小時。
[0067]h室溫下，12000rpm離心10分鐘，沉淀積于管底。棄盡上清液。
[0068]I加入700 μ 170% (體積百分含量)乙醇水溶液清洗30分鐘。
[0069]j倒去離心管中的乙醇水溶液，使DNA沉淀在管中自然晾干。
[0070]k加入適量TE (50 μ I)溶解，放入_20°C冰箱保存備用。
[0071](2) DNA 檢測
[0072]取5 μ I步驟(1)提取的DNA溶液，以0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，根據其亮度和帶型來初步判斷提取DNA的質量。采用紫外分光光度計測定所提取的DNA的濃度和純度。
[0073]2、轉人血清白蛋白水稻品系114-7-2的外源插入載體的側翼序列的獲得
[0074]本研究采用Genome walking的方法分離得到了轉人血清白蛋白水稻品系114-7-2的兩個5’端旁側序列。Genome walking是一種擴增已知序列旁側未知區域序列的方法，參照Genome walking試劑盒(TaKaRa Code:D316)說明，主要操作步驟如下:
[0075](I)設計特異性引物
[0076]根據已知的T-DNA RBS序列，利用Primer5軟件分別設計三條同向且退火溫度較高的特異性引物(SP Primer):SP1、SP2和SP3，SP2的位置在SPl的內側，SP3位于SP2的內側，送上海生工生物技術有限公司合成，見表1。
[0077]表1特異引物序列相關信息
[0078]
【權利要求】
1.轉人血清 白蛋白水稻品系114-7-2外源插入片段的側翼序列，其核苷酸序列為序列表中的序列I或序列2。
【文檔編號】C12N15/11GK103484455SQ201310409259
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2012年8月29日 優先權日:2012年8月29日
【發明者】張麗麗, 黃新 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院