用于無抗生素ColE1質粒增殖的宿主-載體系統的制作方法

用于無抗生素ColE1質粒增殖的宿主-載體系統的制作方法
【專利摘要】本發明涉及用于無抗生素ColE1質粒增殖的宿主-載體系統。宿主-載體系統，利用ColE1-型質粒的基于RNA-拷貝數控制機制用于調節標志物基因的表達，容許進行質粒的無抗生素篩選并且可以用于產生質粒DNA和重組蛋白。
【專利說明】用于無抗生素CoIEI質粒增殖的宿主-載體系統
[0001]本申請是申請日為2005年09月08日、中國申請號為200580037778.9、發明名稱為“用于無抗生素ColEl質粒增殖的宿主-載體系統”的發明申請的分案申請。[0002]本發明涉及質粒增殖領域，尤其是質粒DNA以及重組蛋白的產生。
[0003]利用質粒DNA作為基因轉移工具已經廣泛用于基因治療領域。
[0004]在基因治療應用中，將攜帶治療性興趣基因的質粒導入到患者中，靶細胞中該基因的短暫表達導致期望的治療效果。
[0005]攜帶感興趣的治療基因的重組質粒可以通過培養細菌得到。為了篩選細菌轉化株并且為了保證質粒在細菌宿主細胞中的保持，通常地，將抗生素抗性基因包括在質粒骨架中。質粒的篩選通過將細胞在包含各自抗生素的培養基中生長而實現，其中只有攜帶質粒的細胞能夠生長。
[0006]利用抗生素抗性基因進行篩選質粒以用于基因治療具有以下缺點:
[0007]由于在基因治療中，完整的質粒被遞送，抗生素抗性基因導入到治療對象中。盡管這些基因被原核啟動子所啟動并且因此在哺乳動物細胞以及組織中沒有活性，存在將遞送的基因整合到細胞基因組中的可能性并且因此可能，如果在哺乳動物啟動子附近，可能被轉錄并且表達。
[0008]攜帶抗生素抗性基因的質粒第二個缺點是可能被帶有殘留的抗生素最終的產物污染。考慮到可能的免疫致敏性，這是一個問題，尤其是利用β_內酰胺抗生素的情形下。
[0009]為了避免這些風險，在禁止將抗生素抗性基因用于制備治療性質粒方面以及開發代替性的篩選方法方面已經進行了不懈的努力。
[0010]在嘗試實現無抗生素篩選方面，已經使用了能夠補償宿主營養缺陷型的質粒。但是，該方法以及所有相關方法的主要的缺點在于需要在質粒插入另外的基因(例如JKgg等，2004)。
[0011]另外一種方法是稱為“阻抑蛋白滴定”的思想(Wiliams等，1998)。根據該思想，包含kan基因(卡那霉素抗性基因)修飾的大腸桿菌宿主株在Iac操縱子/啟動子控制下。在缺失誘導劑(IPTG或者異乳糖)的情形下，該株不能在包含卡那霉素的培養基中生長。用包含Iac操縱子的高拷貝數目的質粒轉化導致kan表達，通過從操縱子滴定IacI。在加入卡那霉素之后，只有包含高質粒拷貝數的細胞能夠生存。該思想的主要缺點再次地在于使用抗生素不可缺少。
[0012]本發明的目的在于提供一種不用抗生素的新穎的質粒篩選體系。
[0013]為了解決本發明的問題，已經開發了通過使用帶有ColEl復制起點的質粒的復制機制(在下文中，帶有ColEl復制起點的質粒稱為“ColEl-型質粒”)。
[0014]大量天然存在的質粒以及許多最常用的克隆工具是ColEl-型質粒。這些質粒復制其DNA，利用涉及合成兩種RNA分子的常規的機制，這些分子一方面相互作用并且另一方面與模板質粒 DNA 相互作用(Helinski, 1996 ；Kues 和 Stahl, 1989)。
[0015]代表性的ColEl-型質粒是天然存在的ColEl質粒pMBl、pl5A、pJHCMWl,以及常用的以及商業提供的克隆工具如PBR322以及相關的載體，pUC質粒、pET質粒以及pBluescript 載體(例如 Bhagwat 和 Person, 1981 ;Balbas 等，1988 ；Bolivar, 1979 ；Vieira和 Messing, 1982)。
[0016]對于所有這些質粒，復制的ColEl啟動以及復制的調節已經進行了廣泛的描述(例如:Tomizawa, 1981，1984，1986，1989，1990 ；Chan 等，1985 ；Eguchi 等，1991a ；Cesareni等，1991)。ColEl區包含針對參與復制的調節的兩種RNAs的兩種啟動子。從ColEl-型質粒的復制起始自預引物RNA 11(復制起點上游555bp)的轉錄，通過宿主的RNA聚合酶。在延伸的過程中，RNA II折疊成特定的發夾結構，并且約550個核苷酸的聚合之后，開始與模板DNA形成雜合體。隨后，RNA II預引物被RNaseH裂解以形成具有游離的3’0H末端的活性引物，其可以被 DNA 聚合酶 I 接近(Lin-Chao 和 Cohen, 1991 ;Merlin 和 Polisky, 1995)。
[0017]在ColEl-型起始鏈的相對側，RNA I，108個核苷酸的反義RNA，互補于RNA II的5’端，也被轉錄。RNA I的轉錄起始自復制起點上游的445bp處，直至約RNA II轉錄開始的地方。在RNA/DNA雜合體形成之前通過結合至延伸的RNA II分子，RNA I抑制引物的形成以及由此的復制。
[0018]兩種RNAs之間的相互作用是一個逐步過程，其中RNA I和RNA II形成數種莖環結構。它們初始通過它們互補環之間的堿基配對以形成所謂的“相吻復合物”而相互作用。隨后，RNA I沿著RNA II雜交，并且形成穩定的雙鏈體。相吻復合物的形成對復制的抑制至關重要。由于其是限速步 驟，其已經進行了深入的研究(Gregorian和Crothers, 1995)。
[0019]除了 RNA I/RNA II相互作用，ColEl的rom/rop的轉錄也促進質粒拷貝數目的控制，通過增加在RNA II和RNA I之間的復合物形成速率。為了增加拷貝數目，在一些pBR322衍生物中，編碼rom/rop的基因已經被刪除，例如在pUC19上。
[0020]本發明第一方面涉及一種非天然存在的細菌細胞，包含，
[0021]i)編碼表達可被調節的蛋白的DNA序列，并且所述的DNA序列可操作地連接至下述序列，
[0022]ii)DNA序列，編碼模擬RNA II序列或者其部分的RNA序列，所述的RNA序列互補于可從帶有ColEl復制起點的質粒轉錄的RNA I序列。
[0023]在其他的方面，本發明涉及一種宿主-載體系統，包括帶有ColEl復制起點的質粒以及其中所述的質粒能夠被復制的細菌宿主細胞，其中所述的宿主-載體系統包括
[0024]a)帶有ColEl復制起點的質粒；
[0025]b)細菌宿主細胞，其中所述的質粒能夠被復制，包含
[0026]i)編碼表達可被調節的蛋白的DNA序列，并且所述的DNA序列可操作地連接至下述序列，
[0027]ii)DNA序列，編碼模擬RNA II序列或者其部分的RNA序列，所述的RNA序列互補于可從質粒a)轉錄的RNA I序列；
[0028]其中在ii)中定義的所述的RNA序列，在不存在質粒a)的情形下，容許所述的蛋白的表達以及
[0029]其中，當所述的質粒a)存在于所述的宿主細胞b)中的時候，從質粒轉錄的RNA I分子與在ii)中定義的所述的RNA序列雜交，從而所述的蛋白的表達被抑制。
[0030]在優選的實施方案中，DNA序列i)為外源的DNA序列。
[0031]在優選的實施方案中，被所述的外源的DNA i)編碼的蛋白對宿主細胞而言是有毒的或者致死的。
[0032]在進一步的方面，本發明涉及宿主-載體系統，包括帶有ColEl復制起點的質粒以及其中所述的質粒能夠被復制的細菌宿主細胞，其中所述的宿主-載體系統包括
[0033]a)帶有ColEl復制起點的質粒；
[0034]b)非天然存在的細菌宿主細胞包含，整合到其基因組中的，
[0035]i)編碼蛋白的外源的DNA序列，所述的蛋白對所述的宿主細胞是致死的或者有毒的，所述的DNA可操作地連接至下述序列，
[0036]ii)DNA序列，編碼模擬RNA II序列或者其部分的RNA序列，所述的RNA序列互補于可從質粒a)轉錄的RNA I序列；
[0037]并且其中在所述的ii)中定義的RNA序列在缺失質粒a)的情形下，容許所述的致死的或者有毒的蛋白的表達以使所述的宿主細胞的生長被全部或者部分地抑制，
[0038]并且其中，當所述的質粒a)存在于所述的宿主細胞中，從質粒轉錄的RNA I分子與在ii)中定義的所述的RNA序列雜交，從而所述的致死的或者有毒的蛋白的表達被抑制，從而帶有質粒細胞的完全或者部分的生長抑制被取消。
[0039]本發明利用基于ColEl-型質粒的RNA-拷貝數目的控制機制，用于調節存在于細菌宿主細胞中的一種或者多種基因的表達，優選地插入在細菌基因組中，并且充當篩選標志物。
[0040]在下文中，i)的DNA序列(或者從如此的DNA轉錄的RNA分別地)稱為“標志物基因”(或者“標志物RNA”，分別地)。
[0041]如上所述，在本發明的實施方案中，標志物基因編碼本身是致死的或者有毒的蛋白。在該實施方案中，在本發明的上下文中，術語“標志物基因”也包含其表達產生有毒作用的基因，所述的有毒作用不是直接地由于表達產物，而是基于其他的機制，例如一旦表達標志物基因就產生有毒的物質。簡單而言，在下文中，被標志物基因編碼的蛋白稱為“標志物蛋白”;在標志物蛋白是致死的或者有毒的蛋白的情形下，其稱為“有毒的蛋白”。
[0042]在優選的實施方案中，標志物蛋白本身不是致死的或者有毒的或者由于一旦其表達產生有毒的作用，而是通過阻抑對所述的細菌細胞的生長必需的基因的轉錄。這些標志物蛋白，或者其編碼DNA，分別地稱為“阻抑蛋白”或者“阻抑蛋白基因”，并且對所述的細菌細胞的生長必需的基因稱為“必需基因”。
[0043]在下文中，模擬RNA 11序列的RNA序列，或者其部分，稱為“ RNA I1-樣序列”。
[0044]在本發明的上下文中，〃可操作地連接〃指DNA序列i)以及DNA序列ii)以如下的方式相互放置以使被所述的DNA序列i)編碼的標志物蛋白的表達被所述的RNA序列ii)(RNA I1-樣序列)調節。
[0045]本發明的原理，即，RNA 1-介導的標志物基因下-調或者沉默，顯示在圖1中:
[0046]RNA I1-樣序列以及Shine Dalgarno序列存在于宿主的轉錄物上。從質粒轉錄的RNA I序列充當所述的RNA I1-樣序列的反義RNA并且因此抑制標志物mRNA的翻譯。
[0047]在標志物基因表達的誘導之后，在標志物基因編碼有毒的蛋白的情形下，宿主只有在質粒存在的情形下才能夠生存，因為質粒提供了 RNA I序列，其與RNA I1-樣序列互補并因此與標志物基因轉錄物雜交，從而防止有毒的蛋白的翻譯。如上描述，系統的調芐基于質粒的RNA I以及與其互補的確定長度的RNA I1-樣序列之間的RNA-RNA相互作用，RNAI1-樣序列位于標志物基因序列(通常位于宿主的mRNA中)核糖體結合位點的上游或者下游。
[0048]RNA I1-樣序列的長度以及相對于核糖體結合位點以及相對于標志物基因的起始密碼子的距離以及位置必須保證無質粒的宿主能夠翻譯mRNA ;意味著必須小心地確保RNAI1-樣序列不干擾核糖體結合以及翻譯。
[0049]同樣地，插入的RNA I1-樣序列必須進行適當的設計以及放置以使其保證互補序列之間的足夠的RNA-RNA相互作用，從而當存在質粒的時候，從其轉錄的RNA I結合至宿主mRNA,結合程度足以抑制標志物基因的翻譯。標志物基因的抑制達到一定的程度以使提供優勢生長，與無質粒從而也不存在RNA I的細胞相比。 [0050]因此，細菌宿主進行改造以使:在不存在ColEl-型質粒的情形下，標志物mRNA翻譯成標志物蛋白，并且在存在ColEl-型質粒的情形下，蛋白的翻譯被全部地或者部分地抑制。在所述的mRNA編碼部分或者全部地抑制細胞生長的有毒的蛋白地情形下，包含該質粒地宿主將在毒性物質存在下生存或者生長超過無質粒的宿主。
[0051]對于本發明的目的，有毒的蛋白在其部分地或者全部地抑制細胞的生長的角度而言是有毒的，抑制至少至如下的程度:以使沒有標志物基因的細胞具有相對優勢的生長率。如果存在兩個細胞群，一方面為具有標志物基因的群并且，另外一方面，沒有或者帶有受抑制的標志物基因的群，以等摩爾的分布，沒有或者帶有受抑制的標志物基因的細胞群在少于10代以內將增加至占群的99%。
[0052]在本發明的實施方案中，標志物基因的表達被另外的機制調節，例如通過誘導。由于在標志物基因編碼有毒的蛋白的情形下，標志物基因在細胞增殖期間需要關閉，可誘導的啟動子有利地用于轉錄控制，其只有在加入誘導劑的情形下才促進mRNA轉錄。實例為產生T7-聚合酶的宿主中的T7啟動子，因為是T7-聚合酶在IPTG的控制下，或者乳糖-可誘導的Lac-啟動子或者阿拉伯糖-可誘導的啟動子。
[0053]或者，所述的標志物基因編碼本身不是有毒的蛋白，但是通過非直接機制的發揮作用，例如酶，其在加入底物之后，將底物修飾為有毒的物質。實例為源自Bacillussubtilis的SacB。sacB編碼稱為果聚糖鹿糖酶的蛋白。該蛋白將鹿糖轉化為果聚糖,一種對細菌有毒的物質。
[0054]ColEl-型質粒的RNA I序列代表了貢獻該系統的優勢的必要的特征。它提供了攜帶質粒宿主的篩選標準，無需借助于質粒上的其他的篩選標志物，例如抗生素抗性基因。因此，本發明提供了一種用于ColEl-型質粒的無抗生素篩選的革新系統。
[0055]在本發明的實施方案中，下述成分是有用的:
[0056]1.宿主細胞
[0057]由于其復制依賴于宿主細胞器，ColEl-型質粒是具有窄宿主范圍的質粒。復制局限于大腸桿菌以及相關的細菌如Salmonella以及Klebsiella(Kues和Stahl, 1989)。因此，宿主唯一必須的性質在于其具有復制ColEl質粒的能力。合適的宿主為廣泛使用的大腸桿菌株K12或者B株或者相關的商業提供的株，例如JM108、TG1、DH5alpha、Nova Blue、XLlBlue、HMS174 或者 L121 (評述參見 Casali, 2003)。
[0058]優選的宿主細胞的遺傳特征是突變，可以改善質粒穩定性以及完整重組蛋白的質量或者回收。期望的遺傳特性的實例為recA(缺失同源重組)、endA(缺失核酸內切酶I活性，其改善質粒微制備的質量)或者ompT(缺失外膜蛋白酶)，hsdr(廢除一些序列的限制性但是甲基化除外)，hsdS(廢除一些序列的限制性以及甲基化)。[0059]在本發明的實驗中，使用宿主株HMS174(DE3) (Novagen)，其包含DE3噬菌體，帶有在其基因組中的IPTG可誘導的T7聚合酶(Studier和Moffatt, 1986)。合適宿主的另外一個實例為HMS174 (DE) pLysS，其另外地包含pACYC184質粒(CmK)，其帶有可以降低非誘導狀態下的T7-啟動子轉錄活性的T7-溶菌酶的基因。
[0060]特別地，在致死的標志物蛋白的情形下，期望在沒有誘導下避免其表達。
[0061]2.用于改造宿主細胞的構建體
[0062]適合用于改造宿主細胞的構建體的原理顯示在圖2中:
[0063]所有的成分-兩個同源區臂[H]，啟動子+操縱子[P+0]，RNA I標志物序列(RNAI1-樣序列)，具有轉錄終止子以及Kan盒(卡那霉素抗性盒包含FRT，+/-FLP重組酶識別標志物序列；或者，可以使用其他的常規篩選標志物)的標志物基因[基因](在實施例中，GFP用于初始的實驗中)，克隆到合適的載體的多克隆位點,例如pBluescript KS+?用于基因組插入的線性片段利用限制酶切或者利用PCR擴增。
[0064]卡那霉素抗性盒能夠利用例如從pUC4K載體(Invitrogen)得到。其可以通過兩個不同的位點克隆到片段中，即標志物基因之前或者之后。為了避免在有意地開啟之前非有意的標志物基因的不成熟轉錄，該基因優選地插入在染色體基因的相反方向。
[0065]優選地，標志物構建體整合到細菌基因組中。這可以利用常規的方法實現,例如通過利用包含與染色體上中性位點同源的側面序列的線性片段，例如與attTN7_位點同源(Rogers 等，1986 ；ffaddel 和 Craig, 1988 ；Craig, 1989)或者與 recA 位點同源。片段轉化到宿主中，例如包含質粒PKD46的的大腸桿菌株MG1655或者HMS174 (Datsenko盒Wanner ；2000)。該質粒攜帶λ Red功能(Y , β , exo),可以促進體內重組。或者，可以使用DY378(Yu等，2000)，攜帶缺失的λ原噬菌體的大腸桿菌Κ12株。在MG1655或者DY378的情形下，包括表達片段的染色體位點能夠導入到HMS174(DE3)基因組中，通過利用Pl噬菌體的轉導。陽性克隆篩選抗生素抗性，例如在利用針對卡那霉素或者氯霉素的Kan盒的情形。抗性基因可以隨后利用FLP重組酶功能去除，基于酵母2小質粒的位點特異性重組系統、FLP重組酶及其重組祀位點FRTs (Datsenko和Wanner, 2000)。
[0066]或者為了將構建體整合到宿主基因組中，其可以存在于噬菌體或者不同于ColEl-型質粒的質粒上，并且從其不影響標志物基因(以及感興趣的基因)的表達的角度講其與本發明的系統相容。可以用于本發明實驗的合適的質粒或者噬菌體的實例為 pACYC184(其為 miniplasmid pl5A 的衍生物；參見 Chang 和 Cohen, 1978)，Rl-miniplasmid (Diaz 和 Staudenbauer, 1982),基于 Fl 的質粒或者絲狀卩遼菌體(Lin, 1984)或者質粒 pMMB67EH (FUrste 等，1986)。
[0067]更具體地，合適的構建體的元件能夠定義如下:
[0068]2.1.同源臂
[0069]在本發明的初始實驗中已經發現，在構建體的每一側的30bp同源區對由λ Red系統介導的重組而言是足夠的(Yu，2000)。但是，由于利用更長的同源區得到更好的結果，臂優選地為50 - 400bp。在實施例中，使用250以及350bp同源區臂。
[0070]2.2.啟動子[0071]如果外源的標志物基因產物本身對細胞有毒的或者致死的或者如果其為阻抑蛋白，其表達必須進行調節。啟動子區域必須包含合適的操縱子序列(例如Lac操縱子)以控制基因的表達。
[0072]根據本發明的一些實施方案，使用T7啟動子，tac或者，trc啟動子，Iac或者lacUV5啟動子，pBAD啟動子(Guzman等，1995), trp啟動子(被色氨酸抑制),P1啟動子(以及Ci阻抑蛋白)或者gal啟動子。
[0073]當使用Iac操縱子的時候，加入IPTG (異丙基硫代半乳糖苷，一種人造的Lac操縱子誘導劑)或者乳糖用來活化標志物基因。當使用可誘導的系統的時候，在不誘導的時候細菌能夠生存，但是一旦加入誘導劑就死亡。
[0074]為了實現有毒的基因表達的緊密調節，優選地使用緊密調節的啟動子如阿拉伯糖-可誘導的PBAD啟動子(Guzman等，1995)，尤其在標志物蛋白本身對細胞有毒的情形下。
[0075]另外一種控制標志物基因表達的方式是使用組成性啟動子結合無-毒的基因(例如報告基因)或者只有在一定的條件下才有毒的基因，例如Bacillus subtilis sacB基因。當蔗糖存在的時候，SacB才對大腸桿菌有毒的。
[0076]選擇啟動子以與下列因素相協調:標志物基因產物的作用以及需要的RNA I的下調或者沉默作用的效率。例如，對于包含無毒的或者較小毒性的標志物基因的構建體，需要更強的啟動子。
[0077]2.3.RNA I1-樣序列
[0078]由于RNA I必須充當部分的或者完全的抑制劑，與RNA I (10_555nt)互補的RNAI1-樣序列必須位于標志物基因的`上游，以及位于所述的RNA I1-樣序列上游、下游或者中的核糖體結合位點(Shine-Dalgarno序列)。Shine-Dalgarno序列(SD)指位于原核mRNA分子的翻譯起始位點的上游的短的核苷酸片段，并且充當結合核糖體RNA并且因此將核糖體帶到mRNA上的啟動密碼子處。當位于RNA I1-樣序列的上游的時候，SD序列，優選地由7個核苷酸組成(GAAGGAG)應該位于標志物基因ATG起始密碼子上游約4至15bp，例如7bp處。在核糖體結合位點位于與標志物基因互補的RNA I序列中的時候，該序列插入的方式應該使只有莖區域改變，環結構以及優選地整個二級結構應該保持不變以使反義RNA與RNAI相互作用并形成相吻復合物。
[0079]在RNA I1-樣序列之前提供起始密碼子的實施方案中，構建體得到融合的產物，包括標志物序列以及RNA I1-樣序列。
[0080]在另外一個實施方案中，RNA I1-樣序列插入到核糖體結合位點以及起始密碼子之間；該方法限于翻譯容許的可能的最大缺口，例如15至20bp (如果核糖體結合位點和起始密碼子之間的距離增加，翻譯效率下降)。
[0081]或者直接融合RNA I1-樣序列以及標志物基因，RNA I1-樣序列可以翻譯地偶聯標志物基因。為了實現這種目標，例如，可以使用如此的構建體:起始自起始的ATG，接著是RNA I1-樣序列，進一步地為核糖體結合位點，代表在終止以及起始密碼子之間重疊的序列，例如TGATG，以及標志物序列。在這種情形下，只有當RNA I1-樣序列已經翻譯并且與標志物基因相分離的時候，標志物基因才翻譯。這種設計的優點在于與標志物基因的蛋白融合不是必須的。該方法提供了分開的翻譯的選擇，這對一些標志物蛋白可能是有利的，例如在一些阻抑蛋白如Tet阻抑蛋白的情形下。
[0082]由于甚至是單個的RNA I/RNA II莖環形成相吻復合物(Eguchil991b ；Gregorian, 1995),必須確保至少形成單一環。在任何情形下，必須滿足兩個必要條件，即，一方面，標志物mRNA的翻譯而不管插入的環結構，以及另外一方面，在RNA I1-樣序列的插入的環結構以及質粒上的互補的RNA I之間有效的RNA-RNA反義反應。
[0083]在RNA I以及包含RNA I1-樣序列的標志物mRNA之間的相互作用具有抑制結合核糖體的目的，從而廢止翻譯。所述的mRNA在可誘導的啟動子(例如lac，阿拉伯糖或者T7啟動子)控制之下，并且在誘導(例如利用IPTG、乳糖、阿拉伯糖)之后，所述的標志物基因的表達下調，只要從質粒復制起點產生足夠的RNA I。優選地，標志物基因編碼致死的蛋白或者有毒的蛋白，以抑制細胞生長至少至一定的程度(如上定義)；在這種情形下，表達導致細胞死亡或者下降的細胞生長(無質粒細胞)，而下調提供了細胞-生長(攜帶質粒細胞)。
[0084]或者對于編碼致死的或者有毒的蛋白的標志物基因，標志物基因可以編碼任何蛋白，無論出于任何目的其表達在細菌細胞生長期間被調節。特別地，標志物基因可以為報告基因，如下描述(2.4.)。
[0085]在本發明的系統中，RNA I，其通常地負責質粒復制的下調，充當“基因-沉默劑”，盡管復制的抑制下降了。因此，利用本發明的系統導致質粒復制的增加，這對細菌宿主細胞的生存是有利的。
[0086]2.4.標志物基因
[0087]RNA 1-介導的標志物基因的下調，其為本發明的關鍵特征，可以適用于出于任何目的表達需要調節的任何基因。
[0088]根據第一方面，RNA 1-介導的下調可以用于對宿主是有條件地致死的標志物基因(例如評述參見Davison, 2002)。
[0089]本身有毒的并且適于用于本發明的標志物基因的實例是編碼限制性核酸酶的基因(例如CviAII，源自Chlorella病毒PBCV-1的限制性核酸內切酶；Zhang等，1992)，EcoRI (Torres等，2000)，編碼與蛋白相互作用的毒素的基因，例如鏈親和素或者Stvl3 (截短的易溶的鏈親和素變體)，如由Szafransky等，1997 ;Kaplan等，1999 ;Sano等，1995等描述，其通過剝奪細胞生長必須的蛋白生物素而發揮作用);編碼破壞膜的蛋白的基因(ΦΧ174 的 E 基因蛋白(Ronchel 等，1998 ；Haidinger 等，2002), gef (Jensen 等，1993 ；Klemm等，1995)，relF (Knudsen等，1995);編碼其他細菌毒素的基因，例如源自誘捕DNA促旋酶的F-質粒編碼強效的細胞殺死蛋白的ccdb基因(Bernard和Couturier, 1992)或者源自Bacillus Subtilis的sacB (Gay等，1983);或者編碼對細菌宿主有毒的真核毒素的基因(例如FUS ;Cr0Zat等，1993)。當使用有毒的基因的時候，必須的是其表達能夠被可誘導的啟動子調節。沒有誘導劑的時候，該啟動子必須沒有活性，但是一旦誘導提供表達，足以抑制細胞生長。
[0090]其他的對細菌有毒的并且可以用于本發明的基因實例由Rawlings, 1999中給出。
[0091]在一些實施方案中，標志物基因選自編碼限制性核酸酶、鏈親和素的基因或者具有間接有毒的作用的基因，例如如上描述的SacB。
[0092]在優選的實施方案中，有毒的標志物蛋白本身不是致死的或者有毒的或者一旦其表達存在有毒的作用，而是通過阻抑對所述的細菌細胞生長必須的基因的轉錄而發揮作用的阻抑蛋白。
[0093]在本發明的該實施方案中，在質粒存在下的RNA 1-介導的下調影響阻抑蛋白。這意味著存在RNA I及其與阻抑蛋白mRNA (RNA I1-樣序列)的相互作用導致抑制阻抑蛋白并且因此活化或者上調必需基因，作用在于細胞的生長只有在存在復制的質粒條件下才發生。在該實施方案中，必需基因的啟動子通過提供結合的DNA序列(“操縱子”)而修飾，優選地天然的啟動子被完全的、可誘導的啟動子(包含操縱子序列)所替換，以使表達的阻抑蛋白蛋白，例如Tet阻抑蛋白，能夠結合至操縱子，從而抑制必需基因的轉錄并且調節其表達，例如murA(通過Tet阻抑蛋白的表達)。
[0094]操縱子為結合其特異性阻抑蛋白或者增強子的DNA序列，從而鄰近的基因的轉錄被調節，例如位于Iac啟動子中的Iac操縱子，具有序列TGGAATTGTGAGCGGATAACAATT (SEQID NO:53 ;GiIbert和Maxam, 1973)或者其衍生物(Bahl等，1977)。不應該存在于野生-型的宿主中的阻抑蛋白基因，改造到基因組中，該基因組在可誘導的啟動子的控制下，例如T7，Iac或者tac啟動子。在正常的生長條件下，阻抑蛋白不表達。誘導之后，通過例如IPTG，阻抑蛋白表達，結合到必需基因的啟動子區中的人工導入的操縱子或者人工插入的啟動子并且因此抑制各個必需基因的表達。只要在宿主中存在復制的ColEl質粒，就產生能夠結合阻抑蛋白mRNA的RNA I，從而阻抑蛋白mRNA被相應地改變。通過這種RNA-RNA相互作用，阻抑蛋白的翻譯被抑制(類似地對任何其他的有毒的標志物蛋白)。從而，產生必需基因產物并且細胞保持活力并且生長。
[0095]本質上，在該實施方案中，細菌宿主包括，除了 RNA I1-樣序列以外，在可誘導的啟動子(其已經被改造到基因組中以修飾或者，優選地全部地替代必需基因的天然存在的啟動子)控制下的其必需基因之一(作為天然存在于細菌基因組中)。控制必需基因的啟動子區域還包含被所述的阻抑蛋白識別以及特異性地結合的DNA序列(操縱子)。該阻抑蛋白基因，其已經改造到細菌染色體中，也在不同于控制必需基因的啟動子的可誘導的啟動子的控制之下，因此這兩種啟動子是獨立地可誘導的。
[0096]必須的細菌基因在文獻中是公知的，例如Gerdes等，2002以及2003，以及PEC(Profiling the E.Col1.Chromosome)數據庫(http://www.shigen.nig.ac.jp/ecoli/pec/genes, jsp),例如 Isoleucyl-tRNA合酶(ileS)，細胞分裂蛋白如 ftsQ、ftsA、ftsZ、DNA聚合酶III α亞基(dnaE)、murA、map、rps A(30s核糖體蛋白SI)、rps B(30s核糖體蛋白S2)、lyt B(全局調節子)等。
[0097]阻抑蛋白是結合至操縱子位于操縱子中的啟動子的蛋白，從而下調位于所述的操縱子中的基因的轉錄。適合用于本發明的阻抑蛋白的實例為四環素阻抑蛋白(tet)蛋白TetR，其調節革蘭(氏)陰性的細菌中的四環素抗性決定簇家族的轉錄，并結合至四環素(Beck,等，1982 ；Postle等，1984),色氨酸阻抑蛋白(trp),其結合至trp操縱子的操縱子，trp操縱子包含色氨酸生物合成基因(Yanofski等，1987)。
[0098]可誘導的啟動子的實例為啟動子，其中在加入物質之后開始轉錄，因此能夠被環境因素調節，例如Iac啟動子，其可通過IPTG誘導(Jacob和Monod, 1961)，阿拉伯糖-啟動子(pBAD)、可被阿拉伯糖誘導(Guzman等，1995),以及銅-可誘導的啟動子(Rouch和Brown, 1997)。[0099]在本發明的實驗中，選擇tet-阻抑蛋白(tetR)作為阻抑蛋白基因，充當“有毒的”標志物基因，一旦加入誘導劑IPTG就關閉必須的細囷基因。
[0100]為了執行阻抑蛋白基因方法，涉及了兩種類型的盒并在本發明的實驗中(實施例4)插入到細菌染色體中。第一種構建體包括用來替換(或者修飾)基因組上特定的必需基因的啟動子的盒。第二種類型的盒用作測試構建體，使用GFP作為必需基因的替代物以提供思想的證據。使用GFP測試構建體的實驗目的在于評價級聯調節系統、啟動子強度以及因此對系統中所有相互作用成分的調節。
[0101]因此，在另一個實施方案中，標志物基因是報告基因，例如編碼GFP(綠色熒光蛋白)、hSOD (人超氧化物岐化酶)、CAT (氯霉素乙酰轉移酶)或者螢光素酶。 [0102]當需要有關宿主細胞中存在或者缺失ColEl-型質粒或者質粒拷貝數的信息的時候報告基因可用于培養過程。當發酵過程需要對質粒拷貝數的控制進行優化的時候，這些信息特別有用。
[0103]報告基因也可以充當有毒的標志物基因的替代物，并且可以因此可以用于實驗，該實驗的目的在于提供構建體的如下功能:用于基因調節或者沉默以及確定其對有毒的標志物基因的作用。
[0104]為了評價設計用來改造細菌宿主以使有毒的標志物基因的表達能夠被ColEl-型質粒調節的構建體的功能，報告基因，綠色熒光蛋白“ (GFP)用作本發明初始實驗中的模型。由于其自發熒光(Tsien，1998)，被認為在初始實驗中，GFP適合用來分別地代替標志物基因，或者必需基因。
[0105]在一些本發明的實施方案中，標志物基因可以為內源性的宿主基因，其可以為任何意欲調節的感興趣的基因。在這種情形下改造宿主細胞以使編碼RNA I1-樣序列的序列與相關的宿主基因可操作地連接，如2.3中所述。
[0106]3.ColEl-型質粒
[0107]在本發明中，所有的ColEl-型質粒及其天然的RNA I/RNA II對，以及修飾的RNAI和/或RNA II序列，例如在W002/29067中描述的那些，可以使用。
[0108]如上所述，代表性的可用的ColEl-型質粒為天然存在的ColEl質粒pMBl、pl5A、PJHCMWl,以及常用的以及商業提供的克隆工具如PBR322以及相關的載體，pUC質粒，pET質粒以及pBluescript載體。
[0109]在質粒序列中不需要包括抗生素抗性基因。作為必須的元件，質粒基本上只包含ColEl復制起點以及攜帶感興趣基因的基因表達盒。
[0110]質粒上的感興趣的基因及其啟動子取決于應用的類型；本發明不以任何方式限制于感興趣的基因，例如治療性基因。對于基因治療應用，基因可以與真核啟動子可操作地連接，例如CMV啟動子。
[0111]本發明的應用:
[0112]本發明能夠廣泛地用于現代發酵中，包括用于質粒DNA制備以及用于制備重組蛋白二者。
[0113]已經描述了可以用于本發明的發酵pDNA的數種方法。質粒DNA制備的方法在施加到細胞上的控制水平以及影響發酵的多種因素方面不同:
[0114]對于實驗室水平的pDNA制備，在搖瓶種培養攜帶質粒細胞是最簡單的方法(O' Kennedy 等，2003 ；Reinikainen 等，1988 ;0' Kennedy 等，2000 ；US6, 255, 099)。
[0115]為了得到更高數量的質粒，細胞能夠在稱為“批發酵"的受控發酵桶中進行培養，其中在起始的時候提供所有的營養成分并且其中在培養的過程中不加入營養成分。這種類型的培養可以利用包含所謂的“復合物成分”的培養基作為碳以及氮源進行，如例如由 O' Kennedy 等，2003,以及 Lahijani 等，1996，以及在 W096/40905, US5, 487，986 核W002/064752中記載。或者，合成的培養基可以用于pDNA產生，例如特定用于pDNA產生的確定的培養基(Wang 等，2001 ;W002/064752)。
[0116]本發明也可以用于大腸桿菌的補料分批發酵，其中一或者多種營養成分通過補料提供給培養物，通常地通過利用反饋控制算法通過補料營養成分以將過程參數控制在確定的設定點。在發酵過程中，反饋控制因此直接與細胞活性相關。可以用于發酵的反饋控制的控制參數包括PH值，在線測定的細胞密度或者溶解的氧張力(DOT)。通過補料速率用于將溶解的氧張力控制在確定的設定點的反饋算法記載在W099/61633中。
[0117]另外，更復雜的算法利用DOT以及pH值二者作為用于反饋培養方法的控制參數(US5, 955，323 ；Chen 等，1997)。
[0118]另外一種補料模式基于按照指數函數的補料培養基提供。補料速率基于期望的特定的生長速率μ進行控制。W096/40905以及O' Kennedy等，2003描述了用于質粒DNA制備的指數補料分批方法。Lahijani等，1996,描述了聯合指數補料以及溫度可控制的質粒復制增加。
[0119]或者，本發明可以用于制備質粒DNA的方法，其中大腸桿菌細胞首先在預先培養基中生長并且隨后在主培養物中發酵，主培養為補料分批方法包括分批階段以及補料階段。分批階段的培養基以及在補料階段加入的培養基是化學確定的，并且補料階段的培養基包含生長-限制性底物并且補料加入的速率符合預定的指數函數，從而將特定的生長速率控制在預定值。`
[0120]當標志物基因在可誘導的啟動子的控制下的時候，在開始的時候和/或脈沖的方式可以將誘導劑加入到批中(在批以及在補料分批培養二者中)。在補料階段，誘導劑可以脈沖的方式或者連續地加入。
[0121]在發酵過程結束的時候，將細胞富集并分離質粒DNA并且根據本領域公知的方法進行純化，例如利用基于陰離子交換的以及凝膠滲透層析的方法，如在US5，981，735中記載，或者通過利用兩個層析步驟，即，陰離子交換層析作為第一步驟并且反相層析作為第二步驟，如在US6，197，553中所描述。制備質粒DNA的另一個合適的方法記載在W003/051483中，其利用兩個不同的層析步驟，結合monolithic支持。
[0122]除了將本發明用于質粒制備以外，例如用于制備用于基因治療應用的質粒，也可以用于重組蛋白制備。
[0123]關于重組蛋白制備，原則上，可以使用已經被證明可以用于表達大腸桿菌中感興趣基因的任何方法，尤其是源自ColEl型質粒(參見評述，例如Jonasson等，2002 ；Balbas, 2001)。蛋白可以在細胞內(全部地或者部分地可溶或者作為包涵體)或者通過分泌(到細胞培養基或者壁膜間隙)的方式得到，從批發酵或者，優選地補料分批培養，利用復合的、合成的或者半合成的培養基。
[0124]在質粒DNA制備中，通常用于基因治療的質粒DNA，感興趣的基因不在細菌宿主細胞中表達。考慮到其在哺乳動物優選地人中的應用，其中其必須最終地表達，感興趣的基因通常與真核啟動子可操作地連接。與此對應的是，對于在大腸桿菌中的重組蛋白的制備，感興趣的基因的將在原核啟動子的控制在宿主細胞中表達。
[0125]對于重組蛋白的制備，兩種啟動子，即控制標志物基因的啟動子以及感興趣基因的啟動子，可以相同或者不同，只要不發生擾亂其中任何一種表達的干擾。
[0126]有利地，由于其活性在時間點以及轉錄水平上相互獨立，啟動子是不同地被調節。優選地，控制標志物基因地啟動子在發酵過程開始的時候具有活性并且產生適度量的mRNA,同時感興趣基因的啟動子是相當強的并且在發酵過程中的選擇的時間點激活。如果對感興趣的基因以及標志物基因二者都使用可誘導的啟動子，通常選擇以使利用不同的誘導劑開啟它們。或者，標志物基因可以在可誘導的控制之下并且感興趣的基因在組成性啟動子的控制之下，或者反之亦然。這對下述兩種方法都適用:其中標志物基因構建體整合到細菌宿主基因組中，以及其中標志物基因構建體包含在質粒或者噬菌體中，如上描述。
[0127]關于啟動子在發酵各階段的誘導，針對質粒DNA制備的上述原理也適用。
[0128]本發明的巨大優勢在于所有復制的質粒無抗生素抗性基因并且因此，除了用于基因治療應用以外，適合用于其中缺失抗生素抗性基因是需要的或者期望的所有的應用，例如用于產生將用于人體以及動物食物制備的重組酵母株或者用于產生重組植物。
[0129]附圖簡述:
[0130]圖1:RNA 1-介導的標志物基因下調或者沉默的原理
[0131]圖2:用于改造宿主細胞的構建體
[0132]圖3:利用體內轉錄的構建體雜交實驗的結果
[0133]圖41)-1II):包含標志物基因和RNA I1-樣序列的構建體
[0134]圖5:存在pBR322的條件下的基因下調作用
[0135]圖6:多種質粒的基因下調作用
[0136]圖7a_7b:在發酵期間標志物基因的表達/抑制
[0137]圖8:基于包括必需基因啟動子替換的必需基因的構建體的原理
[0138]圖9:用于阻抑作為必需基因替代物的GFP的測試構建體。
[0139]圖10:利用插入到HMS174(DE3)基因組中的測試構建體的搖瓶實驗結果
[0140]在實施例1和2中，使用在表1中顯示的寡核苷酸:
[0141]表1:[0142]
【權利要求】
1.一種非天然存在的細菌細胞，包含 i)編碼表達可被調節的標志物蛋白的DNA序列，并且所述的DNA序列可操作地連接至下述序列， ii)編碼RNAII序列或其部分的DNA序列，并且所述的RNA序列 a)互補于可從帶有ColEl復制起點的質粒轉錄的RNAI序列， b)只包含一個或兩個環,且 c)與位于所述RNAII序列或其部分的上游或下游的核糖體結合位點一起存在于編碼所述標志物蛋白的標志物基因的上游， 其中RNA II序列或其部分進行設計以及放置以使其保證互補序列之間的足夠的RNA-RNA相互作用，從而當存在質粒的時候，從其轉錄的RNA I結合至宿主mRNA，結合程度足以抑制從DNA序列i)轉錄的mRNA的翻譯。
2.權利要求1的細菌細胞，包含整合到其基因組中的所述的DNA序列i)和ii)。
3.權利要求1或2的細菌細胞，其中所述的DNA序列i)對所述的細胞而言是外源的DNA序列。
4.權利要求3的細菌細胞，其中所述的外源的DNA序列i)編碼對所述的細胞而言是致死的或者有毒的標志物蛋白。
5.權利要求4的細菌細胞，其中所述的外源的DNA序列i)在可誘導的啟動子控制下。
6.權利要求4的細菌細胞，其中所述的外源的DNA序列i)編碼標志物蛋白，所述的標志物蛋白本身或者通過產生有毒的物質而對于所述的細胞是致死的或者是有毒的。
7.權利要求4的細菌細胞，其中所述的外源的DNA序列i)編碼阻抑蛋白，所述阻抑蛋白通過阻抑對所述的細胞的生長必需的基因的轉錄對所述的細菌細胞是致死的或者有毒的。
8.權利要求7的細菌細胞，其被改造成使所述的必需基因可操作地連接到啟動子，該啟動子包含被所述的阻抑蛋白識別并且特異地結合的DNA序列。
9.權利要求8的細菌細胞，其中連接至所述的必需基因的所述的啟動子是可誘導的。
10.權利要求9的細菌細胞，其中所述的可誘導的啟動子是可誘導的，獨立于權利要求5的可誘導的啟動子。
11.權利要求1的細菌細胞，其中所述的DNA序列ii)插入到所述的DNA序列i)的起始密碼子以及核糖體結合位點之間。
12.權利要求1的細菌細胞，其中核糖體結合位點位于標志物基因ATG起始密碼子上游4至15bp,例如7bp處。
13.權利要求1的細菌細胞，其中連接所述的DNA序列i)以及所述的DNA序列ii)以使其編碼融合蛋白。
14.權利要求1的細菌細胞，其中所述的DNA序列i)以及所述的DNA序列ii)翻譯地偶聯。
15.權利要求1的細菌細胞，其中起始密碼子在RNAII序列之前，得到融合產物。
16.權利要求1~15中任一項的細菌細胞，其具有復制帶有ColEl復制起點的質粒的能力。
17.權利要求16的細菌細胞，其為大腸桿菌細胞。
18.宿主-載體系統,包括 a)帶有ColEl復制起點的質粒； b)其中所述的質粒a)能夠被復制的細菌宿主細胞，包含 i)編碼表達可被調節的標志物蛋白的DNA序列，并且所述的DNA序列可操作地連接至下述序列， ii)編碼RNAII序列或其部分的DNA序列，并且所述的RNA序列 -互補于可從質粒a)轉錄的RNA I序列， -只包含一個或兩個環，且 -與位于所述RNA II序列或其部分的上游或下游的核糖體結合位點一起存在于編碼所述標志物蛋白的標志物基因的上游； 其中在ii)中定義的所述的RNA序列，在不存在質粒a)的情形下，容許所述的蛋白的表達以及 其中，當所述的質粒a)存在于所述的宿主細胞中的時候,從質粒轉錄的RNA I分子與在ii)中定義的所述的RNA序列雜交，從而所述的蛋白的表達被抑制。
19.權利要求18的宿主-載體系統，其中所述DNA序列i)整合到細菌基因組中。
20.權利要求18的宿主-載體系統，其中所述的細菌宿主細胞b)是在權利要求2~14以及17中任一項定義的細菌細胞。`
21.權利要求18~20中任一項的宿主-載體系統，其中所述的外源的DNA序列i)編碼對所述的細菌細胞而言致死的或者有毒的蛋白，并且其中在ii)中定義的所述的RNA序列在缺失質粒a)的情形下，容許所述的致死的或者有毒的蛋白的表達以使所述的宿主細胞的生長被全部或者部分地抑制，并且其中，當所述的質粒a)存在于所述的宿主細胞中，從質粒轉錄的RNA I分子與在ii)中定義的所述的RNA序列雜交，從而所述的致死的或者有毒的蛋白的表達被抑制，從而帶有質粒的細胞的完全或者部分生長抑制被取消。
22.權利要求18的宿主-載體系統,其中所述的質粒a)另外地包含感興趣的基因。
23.權利要求22的宿主-載體系統，其中所述的感興趣的基因是治療蛋白。
24.權利要求18~23中任一項的宿主-載體系統,其中所述的質粒為pUC質粒。
25.—種產生質粒DNA的方法，包括下述步驟 i)利用具有ColEl復制起點并且包含感興趣基因的質粒轉化權利要求4的細菌細胞群，所述的感興趣的基因在所述的細菌宿主細胞中不從所述的質粒表達， ii)將所述的細菌宿主細胞群在所述的致死的或者有毒的蛋白在細胞中可以表達的條件下生長，從而所述的蛋白的表達全部地或者部分地抑制無質粒-細胞的生長，從而攜帶質粒的細胞的生長超過無質粒的細胞， iii)富集攜帶質粒細胞，并且 iv)分離并純化質粒DNA。
26.權利要求25的方法，其中所述的感興趣的蛋白是治療蛋白，其可操作地連接至真核啟動子以容許在哺乳動物中表達。
27.一種制備感興趣的蛋白的方法，包括下述步驟 i)利用具有ColEl復制起點并且包含編碼感興趣蛋白的DNA序列的質粒轉化權利要求4的細菌細胞群，所述的DNA序列在原核啟動子的控制下能使所述的蛋白在所述的細菌宿主細胞中表達； ii)將所述的細菌宿主細胞群在所述的致死的或者有毒的蛋白在細胞中可以表達的條件下生長，從而所述的蛋白的表達全部地或者部分地抑制無質粒-細胞的生長，從而攜帶質粒的細胞的生長超過無質粒的細胞， iii)富集感興趣的蛋白，并且 iv)分離并且純化該蛋白。
28.權利要求25或者`26的方法，其中所述的質粒為pUC質粒。
【文檔編號】C12R1/19GK103555644SQ201310409070
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2005年9月8日 優先權日:2004年9月17日
【發明者】萊因加德.格拉貝爾, 艾琳.普法芬澤勒 申請人:貝林格爾.英格海姆Rcv兩合公司