一種胚胎干細胞無血清培養基及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種胚胎干細胞無血清培養基及其應用，所述的培養基包含以下組分：小分子抑制劑CHIR99021、XAV939，添加物B27/N2和基礎培養基DMEM/F12。本發明使用兩個小分子抑制劑CHIR99021、XAV939和成分明確的B27/N2添加物取代了傳統胚胎肝細胞培養基中的血清和飼養層細胞，提供了一種沒有動物源物質、成份確定的胚胎干細胞培養基，實驗證實該培養基不僅可以維持人胚胎干細胞的自我更新，并且能在較長時間內維持胚胎干細胞的未分化狀態和全能性，且由于其成分清晰明確，所含蛋白和其他成分皆來自人源重組蛋白或化學合成，不會造成胚胎干細胞污染，故而不會激起相應免疫反應，引發免疫排斥。
【專利說明】ー種胚胎干細胞無血清培養基及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及胚胎干細胞的培養，具體地說，是ー種胚胎干細胞無血清培養基及其應用。
【背景技術】 [0002]胚胎干細胞(Embryonic Stem Cells, ES Cells)是由早期胚胎內細胞團(Innercell mass, I CM)或原始生埴細胞(Primordial germ cells,PGCs)經體外分化抑制培養篩選出的ー種全能干細胞。胚胎干細胞的形態特征與早期胚胎細胞非常相似，具有穩定的自我更新能力，長時間體外繼代培養后仍能保持正常的二倍體染色體結構；同時胚胎干細胞也有非常強的分化能力，在特定的條件培養下，它可以増殖分化為全身200多種細胞類型。因此胚胎干細胞可以提供ー種理想的生物學平臺，用于科學研究與臨床應用，如藥物篩選、細胞發育與分化的分子調節機制研究、組織工程種子細胞及基因治療載體的建立、細胞治療及再生醫學等。
[0003]要想充分運用干細胞，首先要建立和維持好干細胞系。ES細胞的培養關鍵是既要維持細胞的未分化狀態和潛能性，又要使其無限増殖。傳統建立和維持人胚胎干細胞系的標準方法是:ESC生長在有絲分裂失活的飼養層細胞(FEEDER)上，基本培養基多為DMEM并添加胎牛血清(FCS)及白血病抑制因子(LIF)等。但是，這種培養系統中含有大量的動物源成份，如血清及飼養層細胞等。大量動物源成份的長期使用不僅增加了胚胎干細胞感染外源性病毒、病原體的危險性，還可能造成胚胎干細胞的污染。移植此種來源的胚胎干細胞，潛在的外源性病原體將感染患者，那些被污染的胚胎干細胞也有可能在患者體內誘發激發強烈的免疫反應，發生免疫排斥，這些潛在風險必將極大限制胚胎干細胞的臨床應用。已有文獻報道，飼養層細胞或血清產品培養的人類胚胎干細胞表達Neu5Gc，ー種非人類的唾液酸，這種被污染的人類胚胎干細胞將有很大的可能在患者體內誘發免疫反應。同吋，飼養層細胞及血清的使用還對ESC生長、増殖及分化等分子機理研究造成限制，也將給藥物篩選帶來干擾。另外，傳統培養系統中各種復雜未知的營養成份，在長期培養過程中，也有可能會選擇或改變胚胎干細胞的某些表型。因此，為了更好的利用胚胎干細胞的這ー理想的生物學平臺，必須優化培養系統，建立ー個沒有動物源物質、成份確定的人胚胎干細胞無血清培養基。并且該培養基既能維持胚胎干細胞的未分化狀態和潛能性，又能使其無限増殖。
[0004]CHIR99021和XAV939均為小分子抑制劑，它們的結構分別如下:
【權利要求】
1.ー種胚胎干細胞無血清培養基，其特征在于，它包含以下組分:小分子抑制劑CHIR99021、XAV939，添加物B27/N2和基礎培養基DMEM/F12，所述的添加物B27/N2的組分及各組分重量比為:添加物N2 組分重室比
2.根據權利要求1所述的胚胎干細胞無血清培養基，其特征在于，所述的小分子抑制劑 CHIR99021 和 XAV939 的摩爾比為 0.8-0.95:0.95-1.08。
3.根據權利要求1所述的胚胎干細胞無血清培養基，其特征在于，所述的基礎培養基DMEM/F12的組分及各組分重量比為:
4.權利要求1-3任一所述的胚胎干細胞無血清培養基在培養胚胎干細胞中的應用。
【文檔編號】C12N5/0735GK103555660SQ201310404474
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年9月9日 優先權日:2013年9月9日
【發明者】呂萬革, 郭亞楠, 陳旭, 陳剛 申請人:依科賽生物科技（太倉）有限公司