新型微生物殼聚糖酶的研究技術(shù)的制作方法
【專利摘要】新型微生物殼聚糖酶的研究技術(shù)，研究的是大多數(shù)微生物來源的殼聚糖酶屬于誘導(dǎo)酶，一般以殼聚糖為誘導(dǎo)物它們的降解產(chǎn)物為阻遏物，因此當(dāng)以殼聚糖作為唯一碳源時,微生物的產(chǎn)殼聚糖酶的能力就能被誘導(dǎo)出來。根據(jù)此理論,篩選產(chǎn)殼聚糖酶微生物多采用“透明圈平板法”：即采用以殼聚糖為唯一碳源和氮源的固體培養(yǎng)基平板進行富集培養(yǎng),限制大多數(shù)不能利用殼聚糖的微生物生長,而能產(chǎn)生殼聚糖酶的微生物由于能利用殼聚糖的降解產(chǎn)物進行生長繁殖。由于殼聚糖被微生物降解,于是在白色不透明膠體殼聚糖平板上能夠產(chǎn)殼聚糖酶的微生物的菌落周圍就會形成一個透明圈,通過比較透明圈直徑和菌落直徑的比值,就可以初步定量的確定產(chǎn)殼聚糖酶活力的大小。由于天然菌株產(chǎn)殼聚糖酶的能力一般較低,現(xiàn)在大多都使用誘變育種。
【專利說明】新型微生物殼聚糖酶的研究技術(shù)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及新型微生物殼聚糖酶的研究技術(shù)，具體的說，是一種減少能源浪費的方法，屬于環(huán)保領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]殼聚糖(Chitosan，簡稱CTS)學(xué)名為聚(1，4) _2_氨基_2_脫氧-β-D-葡萄糖，是甲殼素脫乙酰化而得到的一種生物高分子，是目前唯一商品化的堿性多糖。由于殼聚糖具有無毒、可被生物降解、良好的生物容性和成膜性等優(yōu)良特性，因此在農(nóng)業(yè)、醫(yī)療衛(wèi)生等方面有廣泛的用途[I]。但是殼聚糖的分子量大，水溶性較差，在人體內(nèi)不易吸收，使其應(yīng)用受到限制。近年來研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖的降解產(chǎn)物殼寡糖(Ch10ligosaccharides)具有獨特的生理功能，如抗腫瘤、抗菌、免疫激活及保濕等顯著特點，使其有著更為廣闊的應(yīng)用前景。酶法制備殼寡糖由于具有條件溫和、無污染，酶解產(chǎn)物較易控制等優(yōu)點，成為當(dāng)前甲殼素學(xué)科中最重要的一個分枝。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003]本發(fā)明的目的在于，解決大多數(shù)微生物產(chǎn)殼聚糖酶的活性低，生產(chǎn)過程中酶活損失大，因此造成殼寡糖生產(chǎn)成本相對較高，影響殼聚糖酶的工業(yè)應(yīng)用。
[0004]發(fā)酵液經(jīng)離心去菌體、(NH4)2S04鹽析、Q-Sepharose FastFlow陰離子交換、SephacrylS-1OO凝膠過濾后，SDS-PAGE電泳顯示只有I條帶，酶的分子質(zhì)量為66200u，純化倍數(shù)為28.9倍，收率為47.6%。Aktuganov等[15]對Bacillussp.739產(chǎn)的殼聚糖酶進行了分離純化研究:發(fā)酵液經(jīng)離心、(NH4) 2S04鹽析、DEAE-S印hadexA-50陽離子交換層析后，活性蛋白在SDS-PAGE上僅呈I條帶，酶分子質(zhì)量為46000U。孫菲等[16]對菌株JHOl產(chǎn)的殼聚糖酶進行了分離純化:發(fā)酵液經(jīng)抽濾、濃縮、DEAE Cellulose 52離子交換層析后，在SDS-PAGE上只有I條蛋白質(zhì)譜帶，分子質(zhì)量是30000 U，酶回收率為66.3%，純化倍數(shù)為
11.70 倍。
[0005]由于大多數(shù)微生物產(chǎn)殼聚糖酶的活性低，在生產(chǎn)過程中酶活損失大，因此造成殼寡糖生產(chǎn)成本相對較高，影響殼聚糖酶的工業(yè)應(yīng)用。經(jīng)過固定化后的殼聚糖酶其穩(wěn)定性得到了提高，并可循環(huán)使用，在殼聚糖酶的研究中，固定化是一個重要的方向。潘曉榕等[17]采用吸附交聯(lián)法對假單胞菌(Pseudomonas) CUY8產(chǎn)殼聚糖酶固定時,最佳pH值為4.0,最佳溫度65°C，米氏常數(shù)為14.71mg/ml半衰期為45d ;采用包埋法活得的殼聚糖酶的最佳pH值為5.5，最佳溫度35°C，米氏常數(shù)為5.91mg/ml半衰期為37d.。固定后的殼聚糖酶較游離酶相比有明顯優(yōu)勢。段彬等[18]固定化細胞產(chǎn)酶的研究結(jié)果表明，多孔玻璃可以有效吸附無花果沙雷氏菌(Serrratia.ficaria CH-0203)菌細胞,在最適發(fā)酵條件下(pH 6.5,培養(yǎng)基與載體的總體積48mL，載體與培養(yǎng)基的比例為1.5g/4.0mL，吸附時間是2(T26h)，發(fā)酵液酶活達到4.5 U/mL，比游離細胞發(fā)酵提高了 16 % ;采用半連續(xù)發(fā)酵的方式，固定化的細胞可以穩(wěn)定發(fā)酵產(chǎn)酶120 h左右。固定化細胞產(chǎn)酶的效率大大高于游離細胞。
【具體實施方式】
[0006]本發(fā)明新型微生物殼聚糖酶的研究技術(shù)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，殼寡糖可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生光譜抗性，增強植物自身的防衛(wèi)能力。抑制多種病源微生物的生長；還可以作為新型植物生長調(diào)節(jié)劑，促進植物生長，提高發(fā)芽率和抗病性。Hzdwiger和Beckman研究發(fā)現(xiàn),豌豆的內(nèi)果皮內(nèi)含有的殼聚糖酶能夠降解F.solan1.f.sp.pisi和F.solan1.f.sp.phaseoli的細胞壁生成殼聚糖和殼寡糖，對F.solan1.f.sp.pisi和F.solan1.f.sp.phaseoli具有殺菌作用，并且還可以作為激發(fā)子，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生植保素[19]。裘迪紅等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，用低聚殼聚糖處理水稻、玉米，出芽率和產(chǎn)量都明顯上升。用殼聚糖處理冬小麥種子，可增產(chǎn)5°/Γ30%，品質(zhì)也有提高，如蛋白質(zhì)增加3.36%，濕面筋增加21.5%，干面筋增加20%。
【權(quán)利要求】
1.新型微生物殼聚糖酶的研究技術(shù)，其特征在于，殼聚糖酶是降解殼聚糖的專一性酶，將殼聚糖降解為低分子量的殼寡糖，即由2?10個氨基葡萄糖通過β -1, 4-糖苷鍵連接而成的低聚糖，殼寡糖以其獨特的生物學(xué)功能，在食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域有著廣泛的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型微生物殼聚糖酶的研究技術(shù)，其特征在于，殼寡糖可作為人體腸道的微生態(tài)調(diào)節(jié)劑，服用殼寡糖能使腸道內(nèi)的雙歧桿菌、乳桿菌等有益軍的數(shù)量明顯增高；殼寡糖具有爽口的甜味，不易被體內(nèi)消化液吸收，具有很好的保濕性和耐熱性，幾乎不產(chǎn)生熱量，是糖尿病人理想的功能性甜味劑；殼寡糖還具有很好的防腐性，可作為食品防腐劑；由于低聚殼聚糖有許多親水的游離胺基及羥基，對水有很高的親和力和持水性，因此可永固果蔬的保鮮，起到保濕，增濕和防腐的作用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的述新型微生物殼聚糖酶的研究技術(shù)，其特征在于，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，殼寡糖可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生光譜抗性，增強植物自身的防衛(wèi)能力。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的述新型微生物殼聚糖酶的研究技術(shù)，其特征在于，在醫(yī)藥方面，小分子殼寡糖具有優(yōu)良的抗腫瘤活性，特別是六聚糖具有很強的抑制腫瘤的作用。
【文檔編號】C12N9/42GK104419693SQ201310403882
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月9日
【發(fā)明者】王維燁 申請人:天津市聚賢科技孵化器有限公司