一種煙草疫霉菌分子檢測引物及其檢測方法

一種煙草疫霉菌分子檢測引物及其檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種煙草疫霉菌分子檢測引物及其檢測方法，專用于煙草疫霉菌特異分子檢測。主要設計了一對煙草疫霉菌的特異引物（上游引物YhF:5'-GACATGATATCAACTGTTCTGCAG-3'和下游引物YhR:5'-CCTTGGATCTTCTCTCGATAAG-3'），經過PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳，可在煙草疫霉菌純DNA、帶菌的發病組織特異性地擴增出片段長度為342bp的擴增產物。本發明可被用于生產實踐中煙草疫霉菌感染的植物組織中煙草疫霉菌的快速、靈敏、特異的檢測，同時可用于田間病害的早期診斷和病菌的監測和鑒定，為煙草疫霉菌引起病害的防治提供可靠的技術和理論依據。
【專利說明】一種煙草疫霉菌分子檢測引物及其檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種煙草疫霉菌分子檢測引物及其檢測方法，專用于煙草疫霉菌高靈敏度快速分子檢測，同時可用于田間煙草黑脛病的早期診斷和病菌的監測和鑒定，屬于農作物病害檢測、鑒定及防治【技術領域】。
【背景技術】
[0002]由煙草疫霉菌(Phytophthora nicotianae Breda de Haan)引起的煙草黑胚病是一種毀滅性世界病害。1896年van Breda de Haan在印度尼西亞的爪睡首次發現,此后該病流行蔓延迅速，1922年便成為美國的佛羅里達、堪薩斯州煙區的嚴重病害。1924年后，該病己遍布于全世界溫帶、亞熱帶和熱帶地區煙田。中國于1950年首次報道，當時該病發生在黃淮煙區，目前各主要產煙區均有不同程度的發生，其中安徽、山東、河南為歷史上的重病區；云南、貴州、四川、湖南、廣東、廣西、福建等南方煙區發生亦相當普遍，平均發病率為5%-12%，嚴重田塊發病率高達75%，甚至造成絕收。煙草疫霉的寄主范圍很廣，可以侵害數百種植物，病害通常在潮濕、多雨條件下發病重，潛育期短，可多次再侵染，傳播與蔓延迅速，常造成寄主植物成片死亡。近年來，由于我國連作煙田面積不斷擴大，連作年限不斷增加，加重了該病害的流行，我國平均每年因煙草黑脛病造成的經濟損失達I億元以上，僅次于煙草病毒病。該病屬于維管束系統性病害，一旦發生就很難控制，對煙草威脅極大，并常與其他煙草根莖部病害混合發生，給病害的診斷造成困難，而生產上則常因不明發病原因，難以有針對性的防治措施，故造成更為嚴重危害。因此建立煙草疫霉菌快速檢測體系，早期對發病植株及土壤進行疫霉菌快速準確檢測，對預測病害發生情況、及時采取有效的防治措施控制病原菌的傳播和流行、減少經濟損失都具有重要的理論和實際意義。
[0003]傳統煙草疫霉菌的分類鑒定主要是基于形態學特征、致病性測定、生理生化特性等，程序繁瑣，所需時間較長，鑒定時還易受人為及環境等諸多因素的干擾，而且不能直接從植物組織中檢測出病原菌，難以滿足病害控制中快速、靈敏、穩定的檢測要求，很容易錯過病害防治的最佳時期，而免疫血清學鑒定方法雖已建立，但是特異性較差，常常受到抗血清質量的影響，容易造成假陽性，因此這些方法的應用均受到一定的限制。
[0004]近年來隨著分子生物學技術的發展，以聚合酶鏈式反應(PCR)技術為代表的分子檢測方法得到了迅速的發展和應用，PCR技術的應用在很大程度上彌補了傳統方法的不足，這類方法普遍具有特異、靈敏、快速且不需要進行病原菌分離培養的特點，可用于煙草疫霉引起病害顯癥之前的早期監測。
[0005]利用核糖體轉錄間隔區(rDNA-1TS)基因序列在物種進化過程中的保守性和異變性設計引物進行PCR擴增已在棉花、番茄、西瓜等作物的病害檢測中得到了廣泛的應用。但是越來越多的研究發現，在疫霉屬中，部分疫霉菌種間ITS序列差異很小，以ITS為靶標設計的引物難以將這部分疫霉菌與其近緣種區分開，因此要對煙草疫霉菌進行高靈敏性和特異性檢測，應從疫霉菌其它基因上設計引物。已有的研究表明，疫霉菌屬中的YPTl基因(ras-related protein)是一個與原癌基因Ras (Rat sarcoma)相關的基因，在酵母中，該基因編碼一個與Ras相關的GTP結合蛋白。YPTl基因包含有多個外顯子和內含子，多個外顯子具有保守性，而這些內含子在不同種之間具有多變性，非常適合于設計引物進行疫霉屬卵菌近緣種的分子檢測，區分不同種的疫霉菌。Schena等分析了 29個疫霉種43個菌株的YPTl基因的序列，認為YPTl基因作為疫霉菌分子檢測的靶標基因在理論上是可行的。
[0006]因此，可以通過測定煙草疫霉菌及其它疫霉菌的YPTl基因，并進行多重比對分析，來鑒定煙草疫霉菌。該檢測方法目前尚未見報道。

【發明內容】

[0007]本發明的目的是針對現有技術中煙草疫霉菌的生物學檢測方法特異性差，靈敏度低、所需周期長、免疫血清學鑒定方法容易造成假陽性的問題，提供煙草疫霉菌特異分子檢測引物以及結果可靠、易于操作、特異性強、靈敏度高的煙草疫霉菌快速分子檢測的方法。
[0008]實現本發明的目的包括下列步驟:
1.通過測定煙草疫霉菌及其它疫霉菌的YPTl基因，并進行多重比對分析，設計了對煙草疫霉菌具有特異擴增作用的I對PCR引物，即特異分子檢測引物的序列為:
上游引物 YhF: 5’- GACATGATATCAACTGTTCTGCAG -3’
下游引物 YhR: 5’- CCTTGGATCTTCTCTCGATAAG -3’
對煙草疫霉菌特異性擴增出342 bp的產物。
[0009]2.煙草疫霉菌特異分子檢測體系的建立Cl)從被煙草疫霉菌感染的植物組織中提取DNA。
[0010]當在用于植株組織中`存在煙草疫霉菌時，按NaOH快速裂解法提取DNA，具體過程如下:①將煙草病葉或病莖洗凈、晾干，剪取發病部位；②按I mg病葉或病莖加入10uL(0.5mol/L NaOH, 0.5%PVP)計量,將組織充分磨碎成糊,在12,000 g離心機中離心6min ;③取上清20uL與等體積的0.1 mol/L的Tris-HCl (pH8.0)混合；④取I uL作為PCR模板進行擴
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[0011](2)以步驟(1)提取的DNA為模板，利用YhF/YhR這一對引物進行PCR擴增。
[0012]PCR 反應體系 25 μ 1，包括 2.5 μ L 10XPCR buffer (Mg2+free)，2.0 mmol/LMgCl2,0.2 mmol/L dNTP, 1.0 U Taq DNA聚合酶(Takara大連寶生物工程有限公司)，引物(YhF/YhR)各0.4 μ mol/L, 25 ng DNA模板，不足部分由無菌超純水補足。擴增程序為:95°C預變性5 min ；94 °C變性30 s ;66°C退火45 s ；72 °C延伸30 S，共35個循環；最后72°C延伸 10 min。
[0013](3)將8 μ I PCR產物用1.5%瓊脂糖電泳分離，經溴化乙錠染色后于紫外燈下根據擴增產物的大小判定結果。如果能特異性地擴增出342bp產物時，即可判斷所述的植株組織中存在煙草疫霉菌；否則所述的植株組織中未存在煙草疫霉菌。
[0014]本發明方法適用于植物組織中煙草疫霉菌的快速可靠的檢測和鑒定，對于農業生產中煙草疫霉菌引起的病害防治具有重要的實用價值。本發明與現有技術相比，具有以下的技術優勢和積極效果:
1、特異性強:本發明檢測方法是根據疫霉屬YPTi基因含有多個外顯子和內含子，且其基因序列保守區和進化區相互間隔的特點，設計了對煙草疫霉菌具有特異擴增作用的PCR引物；已經對源于中國福建、云南、臺灣等省的煙草疫霉菌和帶煙草疫霉菌的植物組織進行了測試驗證，因此結果可靠性具有充分的保證；
2、靈敏度高:將設計的特異引物與YPTl通用引物進行巢式PCR擴增后，對煙草疫霉菌的檢測靈敏度在DNA水平上可達到10 fg，比常規PCR檢測高100倍。
[0015]3、實用性好:本發明所設計出的特異PCR引物可用于帶煙草疫霉菌組織的高靈敏度快速檢測，因此本方法的實用性強，可滿足對帶菌組織中存在的煙草疫霉菌進行快速可靠的檢測和鑒定的需要；
4、操作簡便快速:應用本發明方法，對帶煙草疫霉菌的植物組織進行病菌DNA提取、PCR擴增和常規的瓊脂糖電泳后即可判定結果，一般整個檢測過程可在數小時內完成。
[0016]5、本發明可用于帶煙草疫霉菌的植物組織高靈敏度快速分子檢測，此技術對于煙草疫霉菌引起病害顯癥之前的早期監測，確定病害防治最佳時期具有十分重要的意義，可以為防治策略的制定提供科學依據。。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為本發明所要檢測的煙草疫霉菌的特異PCR擴增圖。
[0018]圖中:泳道I為陰性對照，泳道2為陽性對照，泳道3-8為煙草疫霉菌，泳道9為大豆疫病菌，泳道10為致病疫霉菌，泳道11為掘氏疫霉菌，泳道12為黃瓜疫霉菌，泳道13為惡疫霉菌，泳道14為辣椒疫霉菌 ，泳道15為瓜果腐霉菌，泳道16為黃瓜霜霉菌，M為IOObpladder 分子量 marker。
[0019]圖2為本發明煙草疫霉菌的靈敏性檢測擴增結果圖。
[0020]上圖:單重PCR對煙草疫霉菌的靈敏性檢測擴增結果圖。
[0021]下圖:巢式PCR對煙草疫霉菌的靈敏性檢測擴增結果圖。
[0022]圖中:泳道I為I ng,泳道2為100 pg,泳道3為10 pg,泳道4為I pg,泳道5為100 fg，泳道 6 為 10 fg,泳道 7 為 I fg，M 為 IOObp ladder 分子量 marker。
[0023]圖3為本發明發病組織的檢測結果圖。
[0024]圖中:泳道I為陽性對照，泳道2-15為發病的煙草組織，泳道16為陰性對照，M為IOObp ladder 分子量 marker。
【具體實施方式】
[0025]以下結合具體實施例對本發明作進一步說明，但本發明不止限于此。
[0026]實施例1:引物序列的設計及引物對煙草疫霉菌的特異性擴增1.供試菌株基因組DNA的提取
為了獲得煙草疫霉菌的特異引物序列，以我國福建、云南和臺灣等省的31株煙草疫霉菌和多個疫霉屬近緣種以及常見的幾種病原真菌為供試材料，采用CTAB法提取供試菌株基因組DNA，具體方法如下:取50mg冷凍干燥后的菌絲粉于1.5ml離心管中，加入900 μ I2% CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)提取液(2% CTAB ；100 m mol/L Tris-HCl, PH 8.0 ；20mmol/L EDTA, ρΗ8.0 ；1.4 mol/L NaCl)和 90 μ I 10% SDS (十二烷基苯磺酸鈉)后混勻，于55~60°C水浴1.5 h,每10 min振蕩混勻一次，水浴1.5 h后離心(12，000 rpm) 15min,取上清液加入等體積的酹/氯仿/異戍醇(25:24:1)，離心(12，000rpm)5 min,取上清液(水相)，加入等體積氯仿抽提一次(12，000 rpm離心5 min),吸上清,加0.1體積的3mol/L NaAC溶液和2體積的冰無水乙醇，-20°C下沉淀30 min后12，000 rpm離心5 min,輕輕地倒去上清液，加入700 μ I冰70%乙醇進行洗滌(稍離心，傾掉上清)，在超凈工作臺上自然晾干無酒精味后用IXTE (10 mmol/LTris-HCL, 0.1 mmol/L EDTA ,pH 8.0)溶液進行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光度計檢測DNA濃度并稀釋至25 ng/ μ I待用。
[0027]2.引物的設計
在煙草疫霉菌特異DNA片段序列的基礎上應用ClustalX軟件比對設計特異引物，引物序列為:
YhF: 5’- GACATGATATCAACTGTTCTGCAG -3’
YhR: 5’- CCTTGGATCTTCTCTCGATAAG -3’
3.PCR驗證
經對供試菌株和31株煙草疫霉菌的特異性進行PCR驗證。具體的反應體系是PCR反應體系 25 μ 1，包括 2.5 μ L 10XPCR buffer (Mg2+ free), 2.0 mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L dNTP, 1.0 U Taq DNA聚合酶(Takara大連寶生物工程有限公司)，引物(YhF/YhR)各
0.4 μ mol/L, 25 ng DNA模板，不足部分由無菌超純水補足。擴增程序為:95 °C預變性5min ；94 °C變性30 s ;66°C退火45 s ；72 °C延伸30 S，共35個循環；最后72 °C延伸10min。此特異引物在煙草疫霉菌上特異性地擴增出342 bp的產物。
[0028]4.檢測特異性結果
PCR擴增結果見圖1。除了來自我國福建、云南、臺灣等省份的煙草疫霉菌DNA可特異地擴增出342 bp的產物外，檢測了 12種不同真菌和6種疫霉、霜霉、腐霉等卵菌DNA均未能擴增出任何產物。這說明該引物具有很強的特異性，可被用于生產實踐中發病植物組織中煙早疫霉囷快速可罪的檢測和鑒定。
[0029]實施例2:引物對煙草疫霉菌的靈敏性檢測
1.DNA濃度稀釋:提取的煙草疫霉菌基因組DNA，經分光光度計測定濃度后，采用系列濃度稀釋。
[0030]2.煙草疫霉菌的靈敏性檢測
首先以 YPTl 通用引物(phlF:5’ -CGACCATTGGCGTGGACTTT-3’，
Yph2R:5’ -ACGTTCTCGCAGGCGTATCT-3’ )作為第I輪反應引物，按以下反應體系和反應程序進行 PCR 擴增。PCR 反應體系 25 μ I,包括 2.5 μ L 10 XPCR buffer (Mg2+ free)，2.0mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L dNTP, 1.0 U Taq DNA 聚合酶(Takara 大連寶生物工程有限公司)，引物(phlF / Yph2R)各0.4 μ mol/L, 25 ng DNA模板，不足部分由無菌超純水補足。擴增程序為:95 °C預變性5 min ；94 °C變性30 s ;58°C退火45 s ；72 °C延伸30 S，共35個循環；最后72 °C延伸10 min。
[0031]然后取I μ L PCR產物為模板與引物(YhF/YhR)組合進行巢式PCR擴增。PCR反應體系 25 μ 1，包括 2.5 μ L 10XPCR buffer (Mg2+ free), 2.0 mmol/L MgCl2,0.2 mmol/LdNTP, 1.0 U Taq DNA聚合酶(Takara大連寶生物工程有限公司)，引物(YhF/YhR)各0.4μ mol/L, 25 ng DNA模板，不足部分由無菌超純水補足。擴增程序為:95 °C預變性5 min ；94 °C變性30 s ;66°C退火45 s ；72 °C延伸30 S，共35個循環；最后72 °C延伸10 min。
[0032]3.檢測結果:如圖2所示，上圖為單重PCR對不同濃度煙草疫霉菌基因組DNA擴增結果，下圖為巢式PCR對煙草疫霉菌的靈敏性檢測擴增結果。在25 μ?反應體系中，以10 fg煙草疫霉菌基因組DNA為模板時仍可擴增出一條342 bp大小的特異性條帶，表明其檢測靈敏度可達10 fg。
[0033]實施例3:發病植物組織中煙草疫霉菌的檢測
1.樣品采集:植物組織樣品采自福建省南平市煙草基地。
[0034]2.DNA提取及檢測
發病植物組織采用NaOH快速裂解法提取DNA，具體過程如下:①將煙草病葉或病莖洗凈、晾干，剪取發病部位；②按I mg病葉或病莖加入IOuL (0.5 mol/L NaOH, 0.5%PVP)計量，將組織充分磨碎成糊，在12，000 g離心機中離心6min 取上清20uL與等體積的0.1mol/L的Tris-HCl (ρΗ8.0)混合；④取I uL作為PCR模板進行擴增。
[0035]PCR 擴增的反應體系 25 μ 1，包括 2.5 μ L 10 XPCR buffer (Mg2+ free)，2.0mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L dNTP, 1.0 U Taq DNA 聚合酶(Takara 大連寶生物工程有限公司)，引物(YhF/YhR)各0.4 μ mol/L, 25 ng DNA模板，不足部分由無菌超純水補足。擴增程序為:95 °C預變性5 min ；94 °C變性30 s ;66°C退火45 s ；72 °C延伸30 S，共35個循環；最后72 °C延伸10 min。電泳檢測擴增產物。
[0036]3.檢測結果
結果見圖3，擴增產物如果出現一條清晰的分子量為342 bp的特異條帶，則可判斷發病組織感染煙草疫霉菌。圖中第`2、3、4、10、12、13的煙草組織中檢測出了煙草疫霉菌。
【權利要求】
1.一種煙草疫霉菌分子檢測引物，其特征在于引物序列為:上游引物 YhF: 5’- GACATGATATCAACTGTTCTGCAG -3’，下游引物 YhR: 5’- CCTTGGATCTTCTCTCGATAAG -3’ ；對煙草疫霉菌特異性擴增出342 bp的產物。
2.一種利用權利要求1引物的煙草疫霉菌檢測方法，其特征在于:包括以下步驟:(O從被煙草疫霉菌感染的植物組織中提取DNA ；(2)以步驟(1)提取的DNA為模板，利用YhF/YhR這一對引物進行PCR擴增；(3)取適量步驟(2)的PCR擴增產物用瓊脂糖電泳分離，經溴化乙錠染色后于紫外燈下觀察，根據擴增產物的大小判定結果，如果能特異性地擴增出342 bp的產物，即可判斷所述的植物組織中存在煙草疫霉菌。
3.根據權利要求2所述的煙草疫霉菌檢測方法，其特征在于:所述的步驟(2)PCR擴增的條件為:PCR 反應體系 25 μ?，包括 2.5 yL 10XPCR buffer, 2.0 mmol/L MgCl2,0.2mmol/L dNTP, 1.0 U Taq DNA 聚合酶，引物 YhF/YhR 各 0.4 ymol/L,25 ng DNA 模板，不足部分用無菌超純水補足；擴增程序為95 °C預變性5 min, 94 °C變性30 s，66°C退火45 s,.72 °C延伸30 S，共35個循環，最后72 °C延伸10 min。
【文檔編號】C12R1/645GK103555823SQ201310402932
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年9月7日 優先權日:2013年9月7日
【發明者】李本金, 陳慶河, 翁啟勇, 何美玲, 謝世勇, 謝廷鑫 申請人:福建省農業科學院植物保護研究所