一種鑒定tigar基因的表達量的方法及其專用引物的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種鑒定TIGAR基因的表達量的方法及其專用引物。本發明提供的引物對，由序列表的序列1所示的單鏈DNA分子和序列表的序列2所示的單鏈DNA分子組成。所述特異引物對可用于鑒定TIGAR基因、鑒定豬肉食品中TIGAR基因的表達量、輔助鑒定豬肉品質。本發明提供了特異引物對，采用SYBR?GreenⅠ熒光定量PCR方法對TIGAR基因表達情況進行研究，建立了TIGAR基因表達標準曲線且線性關系良好。本發明提供給的引物對和方法具有靈敏度高、特異性強、準確可靠等優點，可用于檢測豬TIGAR基因表達情況。
【專利說明】—種鑒定TIGAR基因的表達量的方法及其專用引物
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及一種鑒定TIGAR基因的表達量的方法及其專用引物。
【背景技術】
[0002]PSE肉是一種蒼白、柔軟、有汁液滲出的劣質肉，每年由其引起的肉品劣變給畜禽產業造成了巨大的經濟損失。PSE肉的形成主要取決于屠宰后無氧糖酵解的速度，無氧糖酵解的速度越快，越易產生PSE肉。
[0003]近來,英國Beatson癌癥研究所和西班牙研究人員在抗腫瘤研究過程中發現一種叫做 TIGAR (TP53_induced glycolysis and apoptosis regulator, TP53 誘導的糖酵解和凋亡調節因子)的P53誘導基因。TIGAR蛋白可調節有氧呼吸和糖酵解平衡。TIGAR蛋白具有果糖-2，6- 二磷酸酶(FBPase-2)活性，TIGAR表達使果糖_2，6- 二磷酸去磷酸化變成果糖-6-磷酸，降低了其在細胞中的含量，而果糖_2，6- 二磷酸是糖酵解關鍵酶磷酸果糖激酶(PFK-1)的強力激活因子，果糖_2，6- 二磷酸水平的降低會抑制磷酸果糖激酶的活性，使糖酵解反應速率下降，導致糖酵解一系列酶和產物的變化，PH下降速度減慢，抑制PSE肉的發生。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種鑒定TIGAR基因的表達量的方法及其專用引物。
[0005]本發明提供的專用引物為一對特異引物(又稱特異引物對)，由序列表的序列I所示的單鏈DNA分子和序列表的序列2所示的單鏈DNA分子組成。
[0006]本發明還保護所述特異引物對在鑒定TIGAR基因中的應用。
[0007]本發明還保護所述特異引物對在鑒定生鮮豬肉中TIGAR基因的表達量中的應用。
[0008]本發明還保護所述特異引物對在輔助鑒定豬肉品質中的應用。
[0009]本發明還保護所述特異引物對在制備試劑盒中的應用；所述試劑盒的功能為如下(a)或(b)或(c):(a)鑒定TIGAR基因；(b)鑒定生鮮豬肉中TIGAR基因的表達量；(c)輔助鑒定豬肉品質。
[0010]本發明還保護一種試劑盒，包括所述特異引物對；所述試劑盒的功能為如下(a)或(b)或(c):(a)鑒定TIGAR基因；(b)鑒定生鮮豬肉中TIGAR基因的表達量；(c)輔助鑒定豬肉品質。所述試劑盒還可包括用于鑒定內參基因的引物對，所述內參基因具體可為β-actin基因。所述用于鑒定內參基因的引物對具體可為序列表的序列3所示的單鏈DNA分子和序列表的序列4所示的單鏈DNA分子組成的引物對。所述試劑盒中還可包括具有所述特異引物對的靶序列的標準品質粒。所述標準品質粒具體可為將序列表的序列5所示的雙鏈DNA分子插入骨架載體得到的重組質粒。所述骨架載體具體可為PMD-18T載體。所述試劑盒還可包括記載有標準曲線方程的載體；所述標準曲線方程可為:y=-3.03561gx+ll.402，R2=0.9995，y為循環閾值，x為體系中TIGAR基因片段的拷貝數。
[0011]本發明還保護一種 鑒定豬肉中TIGAR基因的表達量的方法，包括如下步驟:[0012](I)提取待測豬肉的總RNA并反轉錄為cDNA ；
[0013](2)以步驟(1)得到的cDNA為模板，采用所述特異引物對進行實時熒光PCR ；
[0014](3)根據所述實時熒光PCR的結果獲得TIGAR基因的表達量。
[0015]所述實時熒光PCR的反應條件具體可為:95°C 30s ；95°C 5s、64°C 47s、40個循環。
[0016]以上任一所述的TIGAR基因具體可為如下(I )、(II)或(III):( I )序列表中序列6所不的DNA分子；(II)在嚴格條件下與(I )限定的DNA序列雜交且編碼與PSE肉相關的蛋白的DNA分子；(III)與(I )限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼與PSE肉相關的蛋白的DNA分子。上述嚴格條件可為在6 X SSC, 0.5%SDS的溶液中，在65oC下雜交，然后用2XSSC、0.1%SDS 和 I XSSC,0.1%SDS 各洗膜一次。
[0017]鑒于TIGAR基因對降低糖酵解水平，抑制PSE肉的發生具有一定作用，并且目前對宰后不同品種、不同時間的兩基因表達情況國內外研究甚少。本發明提供了特異引物對，采用SYBR Green I熒光定量PCR方法對TIGAR基因表達情況進行研究，建立了 TIGAR基因表達標準曲線且線性關系良好。本發明提供給的引物對和方法具有靈敏度高、特異性強、準確可靠等優點，可用于檢測豬TIGAR基因表達情況。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1為實施例2中的擴增曲線。
[0019]圖2為實施例2中的溶解曲線。
[0020]圖3為實施例3中采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性的電泳圖。
[0021]圖4為實施例3中通過檢測`β -actin基因鑒定cDNA的質量的電泳圖。
[0022]圖5為實施例3中檢測TIGAR基因的擴增曲線。
[0023]圖6為實施例3中檢測TIGAR基因的溶解曲線。
[0024]圖7為實施例3中檢測TIGAR基因的標準曲線。
[0025]圖8為實施例3中檢測內參基因的擴增曲線。
[0026]圖9為實施例3中檢測內參基因的溶解曲線。
[0027]圖10為實施例3中檢測內參基因的標準曲線。
[0028]圖11為實施例4的結果。
【具體實施方式】
[0029]以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。
[0030]pMD-18T載體:大連寶生物工程有限公司；Takara Code:6011oE.coll JM109感受態細胞:大連寶生物工程有限公司；Takara Code:D9052S。IOObp DNA Ladder Marker:大連寶生物工程有限公司；Takara Code:3422A。SYBRPremix Ex TaqI1:大連寶生物工程有限公司；Takara Code:RR820Q。2 XPower Taq PCR MasterMix:百泰克生物技術有限公司，貨號PR1701。Universal DNA純化回收試劑盒:天根生化科技有限公司，貨號DP214-02。高純度質粒小提中量試劑盒:天根生化科技有限公司，貨號DP107-02。[0031]實施例1、特異引物對的設計
[0032]設計一對用于鑒定TIGAR基因的引物如下(靶序列為169bp):
[0033]Fl (序列 I):5，-CAggTgAAAATgCgTggAAA-3，；
[0034]Rl (序列 2):5，-CTgAATTAAACgTggAggCACA-3，。 [0035]設計一對用于鑒定β -actin基因的引物對如下(靶序列為216bp):
[0036]F2 (序列 3):5，_TgCgggACATCAAggAgAAg_3，；
[0037]R2 (序列 4):5，-AgTTgAAggTggTCTCgTgg-3，。
[0038]實施例2、引物對的靈敏度和特異性
[0039]1、合成序列表的序列5所示的雙鏈DNA分子，將其插入pMD_18T載體，得到重組質粒。
[0040]2、將質粒濃度為3.4X IO9拷貝數/μ I的重組質粒溶液用超純水進行梯度稀釋，然后將各個稀釋液作為模板，分別進行實時熒光PCR。
[0041]實時熒光PCR 體系(20 μ 1):10 μ I SYBRPremix Ex TaqII,0.8μ I F1,0.8μ I Rl,0.4 μ I ROX Reference Dye, 2 μ I 模板，6 μ I dH20。
[0042]實時熒光PCR采用AB7500Real Time熒光定量PCR儀進行，反應條件為:95°C 30s ；95°C 5s、64°C 47s,40個循環；最后加入儀器自帶溶解曲線程序。
[0043]每種稀釋液進行三次重復實驗。
[0044]擴增曲線見圖1。圖1中，自左至右的擴增曲線依次為采用質粒濃度為3.4X108、
3.4Χ107、3.‘ΧΙΟ6』.‘ΧΙΟ5』.‘ΧΙΟ4』.‘ΧΙΟ3』.4Χ102、3.4Χ101 拷貝數 /μ I 的稀釋液作為模板得到的擴增曲線。實時熒光PCR體系中TIGAR基因片段的拷貝數為10以上時，均可觀察到擴增曲線，即采用Fl和Rl組成的引物對通過實時熒光PCR鑒定目的基因，靈敏度為10個拷貝的目的基因/每個反應體系。
[0045]當PCR體系中含IO1-1O8數量級拷貝的TIGAR基因片段時，Ct值與拷貝數的對數呈線性關系，根據各個稀釋液進行實時熒光PCR的結果制作標準曲線并得到標準曲線方程如下:y=-3.03561gx+ll.402，R2=0.9995，y為循環閾值，x為體系中TIGAR基因片段的拷貝數。
[0046]溶解曲線見圖2，可見只有單一峰，說明實時熒光PCR得到了單一產物，特異性強。將Fl和Rl在NCBI上進行比對可知，此引物對在豬的全基因序列中只能擴增TIGAR基因序列，因此在嚴格控制污染前提下，只擴增豬cDNA庫時不會產生其它非特異性擴增。
[0047]實施例3、引物對的應用
[0048]1、取兩頭屠宰30min后的大白豬的半膜肌，提取總RNA。采用分光光度計測定RNA的濃度和純度，總RNA的0D26(i/28(i在1.7-2.0之間。采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，見圖3 (I和2分別對應兩頭大白豬)，28S和18S條帶清晰可見，無明顯降解。
[0049]2、將步驟I提取的總RNA反轉錄為cDNA。通過檢測β -actin基因(內參基因)鑒定cDNA的質量，1.5%的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖4 (I和2分別對應兩頭大白豬)，顯示內參基因的擴增條帶，濃度較統一，質量較好。
[0050]PCR 體系:12.5 μ 12 X Power Taq PCR MasterMix, cDNAl.5 μ I，F21.5 μ I，R21.5 μ 1，加DEPC處理水補充至體積為25 μ I。
[0051]PCR 反應條件:95°C預變性 5min ;95°C變性 30s、55.5°0退火3()8、721:延伸 30s，28個循環；72°C延伸IOmin。
[0052]3、將步驟2得到的cDNA用超純水稀釋至5倍體積、10倍體積、100倍體積、1000倍體積，得到各個稀釋液(依次命名為5倍稀釋液、10倍稀釋液、100倍稀釋液或1000倍稀釋液)。
[0053]4、將步驟3得到的各個稀釋液作為模板，分別進行實時熒光PCR，檢測TIGAR基因。
[0054]實時熒光PCR 體系(20 μ 1):10 μ I SYBRPremix Ex TaqII,0.8μ I F1,0.8μ I Rl,0.4 μ I ROX Reference Dye, 2 μ I 模板，6 μ I dH20。
[0055]實時熒光PCR采用AB7500Real Time熒光定量PCR儀進行，反應條件為:95°C 30s ；95°C 5s、64°C 47s,40個循環；最后加入儀器自帶溶解曲線程序。
[0056]每種稀釋液進行三次重復實驗。
[0057]擴增曲線見圖5 (自左至右的擴增曲線依次為5倍稀釋液、10倍稀釋液、100倍稀釋液或1000倍稀釋液作為模板得到的擴增曲線)。溶解曲線見圖6。標準曲線見圖7。在5、10、100或1000稀釋倍數下，線性關系良好，R2=0.999385，標準曲線方程為:Y=-3.4692201gX+34.441328，其中Y為循環閾值，X為體系中TIGAR基因片段的拷貝數，可計算得到擴增效率為94.2%。
[0058]5、將步驟3得到的各個稀釋液作為模板，分別進行實時熒光PCR，檢測β -actin基因(內參基因)。
[0059]實時熒光PCR 體系(20 μ 1):10 μ I SYBRPremix Ex TaqII,0.8μ I F2,0.8μ I R2,
0.4 μ I ROX Reference Dye, 2 μ I 模板，6 μ I dH20。
[0060]實時熒光PCR采用AB7500Real Time熒光定量PCR儀進行，反應條件為:95°C 30s ；95°C 5s、64°C 47s,40個循環；最后加入儀器自帶溶解曲線程序。
[0061 ] 每種稀釋液進行三次重復實驗。
[0062]擴增曲線見圖8 (自左至右的擴增曲線依次為5倍稀釋液、10倍稀釋液、100倍稀釋液或1000倍稀釋液作為模板得到的擴增曲線)。溶解曲線見圖9。標準曲線見圖10。標準曲線方程為:Y=-3.2778851gX+23.205946，其中Y為循環閾值，X為體系中β-actin基因片段的拷貝數，R2=0.998073，線性關系較好，可計算得到擴增效率為101.8%。
[0063]根據步驟4和步驟5的結果可知:各基因擴增曲線反應良好；溶解曲線只有一個峰，說明反應特異性好；各標準曲線線性關系良好，目標基因與內參基因擴增效率基本一致。
[0064]實施例4、引物對的應用
[0065]采用與實施例3相同的方法，對屠宰后30min、2h、4h、8h的豬半膜肌中的TIGAR基因的相對表達量進行測定，觀察宰后不同品種(長白豬和東北花豬)、不同時間豬TIGAR基因變化趨勢。長白豬體質較弱，抗逆性差，應激敏感較強，故用以作為較易產生PSE肉品種進行研究。東北花豬是以本地民豬為母本與克米洛夫豬雜交而成的我國特有品種，其生長較快，飼料轉化率高，適應性強，胴體瘦肉率較低，較不易產生應激，故作為較不易產生PSE肉品種與長白進行TIGAR mRNA宰后不同時間表達量的比較研究。
[0066]共進行4次平行試驗，以長白豬宰后30min的TIGAR基因表達量作為參照，其它各品種、各宰后時間相對于參照的相對表達量見表1。經SAS9.1.3分析，結論如下:各品種宰后30min與宰后2、4、8h有顯著差異，30min表達量顯著高于2、4、8h (P〈0.05);東北花豬與長白豬間TIGAR基因表達量有顯著差異，且東北花豬宰后各時間點的表達量均顯著高于長白豬(P〈0.05)。
[0067]表1不同品種的豬宰后不同時間TIGAR基因的相對表達量
[0068]
[0069]注:大寫字母不同表示差異極顯著(P〈0.01)，小寫字母不同表示差異顯著(Ρ〈0.05)。
[0070]對TIGAR mRNA作圖并進行多重比較，見圖11。圖11中:每兩個相鄰柱子為一組，每組中左邊的柱子為長白豬，右邊的柱子為東北花豬；大寫字母不同表示差異極顯著(P〈0.01)，小寫字母不同表示差異顯著(P〈0.05)。經SAS9.1.3分析，結論如下:東北花豬TIGAR基因表達量顯著高于長白豬(P〈0.05);長白豬宰后30min與宰后2h有顯著差異，2h與4h、8h有顯著差異(P〈0.05);東北花豬宰后30min與長白豬Oh有極顯著差異(P〈0.01)，長白豬宰后30min與東北花豬宰后8h有極顯著差異(P〈0.01),其余宰后時間無顯著性差異；東北花豬宰后30min與長白豬宰后30min、2h有顯著差異(P〈0.05)，長白豬宰后30min、2h與長白豬宰后4、8h及東北花豬宰后8h有顯著差異(P〈0.05)。
【權利要求】
1.引物對，由序列表的序列I所示的單鏈DNA分子和序列表的序列2所示的單鏈DNA分子組成。
2.權利要求1所述引物對在鑒定TIGAR基因中的應用。
3.權利要求1所述引物對在鑒定生鮮豬肉中TIGAR基因的表達量中的應用。
4.權利要求1所述引物對在輔助鑒定豬肉品質中的應用。
5.權利要求1所述引物對在制備試劑盒中的應用；所述試劑盒的功能為如下(a)或(b)或(c): Ca)鑒定TIGAR基因；(b)鑒定生鮮豬肉中TIGAR基因的表達量；(c)輔助鑒定豬肉品質。
6.一種試劑盒，包括權利要求1所述引物對；所述試劑盒的功能為如下(a)或(b)或(c):(a)鑒定TIGAR基因；(b)鑒定生鮮豬肉中TIGAR基因的表達量；(c)輔助鑒定豬肉品質。
7.如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包括具有所述引物對的靶序列的標準品質粒。
8.如權利要求6或7所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包括用于鑒定內參基因的引物對。
9.一種鑒定豬肉中TIGAR基因的表達量的方法，包括如下步驟: (1)提取待測豬肉的總R NA并反轉錄為cDNA；(2)以步驟(1)得到的cDNA為模板，采用權利要求1所述引物對進行實時熒光PCR； (3)根據所述實時熒光PCR的結果獲得待測豬肉中TIGAR基因的表達量。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于:所述實時熒光PCR的反應條件為:950C 30s ；95°C 5s、64°C 47s,40 個循環。
【文檔編號】C12Q1/68GK103484540SQ201310400073
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月5日 優先權日:2013年9月5日
【發明者】湯曉艷, 康大成, 王敏, 李朋穎, 顏成英 申請人:中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所