一種高賴氨酸蛋白基因GhLRP及其應用的制作方法

一種高賴氨酸蛋白基因GhLRP及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種新的高賴氨酸蛋白基因GhLRP，該基因是從棉花基因組中克隆得到，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。本發明利用轉基因技術將所述基因轉化到禾本科植物中，實現了提高禾本科作物種子中賴氨酸和蛋白質含量的目的。
【專利說明】一種高賴氨酸蛋白基因GhLRP及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程領域，具體地說，涉及一種高賴氨酸蛋白基因及其應用。
【背景技術】
[0002]賴氨酸作為人和單胃動物所必需的氨基酸，在主要禾谷類作物如玉米、水稻、小麥的種子中含量很低，成為主要的限制性氨基酸，嚴重影響了其營養品質。
[0003]隨著生物技術的發展，采用傳統育種與分子育種相結合的方法，打破了物種生殖隔離的障礙，實現了物種之間基因的自由交流。而利用植物基因工程改良作物營養及加工品質，其應用潛力不僅僅在于提高初級農產品本身的價值，還涉及到加工成本的降低、加工工藝的簡化、產品市場競爭力的提高等多個環節。通過轉基因的方法提高作物中的賴氨酸含量，主要有以下幾個途徑:
[0004]1、改變賴氨酸的合成代謝途徑
[0005]植物體中涉及到的賴氨酸代謝相關途徑已經被研究的較為透徹，主要包括天冬氨酸代謝途徑中涉及到的賴氨酸合成步驟以及賴氨酸分解相關代謝途徑。
[0006]天冬氨酸代謝途徑是一個復雜的生化過程，該過程涉及到的第一個關鍵酶天冬氨酸激酶(aspartate kinase, AK)和賴氨酸合成相關的第一個關鍵酶二氫批唳二羧酸合成酶(dihydrodipicolinate synthase, DHDPS)分別受賴氨酸和蘇氨酸等代謝終產物的反饋抑制調節(Azevedoet al.，1997，2006)。植物中有兩種類型的AK，即單功能酶AK和雙功能酶AK-HSDH (aspartate kinase-homoserine dehydrogenase) (Wang et al.，2007)o 單功能酶AK受賴氨酸的反饋抑制調節，玉米中共有Askl和Ask2兩個編碼單功能AK的基因，當這些基因被突變后，AK對賴氨酸變得`不敏感，從而使游離的賴氨酸含量增加(Diedricketal., 1990; Dotson et al., 1990a, b;Muehlbaueret al.，1994a)。雙功能酶AK受蘇氨酸的反饋抑制調節，目前，在玉米cDNA中克隆出了三個編碼雙功能酶AK的基因，其中有兩個基因被分別定位在2號染色體的長臂和4號染色體的短臂上(Muehlbaueret al., 1994b)。依據這些性質與特點，科研工作者們通過篩選突變體的技術開展了一些研究，希望篩選到含有對賴氨酸和蘇氨酸不敏感的AK的突變體。在一些大麥突變體中，AK對賴氨酸的反饋抑制調節變得不敏感，結果使大麥種子中蘇氨酸的含量提高了幾倍，但是賴氨酸含量卻沒有被大量的提高(Bright et al., 1982;Rogneset al., 1983;Arruda et al.，1984)。同樣的，在一些玉米突變體中，蘇氨酸的含量也提高了幾倍，但是賴氨酸含量卻沒有增加(Hibberd andGreen, 1982)。對這一現象，Bright等人解釋說盡管AK受到抑制,但是DHDPS的活性仍然受到賴氨酸的反饋抑制調節，從而阻礙了賴氨酸含量的增加(Bright et al.，1982)。為了解決這個問題，一些賴氨酸不敏感的DHDPS突變體也被篩選出來(Frankard et al.，1992)，在一些突變體中，賴氨酸對DHDPS的反饋抑制作用減弱，使得植物葉片中的賴氨酸含量增加，但是種子中的賴氨酸含量卻沒有發生明顯的變化(Negrutiuet al.，1984;Azevedoetal.，2002)。
[0007]目前，一些有經濟價值的高賴氨酸玉米品種已經作為動物的飼料被應用，如LY038，該轉基因株系是通過在玉米胚中特異性表達來自谷氨酸棒狀桿菌的對賴氨酸不敏感的DHDPS來實現的，轉基因玉米種子中游離賴氨酸的含量為0.96mg/g (干重)，而野生型只有 0.05mg/g (Lucas et al.，2007)。
[0008]2、降低醇溶蛋白含量，增加賴氨酸含量
[0009]醇溶蛋白是谷類作物中含量最為豐富的一類蛋白，缺少賴氨酸和色氨酸，因此通過降低主要醇溶蛋白的含量也可以提高種子中賴氨酸的含量。在o2突變體中，醇溶蛋白的含量減少，但是受02調控的其它一些蛋白的表達也受到了影響，以至于玉米籽粒呈現出opaque表型。目前，主要是通過RNAi和轉基因技術減少或抑制必需氨基酸缺乏的醇溶蛋白的表達。Segal等人構建了使編碼22kDaa -zein基因沉默的RNAi載體，結果發現轉基因玉米中賴氨酸含量提到，而且玉米籽粒表型正常(Segal et al.，2003)。Huang等人構建了使編碼19kDaa -zein基因沉默的RNAi載體，結果種子賴氨酸、色氨酸和甲硫氨酸含量均增加(Huang et al., 2004)。此后,該課題組又構建了 RNAi的嵌合載體使19kDaa -zein和22kDaa -zein的合成積累量顯著地減少，結果玉米種子中賴氨酸和色氨酸含量均增加(Huang et al., 2006)。
[0010]3、引入編碼富含賴氨酸蛋白的基因
[0011]目前，主要有三種編碼富含賴氨酸蛋白的基因被應用:(1)密碼子經過改造的高賴氨酸蛋白基因；(2)人工合成的高賴氨酸基因(3)植物中或非植物中天然存在的高賴氨酸蛋白基因(Ufazet al.，2008)。
[0012](I)密碼子經過改造的高賴氨酸蛋白基因
[0013]該方法主要是將一些主要的儲藏蛋白基因進行定點誘變或是向其插入編碼富含賴氨酸的核苷酸序列。因此，選擇合適的誘變或插入位點是實驗成功與否的關鍵，主要是選擇序列不保守的位置進行改造，避免使經改造的蛋白的結構、穩定性以及功能發生改變(Sun and Liu, 2004)。玉米中的醇溶蛋白是主要的儲藏蛋白，而且賴氨酸缺乏，因此主要是通過改造一些醇溶蛋白基因來提高種子賴氨酸含量。最早的相關報道是將編碼19kDaa-zein的基因進行改造，然后將其mRNA注射到非洲爪蟾的卵母細胞中，結果發現經過改造的19kDaa -zein在卵母細胞中的合成、加工、穩定性以及形成蛋白體等的性質沒有改變(Wallace et al.，1988)。Torrent等人用富含賴氨酸的序列替代Y-zeins的富含脯氨酸的序列，然后將其在玉米中超表達，結果發現這些經過改造的Y-zeins在玉米胚乳相應的位置上大量的積累(Torrent et al.，1997)。
[0014](2)人工合成的高賴氨酸基因
[0015]該方法主要是基于蛋白的結構、折疊、功能、拓撲等性質設計新的蛋白。基于玉米醇溶蛋白的結構特點，Kim等人設計并合成了一個新的儲藏蛋白ASP1，該蛋白含有78.9%的必需氨基酸，在轉基因煙草的葉片中以及其它植物中能夠大量的合成與積累，使得氨基酸的含量提高(Kim et al., 1992 ；Zhang et al., 2003)。基于 α 螺旋的 coiled-coil 結構，Keeler等人設計了一個新的蛋白CP3-5，該蛋白含有31%的賴氨酸和20%的甲硫氨酸,用種子特異性啟動子啟動該基因在煙草中表達后發現該蛋白在煙草種子中大量穩定地積累，在一些轉基因株系中甚至能達到種子總蛋白的2%，使得賴氨酸含量大幅提高(Keeler etal., 1997)。
[0016](3)天然存在的高賴氨酸蛋白基因[0017]選擇天然存在的同源或異源的高賴氨酸基因在植物體內表達是目前被廣泛應用的一種方法，一些高賴氨酸植物蛋白已經被研究并應用到改善植物蛋白品質方面。對于整個研究而言，高賴氨酸蛋白基因的選擇是一個關鍵問題。豆科類的蛋白賴氨酸含量較高，如將大豆球蛋白和菜豆蛋白基因在煙草種子中異源表達后，這些蛋白在煙草種子中大量穩定地積累，使得賴氨酸含量增加(Utsumiet al., 1993; Takaiwaet al.，1995)。此外,還有一些豆類蛋白如WBLRP和VSPs在煙草或水稻中異源表達后，使賴氨酸含量提高(Gaoetal., 2001; Guenouneet al，2003)。動物中的一些高賴氨酸基因也可以作為蛋白品質改善的候選基因，如雞的卵清蛋白和牛的酪蛋白基因，但是這些蛋白在植物中積累量比較低(Schroeder et al., 1991;Philip et al.，ZOOOt5Bicar等人將牛奶蛋白與玉米種子特異性強啟動子27kDa Y -zein連結構建載體轉入玉米中，獲得了種子賴氨酸含量提高了 29-47%的轉基因玉米(Bicaret al.，2008)。玉米的延伸因子eEFlA (elongation factorlA)是個多功能蛋白，在玉米胚乳細胞中與圍繞蛋白體的肌動蛋白共定位，富含賴氨酸，可能與玉米胚乳中的賴氨酸含量高度相關(Habben，et al., 1995; Sun, et al.，1997)。eEFlA可以作為一個候選的高賴氨酸基因以改善蛋白品質，但是現在還沒有相關的報道。1997年劉俊起等克隆了一個花粉特異蛋白基因的cDNA(SB401) (Liu et al.，1997)，其編碼的氨基酸序列中賴氨酸含量高達16.7%，將此cDNA與玉米19kDa醇溶蛋白啟動子連接后轉化玉米，SB401表達產物能在玉米籽粒中穩定積累并使籽粒中賴氨酸和蛋白質含量明顯提高，該方法獲得發明專利(ZL01118297.0)。后通過常規育種方法獲得了穩定的高蛋白質和高賴氨酸轉基因玉米自交系(Yu et al.，2004)。郎志宏等在馬鈴薯中克隆了一個SB401同源基因SBLR。SBLR基因編碼211個氨基酸，其中賴氨酸重量比為18.93%。將該基因轉入玉米，得到了 6個蛋白質和賴氨酸含量提高均在30%以上的株系。該基因在作物品質改良中的應用也擁有專利(ZLO1118296.2)。

【發明內容】

[0018]本發明的目的是提供一種新的高賴氨酸蛋白基因GhLRP及其應用。
[0019]為了實現本發明的目 的，本發明首先提供一種來自棉花的高賴氨酸蛋白基因GhLRP,以及在嚴格條件下，可與該基因的核苷酸序列發生雜交的核苷酸序列。所述高賴氨酸蛋白基因GhLRP的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，其⑶S序列如SEQ ID N0.3所示。
[0020]本發明還提供了一種由所述高賴氨酸蛋白基因GhLRP編碼的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，賴氨酸含量為18.97%。
[0021 ] 本發明還提供了含有所述基因的表達載體。
[0022]進一步地，所述載體還含有一種啟動子。
[0023]作為優選,所述啟動子為種子特異啟動子F128。
[0024]所述載體的構建方法如下:
[0025]利用雙T-DNA載體，將GhLRP基因與谷子種子特異啟動子F128和來自胭脂堿合成酶(nos)基因的3’轉錄終止區域連接，構建植物表達載體，以潮酶素磷酸轉移酶基因(hpt)作為選擇標記基因。用農桿菌介導法轉化08 X 178雜交玉米幼胚，經潮酶素篩選獲得抗性再生植株。經過基因組DNA PCR檢測得到88個含GhLRP基因的TO代轉基因玉米株系，將轉基因玉米自交獲得Tl代種子。通過PCR、RT-PCR和Western檢測Tl代玉米植株，將陽性的株系種子進行賴氨酸和蛋白質含量的測定，從中選擇賴氨酸和蛋白質含量均較高的3個株系繼續進行后代的跟蹤檢測。
[0026]本發明還提供了含有所述基因的工程菌。
[0027]本發明還提供了用于擴增高賴氨酸蛋白基因GhLRP的引物對，包括正向引物F:5' -CCMCTTTTACTCATTACTGTCTCA-3'和反向引物R:5, -TTTATGTTTCTCATGCTCTTTAGGC-3'。
[0028]本發明還提供了一種提高禾本科植物種子中蛋白質和賴氨酸含量的方法，將含有高賴氨酸蛋白基因的植物表達載體，用農桿菌介導法轉化禾本科植物，從而獲得賴氨酸和蛋白質含量均較高的禾本科植物。
[0029]本發明以轉化08X 178雜交玉米幼胚為例,從而獲得賴氨酸和蛋白質含量均較高的玉米株系。
[0030]本發明還提供了高賴氨酸蛋白基因GhLRP在提高禾本科種子賴氨酸含量中的應用。
[0031]本發明的有益效果在于:
[0032]本發明所獲得的結果為玉米品質改良提供了潛在的基因資源。同時，該方法為玉米營養品質改良提供了一種新的途徑。所獲得的轉基因高賴氨酸玉米在實際生產中具有重要的應用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1為本發明GhLRP基因的⑶S序列及其編碼蛋白的氨基酸序列及組成。
[0034]圖2為本發明實施例2中pSB130_GhLRP雙元表達載體的示意圖。
[0035]圖3為本發明實施例3中玉米抗性愈傷的篩選和再生過程；
[0036]其中:A為玉米愈傷在含有15mg/L潮霉素的篩選培養基上培養；B為抗性愈傷的分化培養；C為分化出的幼苗在生根培養基上培養；D為再生苗在小盆中生長；E為玉米苗在溫室土壤中培養；F為TO代轉基因玉米。
[0037]圖4為本發明Tl代轉化玉米的分子檢測；
[0038]圖中(A)為部分轉化株系的PCR檢測電泳圖；其中:Lane I, Lane2, Lane3, Lane4, Lane5 分別為轉基因株系 F12, F33, F78, F88, F91 的檢測結果；M，DNA Marker ;WT，08X 178野生型雜交玉米作為對照；
[0039]圖中(B)為部分轉化株系的RT-PCR檢測電泳圖；其中:Lane I, Lane2, Lane3, Lane4, Lane5 分別為轉基因株系 F12, F33, F78, F88, F91 的檢測結果；
[0040]圖中(C)為部分轉化株系的Western檢測圖；其中:Lanel, Lane2, Lane3, Lane4, Lane5 分別為轉基因株系 F12, F33, F78, F88, F91 的檢測結果，每個泳道蛋白上樣量為20 μ g。
[0041]圖5為本發明T2代轉GhLRP玉米種子zein與non_zein的積累模式的分析；
[0042]圖中:㈧為zein含量；(B)為non-zein含量；(C)為野生型及轉基因株系F12, F78, F88種子醇溶蛋白的15%SDS_PAGE電泳圖，每個泳道的蛋白上樣量相當于400 μ g成熟玉米種子粉末包含的醇溶蛋白含量。
[0043]圖6為本發明T3代轉GhLRP玉米種子外觀、容重分析及萌發率分析；
[0044]圖中:(A)為T3代轉基因玉米株系F12，F78和F88種子和野生型玉米種子在白熾光(上部和中部)和透射光(底部)下的表型觀察圖；(B)為玉米種子的容重分析；(C)為玉米種子的萌發率分析。
【具體實施方式】
[0045]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
[0046]實施例1編碼高賴氨酸蛋白基因GhLRP的克隆
[0047]根據海島棉基因組中的高賴氨酸蛋白基因Fbl2A (GenBank:U34401.1)設計克隆高賴氨酸蛋白基因 GhLRP 的引物GhLRP-5:5' -GCGTCGACCCAACTTTTACTCATTACTGTCTCA-3;和 GhLRP-3:5 ' -GGAATTCTTTATGTTTCTCATGCTCTTTAGGC-3 '。5 ’ 端引物引入 Sal I 酶切位點，3’端引物引入EcoRI酶切位點。以陸地棉基因組DNA為模板，進行PCR擴增。擴增條件如下:95°C，變性5min ;57°C，退火0.5min ;72°C，延伸0.5min ;擴增循環數35 ;最后72。。，延伸IOmin ;4°C保存。將PCR產物在0.8%瓊脂糖凝膠中電泳，用試劑盒回收目的條帶。取適量回收產物，與PMD19T vector連接轉化大腸桿菌感受態。小提該質粒PMD18T_GhLRP，經SalI和EcoRI酶切鑒定后測序。GhLRP基因的核苷酸序列`如SEQ ID N0.1所示，其編碼蛋白的氨基酸序列及氨基酸組成如圖1所示。
[0048]實施例2用于玉米中表達的表達載體構建和農桿菌轉化
[0049]目的基因GhLRP的表達盒由來自谷子的種子特異啟動子F128(ZL200710099169.7)和胭脂堿合成基因nos的3’轉錄終止區域組成，選擇標記基因為潮酶素磷酸轉移酶基因(hpt)，其編碼氨基糖苷4 一磷酸轉移酶APH(4)-1。載體示意圖如圖2所
示，載體包括兩個T-DNA區-T-DNAl和T-DNA2區；RB1，LBl, RB2, LB2分別指兩個T-DNA
區的右邊界和左邊界；T-DNA1區包括由F128啟動子驅動的GhLRP表達框；T_DNA2區包括由CaMV35S啟動子驅動的hpt表達框。
[0050]用SalI和EcoRI將GhLRP從質粒PMD18T_GhLRP上切下，連接到雙-T載體pSB130-SBgLR(該質粒由香港中文大學辛世文教授提供的pSB130載體衍生而來，該質粒上有兩個T-DNA，一個包含選擇標記基因hpt，另一個T-DNA上有多克隆位點，可以克隆目的基因)，形成重組質粒pSB130-GhLRP。采用凍融法將質粒pSB130_GhLRP直接轉入農桿菌菌株LBA4404中，獲得含有重組質粒pSB130-GhLRP的農桿菌LBA4404 (pSB130_GhLRP)。農桿菌轉化技術為公知技術。
[0051]實施例3用含pSB130_GhLRP的農桿菌轉化玉米幼胚
[0052]農桿菌轉化玉米幼胚的方法是一個比較成熟的轉化方法，具體步驟如下:
[0053]1、玉米的控制授粉
[0054]( I)玉米抽雄后，在授粉的前一天，用大口袋套住雄穗，下面用別針別住，收集花粉；
[0055](2)雌穗花絲未抽出前，用小口袋將其套住，并用大頭針別好；
[0056](3)在授粉的前一天，當花絲伸出約2cm長時，用剪刀剪去花絲的頂部，促進其伸長;
[0057](4)第二天，當花絲伸長后，進行授粉；
[0058](5)授粉后系上小牌，寫上授粉的品種和日期，10-12天后收獲。
[0059]2、幼胚的剝離[0060](I)取授粉后10-12天，幼胚大小為1.5-2.0mm的08 X 178雜交玉米雌穗；
[0061](I)將新收獲的玉米雌穗去掉苞葉、花絲，花絲一定要去干凈，可用酒精燈將未除凈的花絲燒去；用小刀去掉雌穗的頭尾部分；
[0062](2)將雌穗浸在70%乙醇(加幾滴Tween20)中滅菌IOsec ；
[0063](3)將雌穗取出，置于無菌的環境中備用；
[0064](4)將一只槍式鑷子從頂部插入雌穗，用左手持住鑷子，右手用裝有#22刀片的手術刀切去籽粒的上半部分；
[0065](5)換上#10刀片，將刀尖插入籽粒下部的果皮與胚乳之間，將胚乳挑出；
[0066](6)用刀尖將粘在胚乳頂部或頂部果皮內的幼胚轉移到基本培養基上，操作要小心，不要損傷幼胚。
[0067]3、農桿菌的制備
[0068](I)從保存的菌板上挑一環菌接到YEB (含125mg/L Sm和100mg/L Kan)平板培養基上，28°C培養兩天(或20°C培養三天)；
[0069](2)收集菌體，用侵染培養基調菌液至0D600=0.3-0.4，28°C，180rpm避光搖菌1-2小時備用。
[0070]4、幼胚的農桿菌侵染
[0071](I)在2ml滅菌的離心管中加入1.5ml的浸染培養基，用小刀片把幼胚從平板上挑至離心管中，用移液器輕輕吹打`，在30min內共洗兩次；
[0072](2)吸出浸染培養基，加入1.5ml準備好的菌液，避光緩慢顛倒20次后靜置，此過程為IOmin ；
[0073](3)將幼胚連同菌液倒在鋪有無菌濾紙的培養皿中，超凈臺中吹干，但不要使幼胚失水；
[0074](4)將吹干的幼胚轉移至共培養培養基中，盾片朝上，20°C避光共培養三天。
[0075]5、恢復培養
[0076]將共培養三天的幼胚轉移到恢復培養基中。如果共培養的幼胚長菌，可將長菌的幼胚小心地挑到2ml滅菌的離心管中，用無菌水洗直至洗凈，然后用含有100mg/L頭孢霉素的無菌水洗30min，最后將幼胚連同無菌水倒在鋪有無菌濾紙的培養皿中吹干，再將幼胚轉移到恢復培養基中，28°C黑暗培養7天。
[0077]6、篩選培養
[0078]將恢復培養的幼胚轉移到篩選培養基中暗培養，每兩周繼代一次。一般情況下，篩選時潮霉素的濃度分別為5mg/L、10mg/L、15mg/L和20mg/L,篩選次數和最終潮霉素的濃度視情況而定。
[0079]7、篩選后的誘導
[0080]將篩選后的愈傷轉移到高糖培養基中，暗培養兩周。
[0081]8、分化培養
[0082]將恢復培養兩周的抗性愈傷轉移到分化培養基中，見光培養，光照周期為光照/黑暗:16h/8h，每兩周繼代一次。
[0083]9、生根培養
[0084]待分化出的幼苗長至2_3cm時，將幼苗從抗性愈傷上切下，移入罐頭瓶的生根培養基中，誘導生根，當幼苗及根系粗壯后即可煉苗移栽。
[0085]10、再生苗的煉苗移栽
[0086]將小苗移到溫室中放置2-3天后，將封口膜打開，加入一層無菌水，再放置2-3天。然后將小苗移栽入小盆中(草炭土和蛭石按1:1比例)，移栽時將根部的瓊脂清洗干凈，以防被微生物滋生，同時注意避免損傷根系。將栽入小盆的小苗放在塑料拱棚中培養，待小苗比較壯實后移入溫室土壤中繼續培養。
[0087]玉米抗性愈傷的篩選和再生過程見圖3。潮霉素篩選后的抗性愈傷經誘導后被轉移至分化培養基中見光培養(圖3B)，分化出的幼苗從愈傷組織上切下轉移到生根培養基中誘導生根(圖3C)，待小苗的根系比較發達時移到溫室，煉苗后種到小花盆里(圖3D)，種子成熟后及時收獲(圖3F)。
[0088]轉化各步驟中使用的培養基成分如下:
【權利要求】
1.一種高賴氨酸蛋白基因GhLRP，其特征在于，所述高賴氨酸蛋白基因GhLRP的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.一種由權利要求1所述的高賴氨酸蛋白基因GhLRP編碼的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.含有權利要求1所述基因的表達載體。
4.如權利要求3所述的載體，其特征在于，所述載體還含有一種啟動子。
5.如權利要求4所述的載體，其特征在于，所述啟動子為種子特異啟動子F128。
6.含有權利要求1所述基因的工程菌。
7.用于擴增高賴氨酸蛋白基因GhLRP的引物對，其特征在于，包括正向引物F:5' -CCMCTTTTACTCATTACTGTCTCA-3'和反向引物R:5, -TTTATGTTTCTCATGCTCTTTAGGC-3'。
8.一種提高禾本科植物種子中蛋白質和賴氨酸含量的方法，包括將權利要求3所述表達載體轉化禾本科植物。
9.高賴氨酸蛋白基因GhLRP在提高 禾本科種子賴氨酸含量中的應用。
【文檔編號】C12N15/29GK103484473SQ201310398102
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月4日 優先權日:2013年9月4日
【發明者】于靜娟, 趙倩, 朱登云, 岳靜, 李叢 申請人:中國農業大學