一個花椰菜器官發育調控基因編碼序列及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一個在花椰菜器官發育中發揮關鍵調控作用的基因編碼序列，及利用上述基因編碼序列培養高生物量轉基因植物的方法，它包括如下步驟：（1）花椰菜總RNA提取及第一鏈cDNA合成；（2）帶酶切位點引物設計、合成；（3）過表達轉化載體構建；（4）遺傳轉化；（5）轉基因陽性苗篩選；（6）轉基因植物生物學性狀觀察。對純化后的轉基因植株進行生物學性狀觀察，結果顯示轉基因植物葉片顯著增多，數量顯著增多，生物量約是野生型對照的200%。本發明公開的采用基因編碼序列培養高生物量轉基因植物的方法對于揭示花椰菜器官發育調控的分子基礎及采用基因工程手段干預植物器官發育進程，培育符合育種目標的高產作物或經濟植物具有重要價值。
【專利說明】—個花椰菜器官發育調控基因編碼序列及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于現代分子生物轉基因植物【技術領域】，涉及生物技術中一個在花椰菜器官發育中發揮關鍵調控作用的基因編碼序列及其在培育高生物量轉基因植物中的應用。
【背景技術】
[0002]自然界中不同植物物種間器官大小差異十分顯著，而在同一物種內相同基因型的不同植物個體間器官大小差異則非常小，表明植物器官大小發育受到嚴格的遺傳控制。器官大小是植物形態的一個重要特征，也是一個極具價值的農藝性狀，如種子大小、果實大小等直接影響農作物或經濟作物的產量和品質。因此揭示參與植物器官大小發育的調控因子及其作用機制對采用基因工程等手段提高作物產量和品質具有巨大的應用價值。
[0003]花椰菜(Brassica oleracea L.var.botrytis)是十字花科蕓薹屬甘藍種的一個變種，是重要的蔬菜作物，當前我國是世界上花椰菜種植面積最大的國家。其區別于其他十字花科植物的一個最顯著特征是在其生殖發育過程中會形成一個由大量增生的花序分生組織構成的特化器官——花球。花椰菜花球所表現出的這種生殖發育，特別是花發育特性使其成為研究十字花科植物器官發育特別是花器官發育的理想材料。
[0004]然而，目前對花椰菜器官發育分子調控機制認識十分有限。借助現代分子生物技術和手段，可以對調控花椰菜器官發育調控的基因進行鑒定、分離。相關基因的獲得及功能闡釋對于揭示花椰菜器官發育調控的分子基礎及采用基因工程手段干預植物器官發育進程，培育符合育種目標的高產作物或經濟植物具有重要價值。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是公開一個在花椰菜器官發育中發揮關鍵調控作用的基因編碼序列，并提供一種利用該 基因編碼序列，采用基因工程手段獲得高生物量轉基因植物的方法和應用。為實現此述目的，本發明公開了如下的技術方案:
[0006]一個在花椰菜器官發育中發揮關鍵調控作用的基因編碼序列，它由序列5’ATGATTCGTGAAATCTCCGGTCTACAAAACGACATCGTAAACATTCAAGAACGCTCTTCAAGCAGCAACAACAAGATCATGGACATGAGAAGAGATATTCGCCGACCAGCTCAAGCTCCTATGATGAGTAAGCAAGAATATTTTCGGACATTGTCGTCTCAGAACAGTCCGAGGAGGCTAATCTCAGCGAGTCACTTCAGTTTGGAGTCAATGGTTGTTCTTGTTGGTCTCACAGCATCGCTCTTGATCCTTCCCTTGATTCTTCCACCGTTGCCTCCTCCTCCGTTCATGCTGCTTCTCATTCCTATTGGGATAATGGTTCTGCTTATGGTTCTTGCTTTAATGCCTTCTTCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTAATGCCTTACATGTAACAAGAACTTATATGTAA3’ 組成(SEQ ID NO:1) ?
[0007]本發明進一步公開了一種利用上述基因編碼序列培養高生物量轉基因植物的方法，它包括如下步驟:
[0008](I)花椰菜總RNA提取及第一鏈cDNA合成；
[0009](2)帶酶切位點引物設計、合成:利用生物學軟件設計帶XbaI和SacI酶切位點的引物:ARL-S:5? TCTAGAATGATTCGTGAAATCTCCG3，(下劃線表示 XbaI 酶切位點);ARL_A:5’￡AGCTCTTACATATAAGTTCTTGTTACATGT3?(下劃線表示SacI酶切位點)。引物序列由上海生物工程公司合成。
[0010](3)過表達轉化載體構建:用SDS (十二烷基硫酸鈉)堿裂解法分別提取PBI121質粒和含有上述基因編碼序列的質粒；將上述基因編碼序列的質粒和PBI121載體質粒同時采用XbaI和SacI雙酶切，酶切體系如下:質粒1μ g、10XT buffer2y L、0.1 % BSA (牛血清白蛋白)2μ L、XbaI(15U / μ L)0.5 μ L、SacI (10U / μ L)0.5 μ L，無菌水補至 20 μ L。將上述混合液置于0.2mL的離心管中，37度孵育3h ;將帶有相同酶切位點目的基因片段及pBI121質粒的回收并進行連接，連接體系如下:pBI121質粒4μ L、目的片段4.5 μ L、IOX ligase buffer (連接緩沖液)I μ L、Ligase (連接酶)0.5 μ L、無菌水補至10 μ L,將上述連接混合物置于0.2mL的離心管中輕輕混勻后，16°C水浴保溫16h ;重組質粒的轉化:加
5μ L連接產物于50 μ L大腸桿菌感受態細胞中，輕彈混勻，冰浴30min ;42°C熱激30s，立即置于冰上2min ;加500 μ L平衡至室溫的LB，180rpm37°C孵育Ih ；4000rpm離心Imin后，棄掉部分上清，剩余150 μ L重懸菌體，涂于LB平板(含IOOmg / L Kan) ;37°C培養過夜。挑取白色克隆于ImL LB培養基(含IOOmg / L Kan) 37°C，180rpm培養8h。取I μ L菌液作為模板進行PCR鑒定，篩選獲得陽性重組質粒；重組質粒轉化農桿菌LBA4404:取I μ g重組質粒加入100 μ L農桿菌感受態中，輕輕混勻；冰浴30min ;液氮速凍5min ;37°C熱擊5min ；加入800 μ L YEB液體培養基(不含抗生素)，28°C 180rpm復蘇4h ；4000rpm離心Imin后，棄掉部分上清，剩余150 μ L重懸菌體，涂于YEB平板(含50mg / L Rif、IOOmg / L Str和IOOmg / L Kan) ;28°C倒置培養2_3d。挑取白色克隆于ImL YEB培養基(含50mg / L Rif、IOOmg / L Str 和 IOOmg / L Kan) ,28°C, 220rpm 培養 I -2d。取 I μ L 菌液作為模板進行PCR鑒定；同時提取農桿菌陽性質粒進行雙酶切鑒定；取經鑒定的陽性菌株菌液500 μ L加入500 μ L40%甘油YEB培養基，正當混勻后于_20°C保存備用；
[0011](4)遺傳轉化: 將-20°C保存的含有目的基因重組質粒的農桿菌菌液接種于IOmLYEB 液體培養基(含 5Omg / L RifUOOmg / L Str 和 IOOmg / L Kan)中，28°C，22Orpm 活化I-2d ;按I:100比例取2.5mL菌液接種于250mL YEB液體培養基(含50mg / L Rif、IOOmg / L Str 和 IOOmg / L Kan)中，28°C 220rpm過夜培養至 OD6tltl 為 1.2 -1.6 ;5，OOOrpm離心IOmin收集菌體，將菌體重懸于500mL5%蔗糖溶液中，加入100 μ L silwet L_77(終濃度為0.05% )，混勻后轉入轉化杯中作為轉化液待用；待轉化的擬南芥前一天澆透水，去掉已結莢，將擬南芥倒置于轉化杯中，輕輕搖動轉化液，浸染15s后將植株移出，抖去多余轉化液，用保鮮膜包好，側置于托盤中，避光ld，然后直立培養，5d后按照同樣方式進行第二次轉化；
[0012](5)轉基因陽性苗篩選:將種子均勻播種于MS固體培養基(含50mg / L Kan)中，吸去多余水分；4°C黑暗條件下春化3-4d后置于22°C光照培養箱(16h光照，8h黑暗)培養；7-14d后轉基因陽性苗子葉濃綠并且根系發達，非轉基因苗則只有兩片子葉，最后逐漸白化死亡。待陽性苗長至4葉期后轉至營養土中，，一盆一苗，人工培養室培養，覆膜2d后揭膜繼續培養；
[0013](6)轉基因植物生物學性狀觀察,對純化后的轉基因植株進行生物學性狀觀察,實驗的結果發現:
[0014](I)轉基因植物植株葉片顯著增大、葉片數量顯著增多；[0015](2)轉基因植物植株根系，特別是側根更加發達；
[0016](3)轉基因植物植株在營養生長階段的生物量約是對照的200%。
[0017]本發明重點解決了在作物或能源植物新品種育種中對獲得高生物量作物或能源植物新品種的需求。
[0018]本發明所述的YEB培養基指的是含50mg / L Rif (利福平)、IOOmg / L Str (鏈霉素)和IOOmg / L Kan (卡那霉素)的培養基。
[0019]本發明同時也公開了基因編碼序列(SEQ ID NO:1)在干預花椰菜及其他植物器官發育中的應用。
[0020]本發明公開的利用該基因編碼序列，采用基因工程手段獲得高生物量轉基因植物的方法與現有技術相比所具有的積極效果在于:
[0021](I)操作過程更加簡單，對操作環境的要求更低，即使在一般的只具備簡單分子生物學設備、儀器的實驗室也能開展；
[0022](2)費用低廉，廣譜性高，可在絕大多數雙子葉植物中開展；
[0023](3)轉化效率高，可以實現短時間內獲得大量具有高生物量的轉基因植株。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0024]圖1為顯示本案花椰菜器官發育調控基因編碼序列轉基因擬南芥植株抗性篩選(a、b)及分子鑒定(c、d、e)；
[0025]圖2為顯示本案 花椰菜器官發育調控基因轉化擬南芥后轉基因擬南芥及野生型各個發育期的比較(左邊顯示野生型擬南芥生長發育狀況，右邊顯示轉基因擬南芥生長發育狀況)。
【具體實施方式】
[0026]下面結合說明書附圖和具體實施例，進一步闡述本發明。應理解這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人,分子克隆:實驗室手冊(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件。本發明所有生化試劑、酶、載體、菌株均可在各種生化試劑公司中購買，引物序列由上海生物工程公司合成。
[0027]本發明所需生化試劑及酶等來源見下表:
【權利要求】
1.
2.一種利用權利要求1所述基因編碼序列培養高生物量轉基因植物的方法，其特征在于它按如下的步驟進行: (1)花椰菜總RNA提取及第一鏈cDNA合成； (2)帶酶切位點引物設計、合成:利用生物學軟件設計帶油al和fec1酶切位點的引物:ARL-S: 5 ’ TCTAGAATGATTCGTGAAATCTCCG3 ’ (下劃線表示 Xba 1 酶切位點);ARL-A: 5 ’ GAGCT酶切位點)，引物序列由上海生物工程公司合成； (3)過表達轉化載體構建:用SDS堿裂解法分別提取PB1121質粒和含有上述基因編碼序列的質粒；將上述基因編碼序列的質粒和PB1121載體質粒同時采用油a/和Se1c1雙酶切，酶切體系如下:質粒1 μ g、10XT buffer 2μ L,0.1%BSA 2μ LU5U/y L的油al0.5μ LUOU/μ L的Saci 0.5 μ L，無菌水補至20 μ L，將上述混合液置于0.2mL的離心管中，37度孵育3h ;將帶有相同酶切位點目的基因片段及PB1121質粒的回收并進行連接，連接體系如下:pB1121 質粒 4μ L、目的片段 4.5μ L、10Xl1gase buffer 1 μ L、L1gase0.5 μ L、無菌水補至10 μ L，將上述連接混合物置于0.2mL的離心管中輕輕混勻后，16°C水浴保溫16 h ;重組質粒的轉化:加5 μ L連接產物于50 μ L大腸桿菌感受態細胞中，輕彈混勻，冰浴30 m1n;42°C熱激30 S，立即置于冰上2 m1n ;加500 μ L平衡至室溫的LB培養基，180rpm 37°C孵育1h ;4000rpm離心1m1n后，棄掉部分上清，剩余150 μ L重懸菌體，涂于含100 mg/L Kan LB固體培養基平板；37°C培養過夜；挑取白色克隆于1mL含100 mg/L Kan LB培養基中，370C，180rpm培養8 h，取1 μ L菌液作為模板進行PCR鑒定，篩選獲得陽性重組質粒；重組質粒轉化農桿菌LBA4404:取1 μ g重組質粒加入100 μ L農桿菌感受態中，輕輕混勻；冰浴30 m1n ;液氮速凍5 m1n ;37°C熱擊5 m1n ;加入800 μ L不含抗生素的YEB液體培養基，28°C 180 rpm復蘇4 h ；4000 rpm離心1m1n后,棄掉部分上清,剩余150 yL重懸菌體，涂于YEB培養基平板；28°C倒置培養2-3 d ;挑取白色克隆于1 mL含50mg/L R1f、100mg/L Str 和 100 mg/L Kan 的 YEB 培養基，28°C，220 rpm 培養 1~2d，取 1 μ L 菌液作為模板進行PCR鑒定；同時提取農桿菌陽性質粒進行雙酶切鑒定，取經鑒定的陽性菌株菌液500 μ L加入500 μ L 40%甘油YEB培養基，正當混勻后于-20°C保存備用； (4)遺傳轉化:將-20°C保存的含有目的基因重組質粒的農桿菌菌液接種于10mL YEB液體培養基中，28°C，220 rpm活化1~2 d ;按1:100比例取2.5 mL菌液接種于250mL YEB液體培養基中，28°C 220 rpm過夜培養至0D_為1.2~1.6 ;5，000 rpm離心10 m1n收集菌體，將菌體重懸于500 mL 5%蔗糖溶液中，加入100 μ L終濃度為0.05%的s1lwet L-77，混勻后轉入轉化杯中作為轉化液待用；待轉化的擬南芥前一天澆透水，去掉已結莢，將擬南芥倒置于轉化杯中，輕輕搖動轉化液，浸染15s后將植株移出，抖去多余轉化液，用保鮮膜包好，側置于托盤中，避光Id,然后直立培養，5d后按照同樣方式進行第二次轉化； (5)轉基因陽性苗篩選:將種子均勻播種于含50mg/L Kan的MS固體培養基中，吸去多余水分；4°C黑暗條件下春化3-4d后置于22°C，16h光照，8h黑暗光照培養箱中培養；7-14 d后轉基因陽性苗子葉濃綠并且根系發達，非轉基因苗則只有兩片子葉，最后逐漸白化死亡；待陽性苗長至4葉期后轉至營養土中，一盆一苗，人工培養室培養，覆膜2d后揭膜繼續培養； (6)轉基因植物生物學性狀觀察,對純化后的轉基因植株進行生物學性狀觀察。
3.權利要求2所述的培養高生物量轉基因植物的方法，其中所述的YEB培養基指的是含 50mg/L RifU00mg/L Str 和 100 mg/L Kan 的培養基。
4.權利要求1所 述基因編碼序列在干預花椰菜及其他植物器官發育中的應用。
【文檔編號】C12N15/29GK103451190SQ201310397370
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月5日 優先權日:2013年9月5日
【發明者】王春國, 李慧, 陳成彬, 宋文芹 申請人:南開大學