銀耳菌體在制備銀杏內酯b中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了銀耳菌體在制備銀杏內酯B中的應用，本發明通過對銀耳菌種進行擴大培養，從試管斜面、液體搖瓶、種子培養和菌體分離，利用菌體作為催化劑，轉化銀杏內酯合成銀杏內酯B，轉化液經過離心、乙酸乙酯萃取、無水酒精結晶把銀杏內酯B從發酵液分離出來。利用該方法所得到的銀杏內酯B的純度≥99％，銀杏內酯轉化率＞90％。
【專利說明】銀耳菌體在制備銀杏內酯B中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物工程【技術領域】，具體而言，涉及銀耳菌體在制備銀杏內酯B中的應用。
【背景技術】
[0002]研究證明銀杏內酯是銀杏葉中主要的活性成分之一，是一類特異有效的血小板活化因子(Platelet activating factor PAF)受體拮抗劑。血小板活化因子是由血小板和多種炎癥組織分泌產生的一種內源性磷酯，是目前發現的最有效的血小板聚集誘導劑，與許多疾病的產生、發展密切相關。銀杏內酯作為PAF受體特異性拮抗劑，具有廣泛的藥理作用。研究發現銀杏內酯B對中樞神經系統與缺血損傷有保護作用，抗休克、抗過敏、抗菌抗炎作用，以及抗器官移植中的排斥反應。同時還發現銀杏內酯B可降低肝門靜脈壓提高全身血管耐受性，說明它對肝硬化有一定的療效。銀杏內酯對于腎損傷有治療作用。這些作用都與銀杏內酯B作為PAF受體拮抗劑有關，并且它目前被認為是作用最強的、最有臨床應用前景的天然血小板活化因子(PAF)受體拮抗劑。
[0003]目前國內外生產銀杏內酯B的方法主要是從銀杏葉提取物，已見報導的銀杏內酯B的專利共有51篇，其中一部分是關于銀杏內酯B的制劑的制備(如:一種銀杏內酯B固體分散體及其制備方法，申請號:CN200910204198.4)，三篇關于銀杏內酯B及其衍生物的生理學功能(銀杏內酯B的一種新用途；申請號:CN200910092750.5 ;銀杏內酯B衍生物在制藥中的新用途，申請號:CN200910234319.X ;銀杏內酯B水解衍生物及其用途，申請號:CN201010122039.2)。而關于銀杏內酯B的制備只有九篇(一種從銀杏葉或銀杏葉提取物中提取銀杏內酯B的新方法，申請號200510063407.X ;—種從銀杏內酯混合物中分離銀杏內酯B的方法，申請號:CN201010608847.X，等等)，銀杏內酯中含有銀杏內酯A、B、C、M等同系物，這些專利是采用分離技術`從銀杏內酯混合物中分離銀杏內酯B，難以在工業上大批量生產銀杏內酯B。
[0004]本發明所使用的銀耳菌種，可選任意一種銀耳子實體，例如云南、西藏或山西的銀耳，通過組織分離即可得到。該菌不形成或很難形成子實體，分枝，有鎖狀聯合，近無色。
【發明內容】
[0005]本發明提供的是銀耳菌體在制備銀杏內酯B中的應用，以銀耳(Tremellafuciformis)為菌種通過液體培養技術得到菌體,菌體作為催化劑，轉化銀杏內酯混合物中銀杏內酯A、C和M生成銀杏內酯B，以及通過提取步驟獲得銀杏內酯B制品。
[0006]本發明以銀耳為出發菌株，進行試管菌種傳代、液體搖瓶菌種、種子罐菌種、催化轉化等步驟制得含有銀杏內酯B的反應液，含有銀杏內酯B的反應液經過離心、乙酸乙酯萃取、濃縮、酒精復溶，-20°C結晶、過濾、烘干等提取工藝得到銀杏內酯B晶體。其中所述的試管菌種的培養基為馬鈴薯葡萄糖液體培養基(葛健，王正祥，工業微生物實驗技術手冊，1994:P367);其中所述的試管斜面菌種培養工藝為斜面菌種切成4X4mm小塊菌種，挑取一小塊轉接含有馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基的試管中，20-32°C培養5-20天，制得試管斜面菌種，該試管斜面4°C保存備用；其中所述的液體搖瓶培養基組成為(單位為克/升):葡萄糖5-40,玉米粉5-25,蛋白胨I-20, KH2PO4I-6, MgSO4I-4,加水至適當體積,起始PH值為5.0-8.0，100-140°C滅菌20-60分鐘；其中所述的搖瓶培養的培養條件是:250mL三角瓶裝液量為60-150mL，接種3-4塊4X4mm小塊菌種，置于溫度22-30°C，轉速120-160轉/分鐘，培養時間24-48小時；其中所述的種子罐培養的培養基組成為(單位為克/升):葡萄糖5-40，玉米粉5-25，蛋白胨I-10，KH2PO4I-6，MgSO4I-4，消泡劑0.1-0.8，加水至適當體積，起始pH值為5.0-8.0,100-140°C滅菌20-60分鐘；其中所述種子罐的培養條件是:接種量5-10% (種子液體積/接種后體積)，培養溫度22-30°C，攪拌速率90-150轉/分鐘，通風量1: 0.3-lv/v/m，培養時間80-90小時；其中所述轉化反應液為(單位為克/升):銀杏內酯10-50，起始pH值為5.0-
8.0 ;其中所述轉化工藝條件是:種子液4000-6000轉/分鐘，離心5-20分鐘，收集菌體，菌體與反應液按1: 5-50 (重量:體積)混勻，在溫度溫度22-30°C，攪拌速率90-150轉/分鐘，通風量1: 0.3-lv/v/m，反應6-18小時；其中所述的銀杏內酯B提取工藝為，轉化液4000-600 0轉/分鐘離心10-20分鐘去除菌體，濾液用鹽酸或硫酸調節pHl.0-4.0，連續用0.3-3倍發酵液體積的乙酸乙酯萃取2-4次，合并乙酸乙酯萃取液，真空濃縮至干，殘渣用無水乙醇溶解，過濾，濾液至于_20°C結晶24-120小時，過濾，濾渣水洗，80°C干燥得到銀杏內酯B純品。
[0007]本發明所使用的銀耳菌種，可選任意一種銀耳子實體，例如云南、西藏或山西的銀耳，通過組織分離即可得到。該菌不形成或很難形成子實體，分枝，有鎖狀聯合，近無色。
[0008]本發明所述的工藝銀杏內酯B白色，純度> 99%，銀杏內酯轉化率> 90%。
[0009]根據此工藝采用的銀杏內酯測定方法為:精密稱取銀杏內酯B對照品10mg，溶于ImL色譜級甲醇中，配制成10mg/mL的標準液。0.2 μ m微孔濾膜過濾，控制進樣量為1、2、
3、4、5、6、7和8μ 1，利用高效液相色譜儀(HIMADZU (島津)LC-20AT)測定銀杏內酯B含量。色譜柱為硅膠柱(4.6.ιΧ250πιπι，10μπι)。測定條件為流動相:甲醇:0.1%磷酸溶液=10: 90 ;柱溫:30°C，流速:0.8mL/min，檢測波長:270nm。以進樣量為橫坐標(X)，以相應的峰面積為縱坐標(Y)進行線性回歸，求得銀杏內酯濃度與峰面積的線性回歸方程。吸取樣品液(發酵過程中和發酵后)的上清液少量，用0.45 μ m微孔濾膜過濾，按上述色譜條件分別測定峰面積，采用外標峰面積根據上述求得的銀杏內酯B濃度與峰面積的回歸方程計算銀杏內酯B含量。
[0010]銀杏內酯B轉化率按下列公式⑴計算:
[0011]尺=淨χ100%(I)
C。-
[0012]式中，Rt為t時間銀杏內酯B的轉化率；CQ(mg/L)，V0(mL)為O小時加入的銀杏內酯濃度和培養基體積；Ct(mg/L)和Vt(mL)為反應t小時銀杏內酯B的濃度和反應液體積。
【具體實施方式】
[0013]為了進一步闡述本發明的技術方案所涉及的材料及工藝，給出了以下實施例。這些實施例不以任何方式限制本發明的范圍。[0014]實施例1試管菌種的制備
[0015]馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基的制備:稱取馬鈴薯200g，切成片狀、加入IOOOmL水，煮沸30分鐘，過濾，濾液定各至IOOOmL,加入瓊脂20g,加熱待瓊脂完全融化后，分裝18 X 200mm的試管，每管15mL培養基，120°C滅菌30分鐘，冷卻到50°C，擺成斜面，斜面長度為試管長度的一半；將保藏的從銀耳子實體中分離的銀耳菌種切成4X4mm小塊菌種，挑取一小塊轉接含有馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基的試管中，20°C培養20天，制得試管斜面菌種，該試管斜面4°C保存備用；
[0016]實施例2含有銀杏內酯B的發酵液的制備
[0017]1、液體搖瓶菌種的制備
[0018]液體搖瓶菌種培養基配方為(單位為克/升)葡萄糖5，玉米粉5，蛋白胨1，KH2PO4I，MgSO4I，起始pH值為5.0。共配制5500mL，分裝250mL三角瓶，每瓶60mL，共84瓶，100°C滅菌60分鐘。共配制5500mL，分裝250mL三角瓶，每瓶60mL，共84瓶，將保存的從云南銀耳子實體中分離的銀耳試管斜面菌種切成4X4mm大小的小塊，挑取3塊轉接入裝有搖瓶培養基的250mL三角瓶中，置于22°C、90轉/分鐘搖床培養24小時。
[0019]2、種子iig囷種的制備
[0020]75L種子罐裝有45L種子培養基，其中種子培養基的配方為(單位為克/升):葡萄糖5，玉米粉5，蛋白胨1，KH2PO4I, MgSO4I，消泡劑0.5，起始pH值為5.0,100。。滅菌60分鐘，冷卻后，將上述培養的菌種5000mL接入種子罐中，即接種量10% (種子液體積/接種后體積)，維持罐溫22°C，罐壓0.05MPa,攪拌速度90轉/分鐘，通風量1: 0.3v/v/m,發酵時間90小時。
[0021]3、銀杏內酯B轉化
`[0022]種子液4000轉/分鐘離心20分鐘收集菌體，得到鮮菌體2kg。準確稱取銀杏內酯100克，加蒸餾水10L，用鹽酸調節PH5.0，配成10克/升的反應液，2kg與IOL反應液(I: 5，重量/體積)混合，在溫度22°C，攪拌速率90轉/分鐘，通風量1: 0.3v/v/m，反應18小時。
[0023]4、銀杏內酯B的提取
[0024]上述反應液4000轉/分鐘離心20分鐘去除菌體，濾液用鹽酸或硫酸調節pH4.0,連續用3倍發酵液體積的乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯萃取液，真空濃縮至干，殘渣用無水乙醇溶解，過濾，濾液至于_20°C結晶24小時，過濾，濾渣水洗，80°C干燥得到銀杏內酯B純品。經分析銀杏內酯B含量99.1%，轉化率90.8%。
[0025]實施例3含有銀杏內酯B的發酵液的制備
[0026]1、搖瓶菌種的制作
[0027]搖瓶培養基的配方為(單位為克/升):葡萄糖20，玉米粉15，蛋白胨6，KH2P043，MgS042，起始pH值為6.5，共配制4500mL,分裝250mL三角瓶(共50瓶)，每瓶90mL, 120。。滅菌40分鐘。冷卻后，將保存的從山西銀耳子實體中分離的銀耳試管斜面菌種切成4X4mm大小的小塊，試管斜面菌種切成4X 4mm大小的小塊，挑取4塊轉接入裝有搖瓶培養基的三角瓶中，置于25°C、120轉/分鐘搖床上，培養36小時。
[0028]2、種子罐菌種的制備
[0029]100L種子罐裝有50L種子培養基，其中種子罐培養基的配方為(單位為克/升):葡萄糖20，玉米粉15，蛋白胨6，KH2P043, MgS042，消泡劑0.1，起始pH值為6.5，120°C滅菌40分鐘。冷卻后，將上述培養的菌種4000mL接入100L種子罐中，即接種量7.4% (種子液體積/接種后體積)，種子罐中發酵液的總體為54L ;維持罐溫25°C，罐壓0.05MPa,攪拌速度120轉每分鐘，通風量I: 0.5v/v/m，培養時間90小時。
[0030]3、銀杏內酯B轉化
[0031]種子液5000轉/分鐘離心12分鐘收集菌體，得到鮮菌體3.5kg。準確稱取銀杏內酯1250克，加蒸餾水50L，用鹽酸調節pH6.5，配成25克/升的反應液，2kg與50L反應液(I: 25，重量/體積)混合，在溫度25°C，攪拌速率120轉/分鐘，通風量1: 0.8v/v/m,反應12小時。
[0032]4、銀杏內酯B的提取
[0033]上述反應液5000轉/分鐘離心15分鐘去除菌體，濾液用鹽酸或硫酸調節pH2.5，連續用2倍發酵液體積的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，真空濃縮至干，殘渣用無水乙醇溶解，過濾，濾液至于-20°C結晶72小時，過濾，濾渣水洗，80°C干燥得到銀杏內酯B純品，經分析銀杏內酯B含量99.5 %，轉化率95.8%。
[0034]實施例4含有銀杏內酯B的發酵液的制備
[0035]1、搖瓶菌種的制作
[0036]搖瓶培養基的配方為(單位為克/升):葡萄糖40，玉米粉25，蛋白胨10，KH2P046，MgS044,起始pH值為8.0。共配制200 0mL，分裝250mL三角瓶(共10瓶)，每瓶150mL，140°C滅菌20分鐘。冷卻后，將保存的從西藏銀耳子實體中分離的銀耳試管斜面菌種切成4X4mm大小的小塊，挑取4塊轉接入裝有搖瓶培養基的三角瓶中，置于30°C、150轉/每分鐘搖床上培養46小時。
[0037]2、種子罐菌種的制備
[0038]50L種子罐裝有30L種子培養基，其中種子罐培養基的配方為(單位為克/升):葡萄糖40，玉米粉25，蛋白胨10，KH2P046,MgS044,消泡劑0.8，起始pH值為8.0,140°C滅菌20分鐘。冷卻后，將上述液體搖瓶培養的菌種1600mL接入50L種子罐中，即接種量5.1%(種子液體積/接種后體積)；維持罐溫30°C，罐壓0.05MPa,攪拌速度150轉/分鐘，通風量1: lv/v/m，發酵時間90小時。
[0039]3、銀杏內酯B轉化
[0040]種子液6000轉/分鐘離心5分鐘收集菌體，得到鮮菌體1.2kg。準確稱取銀杏內酯3000克，加蒸餾水60L，用氫氧化鈉調節pH8.0，配成50克/升的反應液，1.2kg鮮菌體與60L反應液(I: 50，重量/體積)混合，在溫度30°C，攪拌速率150轉/分鐘，通風量1: lv/v/m，反應6小時。
[0041]4、銀杏內酯B的提取
[0042]上述反應液6000轉/分鐘離心10分鐘去除菌體，濾液用鹽酸或硫酸調節pHl.0，連續用0.3倍發酵液體積的乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯萃取液，真空濃縮至干，殘渣用無水乙醇溶解，過濾，濾液至于-20°C結晶120小時，過濾，濾渣水洗，80°C干燥得到銀杏內酯B純品。經分析銀杏內酯B含量99.9 %，轉化率98.5 %。
[0043]以上所述，僅為本發明的【具體實施方式】，但本發明的保護范圍并不局限于此，任何不經過創造性勞動想到的變化或替換，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。因此，本發明的保護范圍應該以權 利要求書所限定的保護范圍為準。
【權利要求】
1.銀耳菌體在制備銀杏內酯B中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于以銀耳為出發菌株，通過試管斜面菌種、液體搖瓶菌種、種子罐菌種、離心獲得菌體，菌體催化銀杏內酯合成含有銀杏內酯B的反應液，含有銀杏內酯B的反應液經過離心、乙酸乙酯萃取、濃縮、酒精復溶，-20°C結晶、過濾、烘干等提取工藝得到銀杏內酯B晶體。
3.根據權利要求1所屬的應用，其中所述的銀耳菌體菌種為從云南、山西和西藏的任意一種金耳子實體中分離出的金耳伴生菌菌種。
4.根據權利要求1所述的應用，其特征在于:銀耳菌種通過液體搖瓶、種子罐和菌體轉化銀杏內酯，分離提取得到銀杏內酯B。其中所述的液體搖瓶種子培養基組成為(單位為克/升):葡萄糖5-40，玉米粉5-25，蛋白胨I-20，KH2PO4I-6，MgSO4I-4，加水至適當體積，起始PH值為5.0-8.0,100-140°C滅菌20-60分鐘；其中所述的種子罐培養基組成為(單位為克/升):葡萄糖5-40，玉米粉5-25，蛋白胨I-10，KH2PO4I-6，MgSO4I-4，消泡劑0.1-0.8，加水至適當體積，起始pH值為5.0-8.0,100-140°C滅菌20-60分鐘；其中所述轉化銀杏內酯反應液組成為(單位為克/升):銀杏內酯(包括銀杏內酯A、B、C和M) 10-50，起始pH值為5.0-8.0 ;其中所述的搖瓶培養的培養條件是:250mL三角瓶裝液量為60-150mL，接種3-4塊4X4mm小塊菌種，置于溫度22-30°C，轉速120-160轉/分鐘，培養時間24-48小時；其中所述種子罐的培養條件是:接種量5-10% (種子液體積/接種后體積)，培養溫度22-30°C，攪拌速率90-150轉/分鐘，通風量1: 0.3-lv/v/m，培養時間80-90小時；其中所述的轉化工藝條件是:種子液4000-6000轉/分鐘，離心5-20分鐘，收集菌體，菌體與反應液按1: 5-50 (重量:體積)混勻，在溫度22-30°C，攪拌速率90-150轉/分鐘，通風量1: 0.3-Iv/v/m，轉化6-18小時；按照該轉化工藝，其中在進行搖瓶培養之前，首先將銀耳菌體的斜面菌種接入新配制的馬鈴薯葡萄糖培養基中進行傳代培養，培養溫度22-30°C，培養時間24-248小時。
5.根據權利要求4所述 的應用，轉化液4000-6000轉/分鐘離心，濾液用鹽酸或硫酸調節pHl.0-4.0，連續用0.3-3倍發酵液體積的乙酸乙酯萃取2-4次，合并乙酸乙酯萃取液，真空濃縮至干，殘渣用無水乙醇溶解，過濾，濾液至于_20°C結晶24-120小時，過濾，濾渣水洗，80°C干燥得到銀杏內酯B純品。
6.根據權利要求4所述的應用，所制得的銀杏內酯B白色，純度>99%，銀杏內酯轉化率> 90%。
7.根據權利要求4所述的應用，其特征在于包括如下步驟: 在銀杏內酯(包括銀杏內酯A、B、C和M)加入蒸餾水和酸，調節pH6.0-7.0，配成20-30克銀杏內酯/升的反應液，將銀耳菌體和反應液按照重量/體積1: 20-30混合，在溫度20-30°C，攪拌速率100-150轉/分鐘，反應10小時以上； 反應之后的反應液按照4000-6000轉/分鐘離心10-20分鐘去除菌體，濾液用鹽酸或硫酸調節PH2.0-3.0，連續用乙酸乙酯萃取2-4次，合并乙酸乙酯萃取液，真空濃縮至干，殘渣用無水乙醇溶解，過濾，濾液至于_20°C以下結晶70小時以上，過濾，濾渣水洗，干燥得到銀杏內酯B。
【文檔編號】C12P17/18GK103451250SQ201310393201
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月2日 優先權日:2013年9月2日
【發明者】張志才 申請人:張志才