一種以鈣化海藻酸鈉固載酶的優(yōu)化方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種以鈣化海藻酸鈉固載酶的優(yōu)化方法，其特征是：以超臨界二氧化碳處理鈣化海藻酸鈉固載酶的凝膠小球。超臨界狀態(tài)下的二氧化碳可以以其特殊的流體性質(zhì)穿透海藻酸鈉凝膠外殼，與鈣化海藻酸鈉凝膠中的鈣離子結(jié)合形成納米級的球狀碳酸鈣小顆粒并附著在海藻酸鈉固載酶凝膠體系的外殼，從而大大加強了該凝膠外殼的強度，使得該固載酶體系的循環(huán)利用次數(shù)大幅增加。該優(yōu)化方法不僅增加了酶的使用次數(shù)節(jié)省了成本，且操作過程中無任何有害物質(zhì)產(chǎn)生，是一種易于操作、節(jié)約資源、對環(huán)境友好的優(yōu)化方法。
【專利說明】一種以鈣化海藻酸鈉固載酶的優(yōu)化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種以鈣化海藻酸鈉固載酶的優(yōu)化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著生物【技術(shù)領(lǐng)域】的發(fā)展，酶促反應越來越多的應用于工業(yè)及醫(yī)藥生產(chǎn)。然而酶 促反應中最重要的元素-生物酶具有不易保存、難于回收利用等缺點。因此科學家們研究 出以各種高分子固載酶的方法來解決這一問題，其中以鈣化海藻酸鈉固載酶的方法尤為簡 便易行而被廣泛應用。海藻酸鈉是一種天然高分子，性質(zhì)溫和無毒害，常溫下溶于水，可與 二價陽離子結(jié)合交聯(lián)形成凝膠。鈣化海藻酸鈉固載酶的方法是將海藻酸鈉與酶混合溶于水 中，將此液體滴加于二價鈣離子的鹽溶液中形成凝膠顆粒，再將該凝膠顆粒作為一個催化 整體應用于酶促反應中，如需終止反應只需將該凝膠顆粒取出進行回收利用。
[0003] 然而海藻酸鈉與二價陽離子的結(jié)合并不穩(wěn)定，鈣化海藻酸鈉固載酶的凝膠顆粒經(jīng) 5-8次循環(huán)利用就會破碎，這樣酶就無法再回收利用且污染了反應體系。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 本發(fā)明的目的就是為了解決上述問題。本發(fā)明公開了一種方法可有效加強鈣化海 藻酸鈉凝膠外殼的強度，使得以鈣化海藻酸鈉固載酶的循環(huán)利用次數(shù)大幅增加，從而優(yōu)化 了該固載方法。該方法利用超臨界二氧化碳處理鈣化海藻酸鈉固載酶的凝膠顆粒，不僅增 加了酶的使用次數(shù)節(jié)省了成本，且操作過程中無任何有害物質(zhì)產(chǎn)生，是一種易于操作、節(jié)約 資源、對環(huán)境友好的優(yōu)化方法。
[0005] 首先將酶與海藻酸鈉按一定比例混合溶于水中，將此液體以針管吸出，逐滴滴加 于2%氯化鈣溶液中，形成凝膠小球。將此凝膠小球凍干以備后用。其中酶與海藻酸鈉最優(yōu) 比為 1 :0· 2-1 :0· 5。
[0006] 然后將凍干后的凝膠小球置于超臨界二氧化碳反應釜中，加入去離子水，以超臨 界二氧化碳處理。最優(yōu)化條件為：溫度32°C -35°C;壓力7. 5-8. 5MPa ;水與凝膠小球體積比 為3 :1-2 :1 ;處理時間1-2小時。
[0007] 目前，超臨界二氧化碳以其介于氣體和液體之間的特殊流體性質(zhì)多用于萃取、清 洗、干燥等技術(shù)，本發(fā)明所示的方法首次提出了超臨界二氧化碳應用于加固海藻酸鈉固載 酶外殼。同時，超臨界二氧化碳臨界值T=31. 1°C，P=7. 38MPa，在實驗研究或工業(yè)應用上是 較易達到的條件。
[0008] 實驗證明在本發(fā)明的優(yōu)化方法中超臨界狀態(tài)下的二氧化碳可以以其特殊的流體 性質(zhì)穿透海藻酸鈉凝膠外殼，與鈣化海藻酸鈉凝膠中的鈣結(jié)合形成納米級的球狀碳酸鈣小 顆粒并附著在海藻酸鈉固載酶凝膠體系的外殼，從而大大加強了該凝膠外殼的強度，使得 該固載酶體系的循環(huán)利用次數(shù)大幅增加。經(jīng)超臨界二氧化碳處理后的鈣化海藻酸鈉固載酶 體系的循環(huán)利用次數(shù)可由原來的5-8次提升為30次。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0009] 附圖是本發(fā)明優(yōu)化方法及效果的示意圖。
[0010] 注釋：1-酶；2-超臨界二氧化碳處理前的鈣化海藻酸鈉固載酶凝膠小球；3-超臨 界二氧化碳處理后的鈣化海藻酸鈉固載酶凝膠小球；4-超臨界二氧化碳高壓反應釜。
【具體實施方式】
[0011] 第一步：酶的固載
[0012] 將海藻酸鈉溶于去離子水中并充分攪拌,待攪拌均勻后,加入液態(tài)酶,充分混合。 以6號針頭的一次性注射器吸出后不斷滴加于2%的CaCl2溶液中，使其凝成直徑為2-3mm 的小球。將小球浸泡于2% CaCl2的溶液中靜置40分鐘，以布氏漏斗抽濾并放于凍干機中 凍干10小時。其中各原料比例為：海藻酸鈉：去尚子水：酶為I :200 :0. 2。
[0013] 第二步：超臨界二氧化碳處理，并以實驗檢測循環(huán)利用次數(shù)
[0014] 超臨界二氧化碳處理后鈣化海藻酸鈉固載酶的凝膠小球明顯變得堅硬具有韌性， 再以實驗檢測其循環(huán)利用效果。下面的實施例將結(jié)合說明書附圖對本發(fā)明予以進一步說 明，但并不因此而限制本發(fā)明。實施例和對比例中所得的實驗結(jié)果列于表1，實施例和對比 例中所用的海藻酸鈉及酯水解酶均購于北京百靈威科技有限公司。
[0015] 實施例
[0016] 本實施例所選取的反應為標準化酯水解酶催化水解對硝基苯酚丁酸酯的反應。該 反應具有反應迅速、靈敏、產(chǎn)率較高等優(yōu)點，可快捷的檢測出本發(fā)明方法的優(yōu)化效果。
[0017] 取制備好凍干后的固載有酶（1)的鈣化海藻酸鈉凝膠小球（2)0. 02g放置于IOml 的超臨界二氧化碳高壓反應釜（4)中加入2ml去離子水，使得凝膠小球與水的體積比為1 : 2。將反應釜密封，打入IOml超臨界二氧化碳，保持體系溫度在35°C、壓力在7. 5MPa，攪拌 反應2小時。
[0018] 取出處理好的鈣化海藻酸鈉固載酶凝膠小球（3)放入20ml燒杯中，加入3ml去離 子水，再取〇. 〇6mmol對硝基苯酚丁酸酯滴入反應體系中。將反應體系置于恒溫水浴35°C中 反應，攪拌30分鐘后停止，以紫外可見分光光度計分析表征。紫外波段在311nm下的吸光 度可作為水解產(chǎn)物對硝基苯酚的產(chǎn)率判斷依據(jù)。然后將凝膠小球取出，重新添加反應物，重 復上述實驗，其實驗結(jié)果列于表1。由表1中實施例可看出經(jīng)超臨界二氧化碳處理后的凝 膠小球（3)可重復利用達30次，由于受到酶活性難以保持時間過長的限制，在重復26次以 后，凝膠小球雖然完好，但其中包載的酶大部分已經(jīng)失活，導致產(chǎn)率下降。
[0019] 對比例
[0020] 以相同條件下的鈣化海藻酸鈉固載酶凝膠小球，但不經(jīng)過超臨界二氧化碳處理， 進行相同的反應。實驗發(fā)現(xiàn)（見表1)重復利用5次后該凝膠小球破裂，無法再繼續(xù)參與反 應，并使反應體系變得渾濁，污染了反應系統(tǒng)。
[0021] 表 1
[0022]
【權(quán)利要求】
1. 一種以鈣化海藻酸鈉固載酶的優(yōu)化方法，其特征是，利用超臨界二氧化碳處理鈣化 海藻酸鈉固載酶的凝膠顆粒。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以鈣化海藻酸鈉固載酶的優(yōu)化方法，其特征是，加入去 離子水，以超臨界二氧化碳處理，最優(yōu)化條件為：溫度32°C -35°C;壓力7. 5-8. 5MPa ;水與凝 膠小球體積比為3 :1-2 :1 ;處理時間1-2小時。
【文檔編號】C12N11/04GK104419698SQ201310393095
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月3日
【發(fā)明者】楊曉曦 申請人:楊曉曦