一種以溫度高效調控水相中酶促反應的方法
【專利摘要】本發明公開了一種以溫度高效調控水相中酶促反應的方法，其特征是：合成智能高分子凝膠PNIPAM，并將該凝膠研磨成顆粒添加到海藻酸鈉固載酶的催化體系中，以32℃為調控的分界溫度，利用溫度的小幅度變化，循環控制水相中酶促反應速率，實現對反應的“開”、“關”式調控。本發明實現了對水相中酶促反應的高效、靈敏、可循環的控制，解決了水相中酶促反應難于控制反應速率的問題。
【專利說明】一種以溫度高效調控水相中酶促反應的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種以溫度高效調控水相中酶促反應的方法。
【背景技術】
[0002] 隨著工業及生物【技術領域】的發展以生物酶為催化劑的酶促反應越來越多的應用 于工業及醫藥生產。酶促反應具有高效、專一、反應迅速等優點，同時由于生物酶活性的特 殊要求酶促反應多發生在水相體系中。然而正是因為酶促反應迅速的特點，水相中的酶促 反應很難控制其反應進程及速率，給研究酶促反應機理和大量酶促反應的工業投產帶來了 一定的困難和危險。
[0003] 現有的酶促反應調控方法多為宏觀上單一的反應條件控制如：溫度、pH的調節， 這些技術只能在宏觀上微小的改變酶促反應的進程，并不能真正起到快速、有效控制反應 進行或停止的作用。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的就是為了解決上述問題。相對于現有技術，本發明可以實現從微觀 上迅速、簡便的控制酶促反應的進行或停止。本發明通過在固載酶的體系中添加智能高分 子凝膠顆粒，在微觀上利用智能高分子凝膠顆粒對于溫度變化靈敏感應的收縮或膨脹來開 放或關閉酶與反應體系間的傳質作用，就等同于在酶促反應中安裝了"溫敏式開關"，實現 了利用溫度高效、靈敏的調控酶促反應速率的目的。
[0005] 本發明第一步合成具有溫度敏感效應的智能高分子凝膠PNIPAM，該種智能高分子 凝膠的響應溫度為32°C，在32°C以上智能高分子凝膠PNIPAM在水中處于緊縮狀態，其結構 塌縮；而在32°C以下智能高分子凝膠PNIPAM在水中處于舒展狀態，其結構蓬松，并且以上 收縮及舒張的行為是可逆的。智能高分子凝膠PNIPAM的合成方法參考文獻《PEG致孔快速 響應pH/溫度雙重敏感性PNIPAM/SA水凝膠的制備與性能》。
[0006] 本發明第二步對PNIPAM凝膠凍干后研磨粉碎，其凝膠顆粒粒徑在100-200微米 間。將該凝膠顆粒添加于酶的固載體系中。
[0007] 本發明第三步實現酶的固載。將海藻酸鈉溶于水中同時添加一定量的酶和PNIPAM 凝膠顆粒，混合均勻后將該懸濁液滴加與2%的氯化鈣溶液中形成均勻固載有酶及智能高 分子PNIPAM凝膠顆粒的鈣化海藻酸鈉凝膠小球（其中海藻酸鈉及酶均購于北京百靈威科 技有限公司）。將該固載體系凍干并適量添加于所需反應中。在該步驟中的優選條件為：
[0008] 海藻酸鈉與水的比例為：1 : 180-1 : 220 ;海藻酸鈉與PNIPAM凝膠顆粒的比例 為：1 : 1-1 : 1.5;海藻酸鈉與酶的比例為：1 : 0. 2-1 : 0. 3;凍干時間：8-12小時。
[0009] 本發明第四步實現酶促反應的高效調控。將相應的固載有酶和PNIPAM凝膠顆粒 的催化體系應用于催化酶促反應中如：酯水解酶催化酯水解反應或手性拆分反應等。以 32°C為調控的分界溫度分別在水相中試驗酶促反應的反應速率。實驗證明由于32°C以下 PNIPAM凝膠顆粒在水中處于舒展狀態，其結構蓬松，堵塞了酶的活性中心位點并使水相反 應體系與酶的固載體系間的傳質作用減弱，使得酶促反應速率大大降低從而抑制了酶促反 應的進行。而另一方面，32°C以上PNIPAM凝膠顆粒在水中處于緊縮狀態，其結構塌縮，酶的 活性中心位點得以裸露并使水相反應體系與酶的固載體系間的傳質作用增強，使得酶促反 應速率大大提高從而促進了酶促反應的進行。
[0010] 而本發明的這一調控行為是可循環的，以32°C為調控的分界溫度，利用溫度小幅 度上下變化來控制水相中酶促反應速率，實現對反應的"開"、"關"式調控。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011] 附圖1是本發明調控原理及方法的示意圖。
[0012] 注釋：1_鈣化海藻酸鈉；2-智能高分子PNIPAM凝膠顆粒；3-緊縮狀態下的智能高 分子PNIPAM凝膠顆粒；4-酶；5-在水中溫度高于32°C ;6_在水中溫度低于32°C
【具體實施方式】
[0013] 第一步：PNIPAM的合成
[0014] 將0. 94g的NIPAM單體、0. 06g的海藻酸鈉和0. 02g的交聯劑NMBA溶于4ml去離 子水中，加入〇.〇2g的PEG1000于上述溶液中，攪拌均勻；然后，加入0.02g的引發劑APS、 〇. 〇2g的促進劑TMEDA，密封燒杯，在室溫下反應48h ;取出凝膠并切成薄片用去離子水浸泡 一周，定期換水以洗去PEG1000和未反應的單體。
[0015] 第二步：制備PNIPAM凝膠顆粒
[0016] 第一步制備完成后將凝膠凍干l〇h，取出后研磨成粉末粒徑在100-200微米間。干 燥避光處保存以備后用。
[0017] 第三步：酶的固載
[0018] 將智能高分子PNIPAM與海藻酸鈉混合，溶于去離子水中并充分攪拌。待體系攪 拌均勻后，加入液態酯水解酶，充分攪拌。以6號針頭的一次性注射器吸出后不斷滴加于 2%的CaCl 2溶液中，使其凝成直徑為2-3mm的小球。將小球浸泡于2% CaCl2的溶液中 靜置40分鐘，以布氏漏斗抽濾并放于凍干機中凍干10小時。其中各原料比例為：海藻酸 鈉 ：PNIPAM :去離子水：酯水解酶為I : 1 : 200 : 0· 2。
[0019] 第四步：酶促反應的調控
[0020] 本發明將結合說明書附圖進一步說明
[0021] 如說明書附圖所示，在酶促反應中以本發明所示的方法以鈣化海藻酸鈉1包載智 能高分子PNIPAM凝膠顆粒2及酶4于催化體系中，在水中溫度低于32°C (6)時智能高分子 PNIPAM凝膠顆粒2處于舒展狀態，像"門"一樣擋在酶4的外部從而抑制酶促反應的發生； 而在水中溫度高于32°C (5)時智能高分子PNIPAM凝膠顆粒3處于緊縮狀態，酶4的活性中 心位點得以裸露從而促進酶促反應的發生。這一調控作用具有對溫度極為靈敏的響應性， 以實施例中標準化酯水解酶催化水解對硝基苯酚丁酸酯的反應為例說明，以反應產率衡量 其具體突變溫度的實驗數據列于表1。
[0022] 另外本發明所示的方法，是可利用溫度的小幅度變化，循環控制酶促反應速率的 方法。以實施例中標準化酯水解酶催化水解對硝基苯酚丁酸酯的反應為例說明，表2中的 實驗數據以反應產率為衡量條件，展示出溫度在30°C、35°C循環變化時本發明所示方法對 反應的"開"、"關"式調控。
[0023] 下面的實施例將對本發明予以進一步說明，但并不因此而限制本發明。實施例和 對比例中所得的實驗結果列于表3,實施例和對比例中所用的海藻酸鈉及酯水解酶均購于 北京百靈威科技有限公司。
[0024] 實施例
[0025] 本實施例選取標準化酯水解酶催化水解對硝基苯酚丁酸酯的反應，該反應具有反 應迅速、靈敏、產率較高等優點，可快捷的檢測出本發明方法的調控效果。
[0026] 取制備好凍干后的固載有酶、智能高分子凝膠顆粒的鈣化海藻酸鈉凝膠小球 0. 02g放置于20ml的燒杯中加入3ml去離子水，再取0. 06mmol對硝基苯酚丁酸酯滴入反應 體系中。將反應體系置于恒溫水浴中反應，依所需條件不同調整反應溫度，其中表1所示反 應溫度分別為：20°C、25°C、30°C、31°C、32°C、33°C、34°C、35°C、40°C、45°C ;表 2 所示反應溫 度分別為：l-30°C、2-35°C、3-30°C、4-35°C、5-3(rC、6-35°C ;表3所示實施例反應溫度分別 為20°C、25°C、30°C、35°C、40°C、45°C、50°C。反應30min后停止，以紫外可見分光光度計分 析表征。紫外波段在311nm下的吸光度可作為水解產物對硝基苯酚的產率判斷依據。
[0027] 對比例
[0028] 取制備好凍干后的固載有酶，但并未固載智能高分子凝膠顆粒的鈣化海藻酸鈉凝 膠小球0. 02g放置于20ml的燒杯中加入3ml去離子水，取反應溫度20°C、25°C、30°C、35°C、 40°C、45°C、50°C。其反應條件與表3實施例中完全相同，區別是采用固載體系中未添加智 能高分子凝膠顆粒，沒有相應的溫度調控效果，反應產率保持在恒定較高的狀態。其具體的 實驗結果列于表3中。
【權利要求】
1. 一種以溫度高效調控水相中酶促反應的方法，其特征是，將合成的智能高分子 PNIPAM凝膠凍干后研磨粉碎。
2. 根據權利要求1所述的一種以溫度高效調控水相中酶促反應的方法，其特征是，將 固載有酶及智能高分子PNIPAM凝膠顆粒的海藻酸鈉制成鈣化海藻酸鈉小球。
3. 根據權利要求1所述的一種以溫度高效調控水相中酶促反應的方法，其特征是，以 32°C為調控的分界溫度，利用溫度小幅度上下變化來控制水相中酶促反應速率，實現對反 應的"開"、"關"式調控。
【文檔編號】C12N11/10GK104419697SQ201310393094
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月3日 優先權日:2013年9月3日
【發明者】楊曉曦 申請人:楊曉曦