脂肪間充質干細胞在制備肝癌化療增敏制劑中的應用的制作方法

脂肪間充質干細胞在制備肝癌化療增敏制劑中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于干細胞與生物【技術領域】，涉及脂肪間充質干細胞的新應用。首先本發明提供了一種構建攜帶miR-122的脂肪來源的間充質干細胞的方法。另外，本發明了還公開了攜帶miR-122的脂肪來源的間充質干細胞用途。攜帶miR-122的脂肪來源的間充質干細胞在制備肝癌化療增敏制劑的應用。利用本發明所述的攜帶miR-122的AMSC制備化療增敏劑，并與臨床常規化療藥物聯合應用于肝癌荷瘤小鼠模型的化療，可顯著提高異位或原位腫瘤組織對化療藥物的敏感性，而增強化療效果，阻滯肝癌進展。并可降低化療藥物的使用劑量，減輕化療副反應。本發明為制備新型的肝癌化療靶向增敏劑提供了技術支持，并為肝癌的系統化療提供了新方法。
【專利說明】脂肪間充質干細胞在制備肝癌化療增敏制劑中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于干細胞與生物【技術領域】，涉及間充質干細胞的新應用，具體涉及攜帶miR-122的脂肪來源的間充質干細胞的構建方法及其在制備肝癌化療增敏制劑中的應用。
【背景技術】
[0002]原發性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是常見的惡性腫瘤之一,其死亡率在全球惡性腫瘤死亡率中排第三位。而在我國，肝癌死亡率僅次于胃癌，居我國惡性腫瘤死亡率第二位。據統計，我國每年肝癌死亡人數約11萬，是全球肝癌發病率、死亡率最高的國家。化療是目前腫瘤治療的主要手段之一，已在乳腺癌、前列腺癌等的治療中顯示出積極意義。但肝癌化療敏感性差，自上世紀50年代以來，肝癌的系統化療進展不大，單藥治療有效率通常不高于20%，且毒副作用大，可重復性差。過去10年中僅發現有I種激酶抑制劑型化療藥物索拉非尼(sorafenib)對肝癌治療有所幫助。因此探索新型的化療增敏手段，提高肝癌的化療敏感性，對于肝癌的治療具有重要意義。

【發明內容】

[0003]本發明的目的是通過構建攜帶miR-122的AMSC，并聯合應用于肝癌荷瘤小鼠模型的化療方案，達到增強化療效果的作用，從而為制備新型的肝癌化療靶向增敏劑提供技術平臺，為肝癌的系統化療提供新方法。
[0004]首先本發明提供了一種構建攜帶miR-122的脂肪來源的間充質干細胞(AMSC-miR-122)的方法。
[0005]一種構建攜帶miR-122的脂肪來源的間充質干細胞(AMSC-miR-122)的方法，包括如下步驟:`
[0006]I)脂肪來源的間充質干細胞(AMSC)的制備:脂肪組織經DPBS清洗后，用I型膠原酶37°C消化I小時，然后室溫離心后棄去上層油脂和液體，細胞沉淀以DPBS重懸洗滌2遍后離心收集細胞，接種在含5%胎牛血清的低糖DMEM培養基的培養瓶內，細胞貼壁增殖接近80%融合時，進行消化、傳代，依此法傳代2-4次，達到純化和擴增間充質干細胞的目的，收集細胞凍存、復蘇備用。
[0007]2)所述的攜帶miR-122的脂肪來源的間充質干細胞(AMSC-miR-122)是按以下方法制備的:miR-122 表達質粒(pGCMV/EGFP/miR-122/Blasticidine)通過電轉法導入 AMSC，以EGFP指示轉染效率(轉染效率約70%)，以轉染無關has-miRNA的表達質粒作為對照，以表達質粒所帶的Blasticidine抗性基因進行篩選。篩選4_6周后可獲得穩定表達miR-122的 AMSC-miR-122ο
[0008]進一步的，所述脂肪組織為成人脂肪組織，所述miR-122為has-miR-122(has-miR-122 序列為:UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG)。
[0009]所述方法得到的攜帶miR-122的脂肪來源的間充質干細胞，具有間充質干細胞的基本特性。[0010]所述方法得到的攜帶miR-122的脂肪來源的間充質干細胞，可提高肝癌細胞對化療藥物的敏感性。其中，所述肝癌細胞為HepG2細胞。
[0011]另外，本發明了還公開了攜帶miR-122的脂肪來源的間充質干細胞用途。
[0012]攜帶miR-122的脂肪來源的間充質干細胞在制備肝癌化療增敏制劑的應用。(優選為攜帶miR-122的人脂肪來源的間充質干細胞)
[0013]所述肝癌化療增敏制劑可提高異位肝癌和原位肝癌對肝癌化療藥物的敏感性。
[0014]所述肝癌化療藥物為Sorafenib、5_FU 或 Doxorubicin。
[0015]所屬制劑的劑型為注射劑。
[0016]下面對本發明做進一步的描述。
[0017]本發明公開了一種構建攜帶miR-122的脂肪來源的間充質干細胞(AMSC-miR-122)的方法，包括如下步驟:
[0018]I)脂肪來源的間 充質干細胞(AMSC)的制備:人脂肪組織(為吸脂手術采集的成人脂肪組織或通過保存液保存的手術廢棄的脂肪組織)經DPBS清洗后，用I型膠原酶37°C消化I小時，然后室溫離心后棄去上層油脂和液體，細胞沉淀以DPBS重懸洗滌2遍后離心收集細胞，接種在含5%胎牛血清的低糖DMEM培養基的培養瓶內，細胞貼壁增殖接近80%融合時，進行消化、傳代，依此法傳代2-4次，達到純化和擴增間充質干細胞的目的，收集細胞凍存、復蘇備用。
[0019]2)所述的攜帶miR-122的脂肪來源的間充質干細胞(AMSC-miR-122)是按以下方法制備的:has_miR-122 表達質粒(pGCMV/EGFP/has-miR-122/Blasticidine)通過電轉法導入AMSC，以EGFP指示轉染效率，轉染效率約70%。以轉染無關has-miRNA的表達質粒作為對照，以表達質粒所帶的Blasticidine抗性基因進行篩選。篩選4_6周后可獲得穩定表達 miR-122 的 AMSC-miR-122。
[0020]3)所訴的 hsa-miR-122 序列為:UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG。
[0021]所述的攜帶has-miR-122的AMSC采用熒光定量PCR鑒定miR-122的表達:消化收集細胞后，采用Life technology公司的AM1561試劑盒抽提miRNA，并采用廣州銳博生物的miRQ0000421-l-2試劑盒進行逆轉錄，及熒光定量PCR的分析。PCR體系為:SYBR_10ul ；miR-122 上游引物-2ul ;miR_122 下游引物 _2ul ；R0X2-0.4ul ;水_1.6111 ;模板 _4ul ;PCR條件為:95°C預變性30s，然后95°C 5s,60°C 30s,40個循環。
[0022]本發明了還公開了攜帶miR-122的脂肪來源的間充質干細胞在制備肝癌化療增敏劑中的應用，從而為肝癌的系統化療提供新方法。
[0023]本發明公開了一種AMSC-miR-122在體外提高肝癌細胞化療敏感性的應用。
[0024]所述的肝癌細胞為H印G2細胞。
[0025]所述的應用為，AMSC-miR-122以 transwell 板(FALCON 公司，353090)與 H印G2細胞共培養3天，胰酶消化收集肝癌細胞后接種于細胞培養板，給予梯度濃度的肝癌常規化療藥物48小時后，進行肝癌細胞增殖和細胞凋亡的評估，以未與AMSC-miR-122共培養(單獨培養)的HepG2作為對照。本發明所述的攜帶miR-122的脂肪來源的間充質干細胞(AMSC-miR-122)在體外與HepG2肝癌細胞共培養后，能顯著提高肝癌細胞對化療藥物的敏感性，具體表現為肝癌化療藥物對與AMSC-miR-122共培養后的肝癌細胞增殖抑制和促凋亡作用都明顯增強。[0026]所述的肝癌細胞增殖和細胞凋亡的評估分別采用細胞芯片法和流式Annexin V/PI凋亡檢測。
[0027]所述的細胞芯片法，步驟如下:
[0028]1.胰酶消化收集共培養3天的H印G2肝癌細胞，及單獨培養的H印G2細胞，按5000/孔，接種于96孔細胞芯片板(型號DC96-A-NT)；
[0029]2.培養24小時后，再分別給予梯度濃度的Sorafenib, Doxorubicin和5-FU ；
[0030]3.繼續培養48小時，采用細胞芯片儀(ACEA Biosciences, Inc)進行肝癌細胞增殖的實時評估。
[0031]所述的流式Annexin V/PI凋亡檢測,步驟如下:
[0032]1.胰酶消化收集共培養3天的H印G2肝癌細胞，及單獨培養的H印G2細胞，按5 X IO5/孔，接種于6孔細胞培養板；
[0033]2.培養24小時后，再分別給予IC5tl濃度的Sorafenib, Doxorubicin和5-FU ；
[0034]3.繼續培養48小時后，胰酶消化收集細胞，調整細胞數為2-5X IO5/樣本。采用BD公司的Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒(貨號:556547),按試劑盒說明書進行流式標記；
[0035]4.突光標記后采用BD流式細胞儀(Accuri C6)進行凋亡檢測分析；
[0036]所述的Annexin V/PI凋亡結果分析為:在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，為FITC-/P1-;左上象限是壞死細胞，為FITC-/PI+ ;而右下和右上象限分別為早期凋亡和晚期細胞，為FITC`+/P1-和FITC+/PI+。
[0037]本發明還公開了一種AMSC-miR-122在提高肝癌荷瘤裸鼠模型化療藥物敏感性中的應用。
[0038]所述的肝癌荷瘤裸鼠模型是通過以下方法建立的:裸鼠腋窩皮下或肝臟原位接種IX IO6標記了 Iuciferase的肝癌細胞，以分別建立肝癌異位荷瘤模型和肝癌原位荷瘤模型。每周通過測量腫瘤體積或小動物活體成像技術實時檢測Iuciferase的生物發光信號，連續5-6周，確認肝癌荷瘤裸鼠模型的建立。
[0039]所述的AMSC-miR-122由DPBS稀釋，針對肝癌異位荷瘤模型，AMSC-miR-122采用瘤內注射和尾靜脈輸注兩種方式；針對肝癌原位荷瘤模型，AMSC-miR-122于采用尾靜脈輸注方式。
[0040]所述的AMSC-miR-122 瘤內注射方式為，AMSC-miR-122 由 DPBS 稀釋為 I X 108/mL的濃度，瘤內注射有效劑量為I-2X IO6/次，輸注時間為肝癌細胞接種后I周，3周。
[0041]所述的AMSC-miR-122尾靜脈輸注方式為，AMSC-miR-122由DPBS稀釋為IX IO7/HiL的濃度，尾靜脈輸注的有效劑量為2X IO6/只，輸注時間為肝癌細胞腋下接種后I周、3周或肝臟原位接種后3天、17天。
[0042]所述的化療藥物為肝癌常規化療藥物，如Sorafenib、5_FU、Doxorubicin,Sorafenib的給藥劑量為30mg/kg,5_FU的給藥劑量為30mg/kg, Doxorubicin的給藥劑量為2mg/kg，均采用腹腔注射。
[0043]所述的腫瘤體積計算公式為，V (mm3) =aX (b2/2) ;a=腫瘤長徑，b=腫瘤短徑。
[0044]所述的小動物活體成像檢測方法為:裸鼠腹腔注射150mg/kg的D-1uciferin(Iuciferase的底物)，10-15分鐘時采用小動物活體成像儀(LBLS-579)進行Iuciferase生物發光信號的實時檢測。[0045]將本發明所述的AMSC-miR-122用于提高肝癌化療敏感性的效果評價:
[0046]( I)腫瘤體積和重量測量；
[0047](2)肝癌細胞Iuciferase的生物發光信號檢測；
[0048](3 )血清中AFP水平檢測；
[0049](4)肝癌組織HE病理及TUNEL分析；
[0050](5 )裸鼠體重及狀態監測。
[0051]由于肝癌化療敏感性差，因此探索可提高其化療敏感性的增敏手段對于其治療具有積極意義。最近，miRNA與肝癌的關系日益受到關注。已有多項研究發現，在腫瘤組織中存在多種miRNAs的表達失調，這些miRNA通過對細胞惡性表型相關基因的表達調控而參與腫瘤的發生發展。miR-122作為正常肝臟中表達豐度最高的miRNA，其在肝炎-肝硬化-肝癌進展中呈進行性表達下調，在肝癌組織中，miR-122表達最低。近年來，miR-122與肝癌化療敏感性的關系備受關注。體外細胞學水平的研究顯示，在肝癌細胞中導入miR-122可顯著提高其對化療藥物的敏感性。miR-122/Cyclin Gl通過對p53基因(p53是目前已知的與化療敏感性關聯最高 的基因之一)的調控而增強肝癌細胞對化療藥物的敏感性。
[0052]但如何選擇合適的載體輸送miR-122至肝臟腫瘤部位仍是影響其功效的關鍵環節。間充質干細胞(MSCs)作為一類新型的基因治療運載系統具有高效、安全、腫瘤靶向性等諸多優點。成體脂肪組織來源的MSC(AMSC)作為一類可重復獲取、供者不適度低的干細胞在臨床上具有更高的應用價值。
[0053]利用本發明所述的攜帶miR-122的AMSC制備化療增敏劑，并與臨床常規化療藥物聯合應用于肝癌荷瘤小鼠模型的化療，可顯著提高異位或原位腫瘤組織對化療藥物的敏感性，而增強化療效果，阻滯肝癌進展。并可降低化療藥物的使用劑量，減輕化療副反應。本發明為制備新型的肝癌化療靶向增敏劑提供了技術支持，并為肝癌的系統化療提供了新方法。
[0054]本發明所用方法如無特別說明，均為常規方法。以下實施例中所需要的材料或試劑，如無特殊說明均為市場購得。實施例中描述到的各種生物材料的取得途徑僅是一種實驗獲取的途徑以達到具體公開的目的，不應成為對本發明生物材料來源的限制。所述百分比濃度若無特別說明均為質量/體積(w/ν)百分比濃度或體積/體積(V/V)百分比濃度。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0055]圖1 為 AMSC-miR-122 中的 miR-122 表達 PCR 分析圖。
[0056]圖2為AMSC-miR-122在體外增強!fepG2細胞對Sorafenib敏感性的Annexin V/PI凋亡分析結果圖。
[0057]圖3為肝癌異位荷瘤模型的腫瘤體積檢測圖，其中橫坐標O代表給藥起始時間。
[0058]圖4為肝癌異位荷瘤模型實驗終點的小動物活體成像檢測圖；其中組I的Iuciferase生物發光信號最強，其次為組2和組5，組3和組4的生物發光信號最弱。
[0059]圖5為肝癌異位荷瘤模型的裸鼠體重變化圖，其中橫坐標O代表給藥起始時間。
[0060]圖6為肝癌原位荷瘤模型的小動物活體成像數據圖，其中橫坐標O代表給藥起始時間。
[0061]圖7為肝癌原位荷瘤模型的裸鼠體重變化圖，其中橫坐標O代表給藥起始時間。【具體實施方式】
[0062]下面結合具體實施例進一步闡述本發明，應理解，以下實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的保護范圍。
[0063]下列實施例中所用方法如無特別說明，均為常規方法。以下實施例中所需要的材料或試劑，如無特殊說明均為市場購得。實施例中描述到的各種生物材料的取得途徑僅是一種實驗獲取的途徑以達到具體公開的目的，不應成為對本發明生物材料來源的限制。
[0064]所述百分比濃度若無特別說明均為質量/體積(W/V)百分比濃度或體積/體積(V/V)百分比濃度。
[0065]實施例一:攜帶miR-122的脂肪來源的間充質干細胞(AMSC-miR-122)在肝癌異位荷瘤模型化療增敏中的應用。
[0066]1、脂肪間充質干細胞(AMSC)的制備:
[0067]吸脂手術采集的成人脂肪組織經DPBS清洗后，用0.075%的I型膠原酶(Sigma)37°C消化I小時，然后室溫離心后棄去上層油脂和液體，細胞沉淀以DPBS重懸洗滌2遍后離心收集細胞，接種在含5%胎牛血清(MSC適宜胎牛血清)的低糖DMEM培養基(Gibco)的塑料培養瓶內，24小時后全量換液，除去血細胞,貼壁細胞視生長情況2-3天半量換液，增殖接近80%融合時，進行消化、傳代，依此法傳代數次，達到純化和擴增AMSC的目的，收集細胞凍存、復蘇備用。
[0068]2、AMSC-miR-122 的構建:
[0069]hsa-miR-122 表達質粒(pGCMV/EGFP/hsa_miR-l22/Blasticidine)(上海吉瑪生物)通過Lipofectamine?2000介導轉染AMSC，以60_mm小培養皿為例:AMSC接種至60_mm小培養皿，采用無青鏈霉素的A`MSC培養液培養過夜，待細胞密度至80%左右，換為5ml的Opt1-MEM ;同時用0.5ml的Opt1-MEM稀釋8 μ g的hsa-miR-122表達質粒；并在另0.5ml的Opt1-MEM中加入20 μ I Lipofectamine?2000 ;室溫靜置5分鐘后，把稀釋后的質粒和Lipofectamine?2000進行混合，再室溫靜置20分鐘后加入細胞培養皿中；培養4_6小時后換為無青鏈霉素的AMSC完全培養液(L-DMEM+5%FBS)。
[0070]根據hsa-miR-122表達質粒所帶的EGFP基因指示轉染效率，熒光顯微鏡下觀察，轉染效率可達70%左右。以轉染無關miRNA的表達質粒作為對照，以表達質粒所帶的Blasticidine抗性基因進行篩選培養，篩選4_6周后可獲得穩定表達miR-122的AMSC-miR-122 細胞。
[0071]采用熒光定量PCR法鑒定AMSC中miR-122的表達:
[0072]消化收集細胞后，采用Life technology公司的AM1561試劑盒抽提miRNA,并采用廣州銳博生物的miRQ0000421-l-2試劑盒進行逆轉錄，及熒光定量PCR的分析。
[0073]PCR 體系為:SYBR-10ul ;miR_122 上游引物 _2 μ I ；miR-122 下游引物 _2 μ I ;R0X2-0.4 μ I ;水-1.6 μ I ;模板-4 μ I。PCR 條件為:95 V 預變性 30s，然后 95 °C 5s，60°C 30s, 40 個循環。
[0074]PCR結果分析:轉染miR-122的AMSC，其miR-122的表達水平明顯高于對照組(圖O
[0075]采用流式細胞術鑒定AMSC-miR-122的間充質干細胞特性，其細胞表型為⑶29 (+)，CD31 (-)，CD44 (+)，CD45 (-)，CD73 (+)，CD90 (+)，CD105 (+)，HLA-DR (-);細胞周期以G0/G1期為主(> 95%)，符合AMSC的干細胞特性標志，與未轉染miR-122的普通AMSC和AMSC-miR-NC (轉染無關miRNA的AMSC)的細胞表型和周期均類似。
[0076]采用體外誘導分化鑒定AMSC-miR-122的多系分化潛能:分別采用成脂、成骨、成軟骨誘導培養基進行誘導培養，每3天半量更換誘導培養基，誘導培養3周后，分別進行油紅O (成脂)，茜素紅(成骨)，阿辛藍(成軟骨)的染色，證實攜帶miR-122的AMSC仍具有多系分化潛能。
[0077]3、肝癌異位荷瘤模型的建立:
[0078]HepG2肝癌細胞通過轉染帶Iuciferase基因的慢病毒質粒(和元生物技術有限公司)，并經抗性篩選，而得到穩定表達Iuciferase的HepG2肝癌細胞(HepG2_luci )。5周齡裸鼠腋窩皮下接種IXlO6的!fepG2-luci肝癌細胞，每周通過測量腫瘤體積及小動物活體成像技術實時檢測Iuciferase的生物發光信號，連續6周，確認肝癌荷瘤裸鼠模型的建立。
[0079]4、AMSC-miR-122輸注:AMSC_miR-122由DPBS稀釋，采用瘤內注射和尾靜脈輸注兩種方式；
[0080]所述的AMSC-miR-122 瘤內注射方式為，AMSC-miR-122 由 DPBS 稀釋為 I X 108/mL的濃度，瘤內注射有效劑量為I~2X IO6/次，輸注時間為肝癌細胞接種后I周，3周。
[0081]所述的AMSC-miR-122尾靜脈輸注方式為，AMSC-miR-122由DPBS稀釋為IXlOVmL的濃度，尾靜脈輸注的有效劑量為2X106/只，輸注時間為肝癌細胞腋下接種后I周，3周。
[0082]5、肝癌異位荷瘤模型的化療:
[0083]所述的化療藥物為肝癌常規化療藥物Sorafenib (LC Laboratories)；
[0084]Sorafenib 的配制為，米用 1:1 體積的純乙醇與 cremophor EL (Sigma-Aldrich)助溶后，再用DPBS稀釋到5mg/ml ;其給藥劑量為30mg/kg或90mg/kg ;于肝癌細胞腋下接種后2周開始給藥，給藥周期為，用藥5天，停藥2天，持續4周；給藥方式采用腹腔注射。
[0085]6、肝癌異位荷瘤模型的治療分組:
[0086]組1:模型對照組(輸注同等體積的Sorafenib溶劑)；
[0087]組2:Sorafenib 低劑量治療組(30mg/kg/ 天)；
[0088]組3:Sorafenib 高劑量治療組(90mg/kg/ 天)；
[0089]組4:低劑量 Sorafenib+AMSC-miR-122 瘤內注射組；
[0090]組5:低劑量 Sorafenib+AMSC-miR-122 尾靜脈輸注組。
[0091]7、效果評價:
[0092](I)腫瘤體積和重量測量:每周2次，用游標卡尺測量腫瘤長徑(a)和短徑(b)，并按公式計算腫瘤體積:V(mm3)=aX (b2/2);如圖3所示，組4的腫瘤增殖明顯低于組I和組2，與組3的腫瘤進展情況類似；組5的腫瘤增殖也要低于組I和組2，但比組3和組4要高。化療終點，吸入性麻醉法處死裸鼠后，剝離其腫瘤組織稱重，并計數其腫瘤抑制率(表I)。顯示AMSC-miR-122輸注可顯著提高肝癌組織對Sorafenib的敏感性,使得低劑量的Sorafenib也可達到高劑量Sorafenib的肝癌抑制效果。
[0093]
【權利要求】
1.攜帶miR-122的脂肪來源的間充質干細胞的構建方法，其特征在于:包括如下步驟: 1)脂肪來源的間充質干細胞的制備:脂肪組織經DPBS清洗后，用I型膠原酶37°C消化I小時，然后室溫離心后棄去上層油脂和液體，細胞沉淀以DPBS重懸洗滌2遍后離心收集細胞，接種在含5%胎牛血清的低糖DMEM培養基的培養瓶內，細胞貼壁增殖接近80%融合時，進行消化、傳代，依此法傳代2-4次，達到純化和擴增間充質干細胞的目的，收集細胞凍存、復辦備用； 2)攜帶miR-122的脂肪來源的間充質干細胞的制備:miR_122表達質粒通過電轉法導入AMSC，以EGFP指示轉染效率，以轉染無關miRNA的表達質粒作為對照，以表達質粒所帶的Blasticidine抗性基因進行篩選，篩選4_6周后可獲得穩定表達miR-122的攜帶miR-122的脂肪來源的間充質干細胞。
2.根據權利要求1所述方法，其特征在于:所述脂肪組織為成人脂肪組織，所述miR-122 為 has-miR-122。
3.根據權利要求1或2所述方法得到的攜帶miR-122的脂肪來源的間充質干細胞，其特征在于:具有間充質干細胞的基本特性。
4.根據權利要求1或2所述方法得到的攜帶miR-122的脂肪來源的間充質干細胞，其特征在于:可提高肝癌細胞對化療藥物的敏感性。
5.根據權利要求4所述的攜帶miR-122的脂肪來源的間充質干細胞，其特征在于:所述肝癌細胞為H印G2細胞。
6.攜帶miR-122的脂肪來源的間充質干細胞在制備肝癌化療增敏制劑的應用。
7.根據權利要求6所述的 應用，其特征在于:所述肝癌化療增敏制劑可提高異位肝癌和原位肝癌對肝癌化療藥物的敏感性。
8.權利要求7所述的應用，其特征在于:所述肝癌化療藥物為Sorafenib、5-FU或Doxorubicin。
9.根據權利要求6或7所述的應用，其特征在于:所屬制劑的劑型為注射劑。
【文檔編號】C12N5/0775GK103451152SQ201310390755
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年8月30日 優先權日:2013年8月30日
【發明者】劉艷寧, 樓國華, 陳智 申請人:浙江大學