一種靶向人CD47-SIRPα信號通路的雙特異性抗體及其制備方法和用途
【專利摘要】本發明提供一種抗人CD47和抗人SIRPα的雙特異性抗體，包含特異性結合CD47的第一抗原結合域和特異性結合SIRPα的第二抗原結合域，第一和第二抗原結合域都由一對抗體重鏈可變結構域(VH)和抗體輕鏈可變結構域(VL)組成；第一抗原結合域為可與CD47特異性結合的抗體可變區結構域；第二抗原結合域為可與SIRPα特異性結合的抗體可變區結構域。制備方法主要包括：合成編碼所述抗體的cDNA序列；將cDNA序列插入工具載體，構建表達載體；將表達載體在宿主細胞中表達和分離純化表達的雙特異性抗體。本發明用于制備治療人類癌癥的藥品。
【專利說明】—種靶向人CD47-S IRP α信號通路的雙特異性抗體及其制備方法和用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物制藥【技術領域】，具體涉及一種抗人類整合素相關蛋白(CD47或IAP)和人信號調節蛋白a (SIRPa)的雙特異性抗體及其制備方法和用途。
【背景技術】
[0002]⑶47,又稱整合素相關蛋白(Integrin-associated protein, IAP),最初從人胎盤與整合素aVi3 3共純化及從血小板與β 3整合素共免疫沉淀而為人們所認識，其功能與整合素相關(Johansen and Brown.J Biol Chem.2007)。它是一種廣泛表達于細胞表面的糖基化跨膜蛋白，屬于免疫球蛋白超家族。結構上包括一個氨基端細胞外可變區域，一個有3-5個高度疏水的跨膜片段構成的跨膜區域和一個親水的羧基端胞質尾區。CD47是細胞表面至關重要的標記物，分子量在47-55kD之間，與GPA (血型糖蛋白A，Glycophorin A)、GPB (血型糖蛋白 B, Glycophorin B)、帶 3 蛋白(Band3protein)、RhD (Rh antigen D)等相關蛋白緊密相關(Barclay and Brown.Nat Rev Tmmunol.2006)。
[0003]SIRPa,信號調節蛋白 a (Signal regulatory proteina)也是一種跨膜蛋白，主要表達于巨噬細胞、樹突狀細胞和神經細胞表面。其胞外區含有3個免疫球蛋白超家族樣區域，其中N末端的區域介導與CD47的結合，而其細胞內結構域具有典型的免疫受體酪氨酸抑制性序列(Immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif, ITIM);與0047結合后，SIRPa的Ι--Μ被磷酸化，產生級聯反應，抑制巨噬細胞的吞噬作用(Matozaki etal.Trends Cell Biol.2009)。
[0004]在人體的固有免疫系統(Innate immune system)中，巨卩遼細胞(Macrophage)扮演著“清道夫”的角色，它通過吞噬作用清除病原物、受損細胞和衰老細胞維持機體健康；同時，巨噬細胞又能識別正常健康細胞，使其免于被自我攻擊。這種識別的機制正是在于正常健康細胞如紅細胞(Oldenborg et al.Science.2000)或血小板(Olsson etal.Blood.2005)表面的⑶47分子與巨噬細胞上的受體SIRP α相互作用產生抑制性信號，抑制其吞噬活性。所以⑶47在紅細胞和血小板上是一種“自身細胞的標記物”(Marker ofself)。
[0005]⑶47和SIRPa形成的信號復合體，還可參與神經系統發育、中性粒細胞趨化激活和基質細胞支持的造血細胞生成等多種生理活動，共同調節效應細胞的功能和其所分泌的細胞因子，同時在誘導T細胞免疫耐受、活化、凋亡等方面也發揮著多種調節作用(Johansen and Brown.J Biol Chem.2007)。
[0006]近年來，⑶47和⑶47-SIRP α信號系統受到廣泛關注。其中，最令人矚目的是其作為腫瘤治療的潛在藥靶。已有研究證實，CD47在許多惡性腫瘤中，如急性髓細胞性白血病(AML)、B細胞和T細胞急性白血病、非霍奇金淋巴瘤等，均呈過表達狀態，且⑶47高表達與臨床預后 差有關(Willingham et al.Proc Natl Acad Sci U S A.2012 ；Majeti etal.Cell.2009)。⑶47作為卵巢腫瘤細胞標記物第一個被克隆，這表明它可能在阻止其他腫瘤組織的吞噬作用中同樣發揮作用(Majeti et al.Cell.2009)。腫瘤細胞表面高表達的⑶47被巨噬細胞表面的SIRPa識別，向巨噬細胞傳遞“別吃我”(“Don’ t eat me”)的信號，借以逃避免疫監視。
[0007]斯坦福大學的Weissman教授團隊系統地研究了多種實體瘤中⑶47的表達水平，結果表明，所有人類實體瘤細胞中的CD47都呈高表達，其平均表達水平是對應正常細胞的3.3倍左右。而且，他們發現實體瘤病人⑶47mRNA的水平與預后指數(Prognosticfactor)呈負相關。進一步針對原位免疫缺陷性小鼠異種移植動物模型(Orthotopicimmunodeficient mouse xenotransplantation models)的實驗發現，抗 CD47 單克隆抗體的施用能夠抑制大型腫瘤的生長和轉移，而對于小型腫瘤則可以治愈。抗CD47單克隆抗體的有效性和安全性還在原位小鼠乳腺癌模型(Orthotopic mouse breast cancer model)實驗中得到證實(Willingham et al.Proc Natl Acad Sci U S A.2012)。為此 Weissman等在美國發表了專利(Jaiswal et al.US12/321，215)。該項研究不僅證實了高表達CD47是腫瘤細胞逃避免疫監視的普遍機制，也為通過阻斷CD47-SIRP α信號通路來治療腫瘤提供了有重要價值的借鑒。
[0008]通過抗CD47單克隆抗體進行腫瘤治療的有效性和安全性在其它案例中也得到證實。根據Majeti等(Majeti et al.Cell.2009)的研究結果,抗⑶47抗體能夠清除小鼠異種移植模型中的急性髓細胞性白血病癌癥干細胞。而且他們觀察到抗CD47抗體對小鼠沒有明顯毒性，除了僅有的嗜中性粒細胞減少癥。Chao等(Chao et al.Cell.2010)的研究也表明，人非霍奇金淋巴瘤(NHL)細胞上⑶47表達增加，抗⑶47抗體使NHL細胞優先被吞噬，其作用與抗CD20抗體利妥昔單抗(Rituximab)有協同作用；移植人NHL腫瘤細胞的小鼠經抗CD47抗體治療后腫瘤減少、成活率增加，與利妥昔單抗合用能消除腫瘤，達到治愈。
[0009]專利W02005044857報道了一種人源化抗人⑶47單克隆抗體用于血液性腫瘤，尤其是白血病治療。
[0010]中國專利(201010557999.1) “一種白血病干細胞靶向可溶性蛋白TrxHis_hCD47”報道了一種靶向白血病干細胞的可溶性蛋白hCD47，這種蛋白應用于體內后可與巨噬細胞上的SIRPa結合，阻止白血病干細胞上內源性的⑶47與SIRP α結合，從而促進巨噬細胞對白血病細胞和白血病干細胞的吞噬作用，起到治療白血病的作用。
[0011]諾華公司于2010年12月在中國申請了一個“四價CD47-抗體恒定區融合蛋白用于治療”的專利(CN201080064426.3)，描述了一種可溶性蛋白能選擇性地結合SIRP a，其中一種是與抗體恒定區的CD47融合蛋白，能同時結合4個SIRP α分子，可用于預防或治療自身免疫性疾病和炎癥性疾病。
[0012]針對⑶47-SIRPa信號通路，除了采用抗⑶47單克隆抗體和可融性⑶47蛋白的腫瘤治療策略，還可以開發抗SIRP α單克隆抗體(Ho et al.0ncoImmun0.2013 ；Zhao etal.Proc.Natl Acad Sci USA2011)。專利 W02013056352 描述了人源化的抗人 SIRP α 的全長單克隆抗體及其衍生的抗體片段用于血液性腫瘤，尤其是白血病的治療。
[0013]除抗體以外，有人報道了一種通過人工改造的可溶性SIRP α變體來拮抗⑶47進而阻斷 CD47_SIRPa 信號通路的方法(Weiskopf et al.Science.2012)。Weiskopf 等通過蛋白質工程獲得的這種SIRPa變體，相較于天然的SIRPa分子，與⑶47的親合力提高了約50，000倍。這種SIRP α變體單體能有效拮抗腫瘤細胞上的⑶47，但并不能引起巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬；但這種SIRPa變體單體與其它針對腫瘤的特異性單克隆抗體(如革巴向HER2/neu的Trastuzumab，或革巴向EGFR的Cetuximab)合并施用，能產生顯著的協同作用，增加巨噬細胞對腫瘤的吞噬活性和增加抗腫瘤的效應。所以，這種可溶性SIRPa變體可以作為腫瘤特異性抗體的普適性佐劑(Adjuvant)。或者，這種SIRPa變體與人類IgG4的Fe融合制成二聚體后施用，也能增加巨噬細胞對腫瘤的吞噬活性。Theocharides等(Theocharides et al.J Exp Med.2012)也在急性髓細胞性白血病(AML)模型上發現SIRP α -Fe融合蛋白通過阻斷⑶47-SIRP α信號通路，能顯著增加小鼠和人巨噬細胞對AML癌細胞的吞噬作用，并抑制腫瘤細胞在小鼠的移植和生長，而不增加巨噬細胞對正常造血細胞的吞噬。[0014]本發明釆用一種全新的策略，即通過抗人⑶47和人SIRP α的雙特異性抗體，一方面通過與⑶47和SIRPa的結合阻斷⑶47-SIRP α信號通路，使得腫瘤細胞“別吃我”信號被封閉，巨噬細胞得以將其吞噬殺滅；另一方面，這種雙特異性抗體因能同時結合CD47和SIRPa，可以將高表達CD47的腫瘤細胞和巨噬細胞拉近，促進后者對腫瘤細胞的吞噬作用。
[0015]參考文獻
[0016]Barclay AN and Brown ΜΗ.(2006)The SIRP family of receptors and immuneregulation.Nat Rev Immunol.6(6):457-64.[0017]Chao MP, Alizadeh AA, Tang C，et al.(2010)Anti_CD47antibody synergizeswith rituximab to promote phagocytosis and eradicate non-Hodgkin lymphoma.Cell.142(5):699-713.[0018]CN201010557999.1.韓驊，梁英民，嚴學倩.一種白血病干細胞靶向可溶性蛋白TrxHis-hCD47.[0019]CN201080064426.3.胡貝爾等.四價CD47-抗體恒定區融合蛋白用于治療.[0020]Ho JMiDanska JSiWang JCY.(2013)Targeting SIRP a in cancer.0ncolmmun0.2:e23081.[0021]Johansen ML and Brown EJ.(2007) Dual regulation of SIRP alphaphosphorylation by integrins and CD47.J Biol Chem.282(33):24219-30.[0022]Majeti R，Chao MP，Alizadeh AA,et al.(2009)CD47is an adverse prognosticfactor and therapeutic antibody target on human acute myeloid leukemia stemcells.Cell.138(2):286-99.[0023]Matozaki T, Murata Y,Okazawa H，Ohnishi H.(2009)Functions and molecularmechanisms of the CD47_SIRPalpha signalling pathway.Trends Cell Biol.19 (2):72-80.[0024]Oldenborg PA,Zheleznyak A，Fang YF,et al.(2000)Role of CD47as a markerof self on red blood cells.Science.288(5473):2051-4.[0025]Olsson M， Bruhns P， Frazier WA, et al.(2005)Platelet homeostasis isregulated by platelet expression of CD47under normal conditions and in passiveimmune thrombocytopenia.Blood.105(9):3577-82.[0026]Theocharides AP, Jin L, Cheng PY, et al.(2012) Disruption of SIRP asignaling in macrophages eliminates human acute myeloid leukemia stem cells inxenografts.J Exp Med.209 (10):1883-99.[0027]US12/321, 215.Jaiswal S，Chao MP，Majeti R and Weissman IL.Methods formanipulating phagocytosis mediated by CD47.[0028]Weiskopf K，Ring AM，Ho CCM, et al.(2013) Engineered SIRP a Variants asImmunotherapeutic Adjuvants to Anticancer Antibodies.Science.341(6141):88-91.[0029]Willingham SB， Volkmer JP, Gentles AJ, et al.(2012)The CD47_signalregulatory protein alpha (SIRP a ) interaction is a therapeutic target for humansolid tumors.Proc Natl Acad Sci USA.109(17):6662-7.[0030]W02005044857.Yasufumi，et al.Humanized ant1-CD47antibody.[0031]W02013056352.Wang JCY, et al.Antibody and antibody fragments targetingSIRP—alpha and their use in treating hematologic cancers.
【發明內容】
[0032]本發明的目的是:提供一種抗人CD47和人SIRPa的雙特異性抗體，并提供其制備方法，以用于制備治療人類癌癥的藥品。抗人CD47和人SIRPa的雙特異性抗體國內外未見報道。
[0033]本發明的技術方案是:本發明的抗人⑶47和人SIRPa的雙特異性抗體，包含特異性結合CD47的第一抗原結合域和特異性結合SIRP a的第二抗原結合域，其結構特點是:
[0034]上述第一抗原結合域和第二抗原結合域都由一對抗體重鏈可變結構域VH和抗體輕鏈可變結構域VL組成；
[0035]上述的第一抗原結合域為可與CD47特異性結合的抗體可變區結構域；第二抗原結合域為可與SIRPa特異性結合的抗體可變區結構域。
[0036]進一步的方案是:上述的第一抗原結合域為以下四對序列組合，即SEQ ID NO:1和 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和 SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和 SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8 中的任意一對序列組合。其中，SEQ ID NO:USEQ ID N0:3、SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 為重鏈可變結合域；SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8為輕鏈可變結合域。
[0037]進一步的方案是:上述的第二抗原結合域為以下兩對序列組合，即SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO:10中的任意一對序列組合。其中，SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:11為重鏈可變結合域；SEQ ID NO:10為輕鏈可變結合域。
[0038]進一步的方案是:上述的第一抗原結合域的序列為已經公開的其它任何可與人CD47特異性結合的抗體的可變區結構域的序列；上述的第二抗原結合域的序列為已經公開的其它任何可與人SIRP a特異性結合的抗體的可變區結構域的序列。
[0039]進一步的方案是:上述的第一抗原結合域和第二抗原結合域為通過將鼠來源的抗體人源化獲得或完全人源獲得。
[0040]進一步的方案還有:上述的抗體是二價的或多價的。
[0041]一種上述的抗人⑶47和人SIRP a的雙特異性抗體的制備方法，包括以下步驟:
[0042]①合成編碼上述抗體的cDNA序列；[0043]②將cDNA序列插入工具載體，構建可在宿主細胞中表達的表達載體；
[0044]③將上述的表達載體在宿主細胞中表達；
[0045]④分離純化表達的雙特異性抗體。
[0046]進一步的方案是:上述的步驟②中的工具載體為市售商業化載體或自行構建的可供表達的載體。
[0047]進一步的方案是:上述的步驟②和步驟③中的宿主細胞為如大腸桿菌、酵母、哺乳動物細胞、植物 細胞、昆蟲細胞等常見表達宿主。
[0048]一種上述的抗人⑶47和人SIRP α的雙特異性抗體，用于制備治療人類癌癥的藥品，尤其是人非霍奇金淋巴瘤(NHL)、人急性髓性白血病(AML)及各種實體瘤的藥品。
[0049]本發明有以下優點:本發明中描述的抗人⑶47和人SIRPa的雙特異性抗體，一方面通過與⑶47和SIRP a的結合阻斷信號⑶47-SIRP a通路，使得腫瘤細胞“別吃我”信號被封閉，巨噬細胞得以將其吞噬殺滅；另一方面，這種雙特異性抗體因能同時結合⑶47和SIRPa，可以將高表達CD47的腫瘤細胞和巨噬細胞拉近，促進后者對腫瘤細胞的吞噬作用。本發明的抗0047和311?^的雙特異性抗體，可用于制備治療癌癥的藥品，尤其是人非霍奇金淋巴瘤(NHL)、人急性髓性白血病(AML)及各種實體瘤的藥品。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0050]圖1為本發明的抗人CD47和人SIRPa的雙特異性抗體的scFv (Single-chainvariable fragment)結構類型示意圖，圖中抗原I為⑶47,相應地抗原2則為SIRPa，其中:
[0051]圖1-1:連接方式:VL1-接頭-VHl-接頭-VL2-接頭-VH2 ；
[0052]圖1-2:連接方式:VH1-接頭-VLl-接頭-VH2-接頭-VL2 ；
[0053]圖1-3:連接方式:VL2_接頭-VH2-接頭-VL1-接頭-VHl ；
[0054]圖1-4:連接方式:VH2_接頭-VL2-接頭-VHl-接頭-VLl ；
[0055]圖1-5:連接方式:VL1-接頭-VH2-接頭-VL2-接頭-VHl ；
[0056]圖1-6:連接方式:VH1-接頭-VL2-接頭-VH2-接頭-VLl ；
[0057]圖1-7:連接方式:VL2_接頭-VHl-接頭-VL1-接頭-VH2 ；
[0058]圖1-8:連接方式:VH2_接頭-VL1-接頭-VHl-接頭-VL2 ；
[0059]圖2為本發明的抗人CD47和人SIRPa的雙特異性抗體的scFab (Single-chainantigen-binding fragment)結構類型示意圖，圖中抗原I為⑶47,相應地抗原2則為SIRPa，其中:
[0060]圖2-1: [VL-CL-接頭-VH-CH1]抗原 1-接頭-[VL-CL-接頭-VH-CH1]抗原 2 ；[0061 ]圖 2-2: [VH-CHl-接頭-VL-CL]抗原 1-接頭-[VH-CH1-接頭-VL-CL]抗原 2 ；
[0062]圖2-3: [VL-CL-接頭-VH-CH1]抗原 2_ 接頭-[VL-CL-接頭-VH-CH1]抗原 I ;
[0063]圖2-4: [VH-CHl-接頭-VL-CL]抗原 2_ 接頭-[VH-CH1-接頭-VL-CL]抗原 I。
[0064]圖3為本發明的抗一種抗原的全長抗體并含有抗另一種抗原的scFv的四價雙特異性識別人⑶47和人SIRPa抗體的結構示意圖，圖中抗原I為⑶47，相應地抗原2則為SIRPa，其中:
[0065]圖3-1:結合SIRP a的scFv連接到全長⑶47抗體的輕鏈C端；[0066]圖3-2:結合SIRP α的scFv連接到全長CD47抗體的Fe的C端；
[0067]圖3-3:結合CD47的scFv連接到全長SIRP α抗體的輕鏈的C端；
[0068]圖3-4:結合CD47的scFv連接到全長SIRP α抗體的Fe的C端。
[0069]圖4為本發明的抗一種抗原的全長抗體并含有抗另一種抗原的scFab的四價雙特異性識別人⑶47和人SIRPa抗體的結構示意圖，圖中抗原I為⑶47，相應地抗原2則為SIRPa，其中:
[0070]圖4-1:結合SIRP a的scFab連接到全長⑶47抗體的輕鏈的C端；
[0071]圖4-2:結合SIRP α的scFab連接到全長CD47抗體的Fe的C端；
[0072]圖4-3:結合CD47的scFab連接到全長SIRP α抗體的輕鏈的C端；
[0073]圖4-4:結合CD47的scFab連接到全長SIRP α抗體的Fe的C端。
[0074]氨基酸序列描述
[0075]SEQ ID NO:1針對CD47的抗體重鏈結合可變區域I ;
[0076]SEQ ID NO:2針對CD47的抗體輕鏈結合可變區域I ;
[0077]SEQ ID NO:3針對CD47的抗體重鏈結合可變區域2 ；
[0078]SEQ ID NO:4針對CD47的抗體輕鏈結合可變區域2 ；
[0079]SEQ ID NO:5針對CD47的抗體重鏈結合可變區域3 ；
`[0080]SEQ ID NO:6針對CD47的抗體輕鏈結合可變區域3 ；
[0081]SEQ ID NO:7針對⑶47的抗體重鏈結合可變區域4 ；
[0082]SEQ ID NO:8針對CD47的抗體輕鏈結合可變區域4 ；
[0083]SEQ ID NO:9針對SIRP α的抗體重鏈結合可變區域I ;
[0084]SEQ ID NO:10針對SIRP α的抗體輕鏈結合可變區域I ;
[0085]SEQ ID NO:11針對SIRP α的抗體重鏈結合可變區域2。
【具體實施方式】
[0086]下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明作進一步詳細的描述。
[0087](實施例1)
[0088]見圖1至圖4，本實施例的抗人⑶47和人SIRPa的雙特異性抗體，至少包含結合人CD47的第一抗原結合域和結合人SIRP α的第二抗原結合域，前述每個抗原結合域又包含一對功能性的抗體重鏈可變結構域和抗體輕鏈可變結構域。
[0089]前述針對人⑶47和人SIRP a的雙特異性抗體分子組成包含但不限于結合⑶47的第一抗原結合域和結合SIRPa的第二抗原結合域，還包括有助于前述雙特異性抗體維持空間結構以實現正常功能或增強抗體功能的其它肽段或分子。
[0090]術語“價”指結合位點在抗體分子上存在的具體數量。比如:術語“二價”，“四價”，和“六價”指在抗體分子上分別存在兩個結合位點，四個結合位點，六個結合位點。根據本實施例的雙特異性抗體至少是“二價”的，并且可以是“多價”的(例如“三價”，“四價”等)。優選地，本實施例的雙特異性抗體是二價的，四價的。對于具有超過兩個抗原結合域的抗體，有些結合域可以是相同的，只要前述抗體至少具有對于兩種抗原CD47和SIRPa的兩個特異性結合域。
[0091]優選地,本實施例的雙價的雙特異性抗體結構類型包括scFv型和scFab型。scFv是由抗體重鏈可變結構域(VH)和抗體輕鏈可變結構域(VL)和肽段接頭組成的多肽。具體的，前述scFv型雙特異性抗體(如附圖1所示)具有從N端到C端方向的下列順序之一:
【權利要求】
1.一種抗人⑶47和抗人SIRPa的雙特異性抗體，包含特異性結合⑶47的第一抗原結合域和特異性結合SIRP a的第二抗原結合域，其特征在于: 所述第一抗原結合域和第二抗原結合域都由一對抗體重鏈可變結構域(VH)和抗體輕鏈可變結構域(VL)組成； 所述的第一抗原結合域為可與CD47特異性結合的抗體可變區結構域；第二抗原結合域為可與SIRPa特異性結合的抗體可變區結構域。
2.根據權利要求1所述的抗人CD47和人SIRPa的雙特異性抗體，其特征在于:所述的第一抗原結合域為以下四對序列組合SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQID NO:4、SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8 中的任意一對序列組合。
3.根據權利要求1所述的抗人CD47和人SIRPa的雙特異性抗體，其特征在于:所述的第二抗原結合域為以下兩對序列組合SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 10中的任意一對序列組合。
4.根據權利要求1所述的抗人CD47和人SIRPa的雙特異性抗體，其特征在于:所述的第一抗原結合域的序列為已經公開的其它任何可與人CD47特異性結合的抗體的可變區結構域的序列；所述的第二抗原結合域的序列為已經公開的其它任何可與人SIRP a特異性結合的抗體的可變區結構域的序列。
5.權利要求1所述的抗人CD47和人SIRPa的雙特異性抗體，其特征在于:所述的第一抗原結合域和第二抗原結合域為通過將鼠來源的抗體人源化獲得或完全人源獲得。
6.根據權利要求1~5任一項所述的抗人CD47和人SIRPa的雙特異性抗體，其特征在于:所述的抗體是二價的或多價的。
7.一種權利要求1~5任一項所述的抗人⑶47和人SIRP a的雙特異性抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: ①合成編碼所述抗體的cDNA序列； ②將cDNA序列插入工具載體，構建可在宿主細胞中表達的表達載體； ③將所述的表達載體在宿主細胞中表達； ④分離純化表達的雙特異性抗體。
8.根據權利要求7所述的抗人CD47和人SIRPa的雙特異性抗體的制備方法，其特征在于:所述的步驟②中的工具載體為市售商業化載體或自行構建的可供表達的載體。
9.根據權利要求7所述的抗人CD47和人SIRPa的雙特異性抗體的制備方法，其特征在于:所述的步驟②和步驟③中的宿主細胞為如大腸桿菌、酵母、哺乳動物細胞、植物細胞、昆蟲細胞等常見表達宿主。
10.一種權利要求1~5任一項所述的抗人⑶47和人SIRP a的雙特異性抗體，其特征在于:用于制備治療人類癌癥的藥品。
【文檔編號】C12N15/70GK103665165SQ201310378875
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年8月28日 優先權日:2013年8月28日
【發明者】包建新, 樓亞平, 鄧洪淵 申請人:江蘇匡亞生物醫藥科技有限公司