基于細胞狀態反饋的三維細胞支架打印方法
【專利摘要】本發明公開了一種基于細胞狀態反饋的三維細胞支架打印方法，該方法采用在細胞液培養時加入標記物，從而達到實時跟蹤細胞分布的目的，在支架材料制作的過程中，混合用于檢測成細胞分泌物的試液，達到實時檢測干細胞分化進程的目的。通過細胞追蹤及細胞分化過程的實時檢測，可以對裝載細胞的凝膠沉積進行實時的監控，從而方便研究細胞成活和分化與沉積技術各參數（如沉積速度，壓電脈沖寬度等）直接的關系，大大縮短了研究周期和成本。
【專利說明】基于細胞狀態反饋的三維細胞支架打印方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及細胞打印領域，尤其是涉及一種基于細胞狀態反饋的三維細胞支架打印方法。
【背景技術】
[0002]快速成型(RP)技術是九十年代發展起來的一項先進制造技術，在計算機的控制下，RP系統可以根據零件的形狀，每次制作一個具有一定微小厚度和特定形狀的截面，然后再把它們逐層粘結起來，就得到了所需制造的立體的零件。不同公司制造的RP系統所用的成形材料不同，系統的工作原理也有所不同，但其基本原理都是一樣的，那就是"分層制造、逐層疊加"。利用快速成型(RP)技術，可以在無需準備任何模具、刀具和工裝卡具的情況下，直接接受產品設計(CAD)數據，快速制造出新產品的樣件、模具或模型。
[0003]在生物工程領域，快速成型技術是制造支架(三維細胞支架)的一項很好的技術工具。這些基于模型的技術可以通過在工作臺上進行逐層材料沉積，得到多孔3D支架。在構造支架的過程中，每一層都是沉積成可互相滲透的纖維網絡(材料和空隙)。這樣可以構成一個具有多孔并無相連接的三維支架。一個可控的有空隙支架可以很好的給細胞和組織提供氧氣、養料保證組織培養。支架的內部和外部結構可以由CAD或CAM繪制而成。通過這些方式可以生產可替換正常組織并滿足其機械性能的3D結構。另外，利用電腦層析成像和核磁共振成像可以得到組織構造的支架。這種生產支架的多樣性可以更有利于研究細胞在不同組織支架中的再生情況。近期，利用快速成型制造可以提供細胞生長的三維結構已經可以制造出來了，其目標是可以制造等效活細胞。這項技術，有很多人稱之為組織或細胞打印，也可以被定義成多細胞群沉積技術，有望模仿活細胞進行排布。基本原理是設計一個可以更接近真實細胞、基質和生物分子組織的方法，這種方法可以幫助揭示細胞與細胞，細胞與基質關系，并且也可以為功能移植中的細胞再生提供幫助。
[0004]目前3D沉積技術對單純聚合物支架打印技術已日趨成熟，單純的打印一個符合要求的有機物支架已經不是細胞打印的主要瓶頸。但可以打印出一個可供活細胞生存并正常分化的凝膠支架尚且困難，目前常用的聚合物沉積支架主要缺點有(I)細胞和支架的制作不同步。現代細胞沉積的主要方法是先制作有機聚合物支架，再向支架中注入活細胞，其優點是保證注入活細胞成活率，但缺點是不能控制細胞在支架中的成分和比例，導致支架中細胞的含量由于支架結構的限制而分配不均；(2)細胞成活和分化有失實時性，由于無法在注入過程中實現細胞的實時監測，細胞成活與否只有在細胞完全注入并培育一段時間后，才能檢測細胞是否成活和細胞的分化情況。而當所制作支架不滿足成活條件時，需要重新制作支架并且重復實驗，這就導致真正制作一個符合要求的支架將消耗大量的時間精力。(3)成活率檢測為沉積后檢測，當細胞注入到支架的過程中，細胞可能在注入的過程死亡，這是由于在細胞被注入及到達支架預定位置的時間段內，細胞并不能得到足夠的養分，并且在這段時間里，細胞將受到不同程度的擠壓。在諸多外界因素的影響，很有可能導致細胞提前死亡，這樣的結果并不能證明支架本身的結構式有問題，對實驗結果即會產生偏差。實驗結果產生偏差會進而導致更多無效的重復制作支架過程。
【發明內容】
[0005]本發明提供了一種基于細胞狀態反饋的三維細胞支架打印方法，在制作過程中實時對細胞成活狀態、在支架中的比例以及細胞分化情況進行檢測反饋，根據檢測數據調整三維細胞支架打印參數，進而得到精確的三維細胞支架。
[0006]為解決上述技術問題，本發明提供的技術方案如下:
[0007]一種基于細胞狀態反饋的三維細胞支架打印方法，包括:
[0008](I)將干細胞置于活體染料的培養皿中培養染色，直至干細胞變色后，將有色干細胞和無色干細胞分離，取出有色干細胞；
[0009](2)將染色后的有色干細胞置于凝膠原液中培養，培養完成后，加入凝膠浴液，過濾得到凝膠包裹的干細胞；
[0010](3)將步驟(2)得到凝膠包裹的干細胞裝入三維打印裝置的注射器中，進行三維細胞支架打印，打印過程中，根據有色干細胞的分布情況實時讀取三維細胞支架上有色干細胞的分布信息，最后固化得到三維細胞支架；
[0011](4)將得到的三維細胞支架放置20-48小時后，浸入到干細胞初期分化檢測試劑中，檢測三維細胞支架上干細胞初期分化信息；
[0012](5)將得到的三維細胞支架放置10-15天，利用蛋白檢測設備檢測三維細胞支架上干細胞后期分化信息；
[0013](6)最后進行如下判斷:
[0014]若制備得到三維細胞支架符合要求，則完成打印過程；
[0015]若制備得到三維細胞支架不符合要求，則將步驟(3)得到的三維細胞支架上有色干細胞的分布信息、步驟(4)得到的三維細胞支架上干細胞初期分化信息、以及步驟(5)得到的三維細胞支架上干細胞后期分化信息作為反饋信息，調整步驟(3)中三維打印裝置打印參數，重復步驟(I) - (6)。
[0016]下面對上述技術方案的幾種優選方案做進一步說明:
[0017]本發明所使用的干細胞，可選擇各種干細胞，例如可采用骨骼干細胞、造血干細胞等。本發明中的三維細胞支架打印方法包括細胞培養部分和有機物支架制作部分:有機物支架一般選擇凝膠類有機物，如海藻鹽等可以有效抗紫外輻射及電磁影響的有機材料，除了有機物以外，支架部分還應含有分化細胞對應的蛋白酶和檢測試液，如酚酞等酸堿檢測溶液。
[0018]步驟(I)中，所述的培養染色過程中，可采用的染料為能夠標記成活干細胞的活體染料，常見的活體染料可選擇健那綠B或中性紅的生理鹽水溶液，活體染料的濃度可根據實際需要確定，活體染料濃度過高，會導致干細胞的粘度過大，最后形成的凝膠容易堵塞打印裝置的打印噴頭，不利于后續的打印操作；濃度過低，染色效果不佳；作為優選，所述的健那綠B或中性紅的重量百分比濃度為0.01-0.05%。
[0019]步驟(I)中，所述的將有色干細胞和無色干細胞分離操作可選擇通過離心分離；相對于活細胞，死細胞由于失水，密度相對降低，大部分死細胞會漂浮在活體染料的生理鹽水溶液中，通過離心作業，可快速實現活細胞和死細胞的分離，提高分離效率和分離質量。[0020]步驟(2)中，所述的凝膠原液一般選擇海藻酸鈉水溶液，所述的海藻酸鈉水溶液中海藻酸鈉濃度可根據實際需要調整，實驗證明，當海藻酸鈉的濃度過高時，形成凝膠容易導致打印噴頭堵塞，不利于后續的打印操作；當海藻酸鈉的濃度過低時，由于凝膠濃度較稀，打印線條容易產生擴散，降低了打印精度；作為優選，所述海藻酸鈉水溶液中海藻酸鈉的重量百分比濃度為2-5%，選擇該濃度時，凝膠更容易成型，提高了整體打印效率和打印質量。另外，由于離子會促進凝膠海藻酸鈉的固化，所以在配置凝膠原液時，為避免凝膠原液發生固化，作為優選，配置海藻酸鈉水溶液時，采用去離子水。
[0021]步驟(2)中，所述的凝膠浴液一般選擇CaCl2水溶液，所述的CaCl2水溶液的濃度可根據實際需要調整，實驗證明，CaCl2水溶液的濃度也不易過高過低，CaCl2水溶液的濃度過高和過低均不利于后續打印操作。作為優選，所述的CaCl2A溶液中CaCl2的質量百分比濃度為2-5%。
[0022]步驟(2)中，有色干細胞置于凝膠原液中培養的時間可根據實際需要確定，一般保證有色干細胞充分適應凝膠環境，降低干細胞后續的死亡率，作為優選，所述有色干細胞置于凝膠原液中培養的時間為4小時以上。有色干細胞在凝膠原液培養時間過長，會導致因養料不足死亡，所以作為進一步優選，所述有色細胞置于凝膠原液中培養的時間為4~10小時。該步驟中，加入凝膠浴液后，凝膠進行預固化，預固化時間一般控制在0.5-3分鐘，預固化時間太長，會使得形成凝膠粘度過大，不利于后續的打印作業。
[0023]步驟(3)中，所述的三維打印裝置可選用現有的結構，例如可選用壓電式三維打印裝置等。該步驟中通過CAD和CAM軟件繪制設計三維細胞支架的結構和打印噴頭的運動軌跡，通過打印噴頭和打印接 收平面的X，y, z三軸移動沉積注射得到任意確定的三維支架結構。該步驟中，固化操作一般選用紫外光照射固化，利用可逆光敏特性將三維細胞支架固化定型。紫外燈照射時間不宜過長，紫外照射時間過長，會導致細胞死亡，為滿足固化要求，作為優選，所述的紫外照射時間為1-3分鐘，紫外光的強度一般選擇的較弱的紫外光即可，例如可采用常規醫學消毒用紫外線。打印過程中，有色干細胞的分布情況確定了成活細胞的分布情況，其中，有色干細胞為成活的干細胞，而未顯色部分，表明細胞已經死亡或沒有干細胞存在。通過確定有色干細胞分布從而確定支架中不同位置活干細胞的含量。
[0024]由于干細胞前期分泌的是堿式磷酸酶，后期分泌的膠原蛋白，所以干細胞前期和后期分化情況需要采用不同的檢測手段。步驟(4)中，所述的干細胞初期分化檢測試劑可選擇酚酞指示劑或者花蕊溶液。所述的酚酞指示劑為0.5%酚酞乙醇溶液。將打印得到的三維細胞支架置入細胞初期分化檢測試劑之前，為保證三維細胞支架的整體強度，一般需要放置20-48小時，作為優選，可選擇放置24小時。測試過程中，利用制備的酚酞溶液觀察三維細胞支架中顏色的變化，含有紅色的位置表示酚酞變紅，即細胞產生堿性磷酸酶，從而檢測初始細胞分化的情況，得到干細胞初期分化信息。步驟(5)中，通過蛋白檢測設備可檢測出細胞后期分化的情況和位置，得到干細胞后期分化信息。蛋白檢測設備可選用現有的設備。通過蛋白檢測設備檢測前，作為優選，可將得到的三維細胞支架放置2周。
[0025]在支架制作的過程中，將細胞及支架有機物按一定比例混合并在培養基中培養，培養時需要保證有機物的養分可以足夠使干細胞成活并分化。在確定比例后，通過層狀結構裝入注射器中利用壓電噴射原理進行沉積。通過CAD及CAM技術，設計沉積立體結構和沉積軌跡，通過打印噴頭和接受平面的三軸移動實現裝載細胞的三維細胞支架沉積。[0026]在實際操作的過程中，通過干細胞中熒光物質或放射性物質的檢測，可以實時觀察干細胞在三維細胞支架中的比例，從而通過實時改變壓電的頻率，電壓，脈沖寬度等因素來控制干細胞在有機物中的占比。在構成的三維細胞支架結構中，利用不同蛋白酶及檢測試劑來確定所含干細胞的分化情況。對于已分化干細胞，相應的酶檢測到分化后特化細胞的分泌物并通過檢測試劑表現出來，從而實時反應干細胞的分化情況。
[0027]本發明采用在細胞液培養時加入標記物，如染色溶劑或放射性元素標記特定的元素。從而達到實時跟蹤細胞分布的目的，在支架材料制作的過程中，混合用于檢測成細胞分泌物的試液，達到實時檢測干細胞分化進程的目的。通過細胞追蹤及細胞分化過程的實時檢測，可以對裝載細胞的凝膠沉積進行實時的監控，從而方便研究細胞成活和分化與沉積技術各參數(如沉積速度，壓電脈沖寬度等)直接的關系，大大縮短了研究周期和成本。
[0028]與現有技術相比，本發明具有如下優點:
[0029](I)通過干細胞和三維細胞支架材料在注射器中的層狀融合，去除先制作支架后注入細胞導致的外界因素，將細胞培養和三維細胞支架形成兩步分離，從而分步實現，避免大量的實驗；(2)通過熒光和放射性標記的方式，標記跟蹤培養干細胞，從而可以確定在混合到噴射再到沉積過程中，干細胞在支架中的含量以及干細胞的分布，這樣就避免利用顯微鏡觀察試驗后支架組成，具有實時性；(3)通過利用三維細胞支架混入特化細胞蛋白酶及檢測試液的方式，可以達到實時檢測干細胞分化情況的目的，從而通過得到關于支架材料，結構和分化的對應關系，對后續的打印過程進行實時改進。
【具體實施方式】
[0030]實施例1
[0031](I)細胞培育部分:
[0032](I)配置中性紅染 色液，取0.1g健那綠B粉末溶解于IL生理鹽水中攪拌均勻，配制成濃度為0.01%的健那綠B溶液。
[0033](II)取IOOml上述溶液浸入培養皿中，浸泡骨骼干細胞Ih后，通過過濾紙過濾出骨骼干細胞。
[0034](III)在過濾出的骨骼干細胞中，通過離心機分離，選擇沉淀綠色的細胞，分離出無色細胞。其中綠色細胞為活骨骼干細胞。再補充細胞培養液配置成IOOml細胞綠色溶液。
[0035](2)凝膠支架部分:
[0036]本發明采用海藻膠材料作為支架的基本材料，混合酚酞用于檢測成骨細胞早期分泌的堿性磷酸酶。
[0037](I)取海藻酸鈉4g溶解于IOOml去離子水中，配制成重量百分比濃度為4%的凝膠原液。
[0038](II)取CaCl2粉末2g溶解于IOOml蒸餾水中，配制成重量百分比濃度為2%的凝膠浴液。
[0039](3)將(I)部分篩選的綠色的骨骼干細胞置于凝膠原液中，通過抽吸的方式使細胞核凝膠原液混合均勻，培養4h。
[0040](4)向(3)中的培養液中加入凝膠浴液，加入過程伴有輕輕攪拌得到膠狀凝膠包裹的干細胞。[0041](5)使用濾紙過濾出凝膠包裹的綠色細胞，得到骨骼干細胞與海藻膠層狀混合結構，其海藻膠的層狀孔隙在100-200um之間，裝入三維打印裝置的儲液器中進行噴射沉積。
[0042](6)通過CAD和CAM軟件繪制設計支架的結構和打印噴頭的運動軌跡，通過注射器和接收平面的X，y, Z三軸移動沉積注射得到任意確定的三維支架結構，例如，本實施例中需要打印的三維支架結構為單層平面正方形結構，其中Q、P、R、S為該正方形結構的四個角部，接收平面移動速度lOmm/s，氣壓300kPa。本實施例中可選用市購的擠壓式打印裝置。
[0043](7)通過弱紫外線照射約Imin (即醫學消毒用紫外線)，利用海藻酸鹽凝膠可逆光敏特性將支架固化定型。
[0044](8)通過支架結構沉積過程中，加入少量蒸餾水沖洗并過濾，實時觀察綠色的分布情況確定骨骼干細胞的分布情況，其中，顯綠色的部分為成活的骨骼干細胞，而未顯色部分，表明細胞已經死亡或沒有細胞存在。通過確定綠色分布從而確定三維細胞支架中不同位置骨骼干細胞的含量信息。以單層平面正方形QPRS為例，四個角Q，P, R, S處綠色較深，而中心點O (O為單層平面正方形的中心)處綠色成零星點狀分布。說明，外圍四角活細胞含量多而正方形中心處細胞含量少。
[0045](9)配制酚酞指示劑(0.5%酚酞乙醇溶液):取0.5g酚酞，用95%乙醇溶解，并稀釋至IOOmL，無需加水。
[0046](10)支架形成后24小時，滴入步驟(9)制備的酚酞溶液觀察支架-單層平面正方形QPRS中觀察顏色的變化，含有紅色的位置表示酚酞變紅，即產生堿性磷酸酶，從而確定骨干細胞分化成特化細胞的位置，即得到骨干細胞的初期分化信息。觀察得，中心處O點紅色呈時斷時續，Q，P, R, S處基本無紅色。說明中心處細胞含量少但成功分化，四個角細胞含量高但營養不足沒有很好的分化。
[0047](11)支架形成后2周左右，檢測支架中膠原蛋白的含量及分布情況，從而確定得到骨干細胞的后期分化信息，檢測支架中膠原蛋白的方法如下:
[0048](I)分別選取三維細胞支架結構上單層正方形的四個角Q，P, R, S以及中心點O五點標記為1，2，3，4，5，取五個位置的樣品5g溶于50ml蒸餾水中配制成五份待測溶液，記為a，b，c，d，ο。
[0049](II)使用I型膠原ELISA檢測試劑盒，用標本稀釋液1:1稀釋后加入50ml于反應孔內，然后加入待測樣品50ul于反應孔內。立即加入50ul的生物素標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37°C溫育I小時。
[0050](III)甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。
[0051](IV)每孔加入80ml的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37°C溫育30分鐘。
[0052](V)甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。
[0053] (￥1)每孔加入顯色劑4、8(八，8為試劑盒自帶顯色劑)各50ml，輕輕振蕩混勻，37°C溫育10分鐘。避免光照。
[0054](VII)取出酶標板，迅速加入50ml終止液，加入終止液后應立即測定結果。
[0055](VIII)在450nm波長處測定各孔的OD值。若OD值極低或為零則不含膠原蛋白。即此位置的細胞沒有分化。
【權利要求】
1.一種基于細胞狀態反饋的三維細胞支架打印方法，其特征在于，包括: (1)將干細胞置于活體染料的培養皿中培養染色，直至干細胞變色后，將有色干細胞和無色干細胞分離，取出有色干細胞； (2)將染色后的有色干細胞置于凝膠原液中培養，培養完成后，加入凝膠浴液，過濾得到凝膠包裹的干細胞； (3)將步驟(2)得到凝膠包裹的干細胞裝入三維打印裝置的注射器中，進行三維細胞支架打印，打印過程中，根據有色干細胞的分布情況實時讀取三維細胞支架上有色干細胞的分布信息，最后固化得到三維細胞支架； (4)將得到的三維細胞支架放置20-48小時后，浸入到干細胞初期分化檢測試劑中，檢測三維細胞支架上干細胞初期分化信息； (5)將得到的三維細胞支架放置10-15天，利用蛋白檢測設備檢測三維細胞支架上干細胞后期分化信息； (6)最后進行如下判斷: 若制備得到三維細胞支架符合要求，則完成打印過程； 若制備得到三維細胞支架不符合要求，則將步驟(3)得到的三維細胞支架上有色干細胞的分布信息、步驟(4)得到的三維細胞支架上干細胞初期分化信息、以及步驟(5)得到的三維細胞支架上干細胞后期分化信息作為反饋信息，調整步驟(3)中三維打印裝置打印參數，重復步驟(I) - (6)。
2.根據權利要求1所述的基于細胞狀態反饋的三維細胞支架打印方法，其特征在于，步驟(I)中，所述的培養染.色過程中，采用健那綠B或中性紅的生理鹽水溶液進行染色，所述的健那綠B或中性紅的重量百分比濃度為0.01-0.05%。
3.根據權利要求1所述的基于細胞狀態反饋的三維細胞支架打印方法，其特征在于，步驟(I)中，所述的將有色干細胞和無色干細胞分離操作采用通過離心分離。
4.根據權利要求1所述的基于細胞狀態反饋的三維細胞支架打印方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的凝膠原液為海藻酸鈉水溶液，所述海藻酸鈉水溶液中海藻酸鈉的重量百分比濃度為2-5%。
5.根據權利要求4所述的基于細胞狀態反饋的三維細胞支架打印方法，其特征在于，所述的海藻酸鈉水溶液中的水采用去離子水。
6.根據權利要求1所述的基于細胞狀態反饋的三維細胞支架打印方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的凝膠浴液為CaCl2水溶液，所述的CaCl2水溶液中CaCl2的質量百分比濃度為2-5%。
7.根據權利要求1所述的基于細胞狀態反饋的三維細胞支架打印方法，其特征在于，步驟(2)中，有色干細胞置于凝膠原液中培養的時間為4小時以上。
8.根據權利要求1所述的基于細胞狀態反饋的三維細胞支架打印方法，其特征在于，步驟(2)中，加入凝膠浴液后，保持0.5-3分鐘。
9.根據權利要求1所述的基于細胞狀態反饋的三維細胞支架打印方法，其特征在于，步驟(4)中，所述的干細胞初期分化檢測試劑為0.5%酚酞乙醇溶液。
【文檔編號】C12N5/071GK103468635SQ201310371480
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年8月23日 優先權日:2013年8月23日
【發明者】賀永, 夏冰, 傅建中, 趙朋, 金育安 申請人:浙江大學