一種高抗絲黑穗病的蛋白ZmWAK及其編碼基因和其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種玉米ZmWAK蛋白及其編碼基因與應用。該蛋白ZmWAK，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質：1）序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸殘基序列；2）將序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗絲黑穗病相關的由1)衍生的蛋白質。本發明的蛋白和其編碼基因可用來培育高抗絲黑穗病的玉米，為轉基因植物的培育奠定了基礎。
【專利說明】-種高抗絲黑穗病的蛋白ZmWAK及其編碼基因和其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程領域，具體涉及一種高抗絲黑穗病的蛋白及其編碼基因和其 應用。
【背景技術】
[0002] 絲黑穗病是一種土傳性系統病害，嚴重危害玉米和高粱的生產，最早報道于1914 年，如今已成為世界各個主要玉米產區的嚴重病害。在我國，絲黑穗病主要發生在東北的春 玉米產區，以及西北、內蒙等地。90年代初由于感病品種的種植，絲黑穗病發生率逐年升高， 每年造成產量損失達30萬噸左右。2002年，東北地區玉米產區絲黑穗病大面積爆發，發病 面積達100萬hm2以上，占東北三省總種植面積的20%左右，造成10-15%的玉米產量的損 失。
[0003] 絲黑穗病是由絲軸黑粉菌（Sporisoriumreilianum)特異引起的真菌性病害，發 病植株病癭上的冬孢子進入土壤越冬，成為來年的主要初始侵染源。絲軸黑粉菌的冬孢子 在土壤中可以保持活力3-5年，萌發不需要生理休眠后熟過程。在土壤中不同親和交配 型的冬孢子交配形成2倍體的侵染菌絲，進而侵染玉米幼苗。冬孢子侵染的最適溫度為 23-30°C，土壤含水量較低或中等。
[0004] 玉米感染絲黑穗病后，前期并不表現出明顯的癥狀，但是某些發病較重的植株在 早期可能出現植株矮化、分蘗增多的現象。成熟期的發病植株也只在雌雄穗上表現出典型 病征。雄穗被侵染后，不散粉，可形成病癭，內部充滿孢子。如果雌穗發病，表現為不吐花 絲，膨大增生，除苞葉外內部被冬孢子取代。在生育后期部分苞葉破裂散出黑粉孢子，內部 夾雜絲狀寄主維管組織。除此之外，還經常可見發病植株的雄穗和雌穗表現畸形生長，雌雄 同生，雌穗葉狀化等異常現象。由于絲黑穗病最終破壞的是玉米的花器官，因此它屬于嚴重 破壞生產的絕產型病害，一旦發病，對產量影響巨大。
[0005] 使用化學殺真菌劑可以對絲黑穗病進行一定程度的防治，但是效果有限，并且增 加了農民的成本以及對環境的危害，因此培育和推廣種植抗病品種是對絲黑穗病進行控制 的持續有效手段。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提供一種高抗絲黑穗病的蛋白及其編碼基因。所述高抗絲黑穗病 的蛋白命名為ZmWAK,來源于玉米（Zea mays)。
[0007] 本發明提供的蛋白，是如下1)或2)的蛋白：
[0008] 1)序列表中的SEQIDNs.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0009] 2)將序列表中的SEQIDNs. 2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的 取代和/或缺失和/或添加且與植物抗絲黑穗病相關的由1)衍生的蛋白質。
[0010] 序列表中SEQIDN2 . 2所示的氨基酸序列由730個氨基酸殘基組成。
[0011]上述1)和2)所述的ZmWAK蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物 表達得到。上述1)和2)所述的ZmWAK蛋白的編碼基因可通過將序列表中SEQIDNs. 1的 第70-2259位核苷酸所示的DNA序列缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一 個或幾個堿基對的錯義突變后得到。
[0012] 編碼所述ZmWAK蛋白的核酸分子也屬于本發明的保護范圍。
[0013] 所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA ;所述核酸分子也可以 是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。
[0014] 所述蛋白的編碼基因也屬于本發明保護的范圍。
[0015] 所述蛋白的編碼基因具有下述核苷酸序列之一：
[0016] 1)序列表中SEQIDNs:1第70-2259位的核苷酸序列；
[0017] 2)編碼序列表中SEQIDN2 :2蛋白質序列的多核苷酸序列；
[0018] 3)序列表中SEQIDNs:3所示的核苷酸序列；
[0019] 4)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQIDNs:1或SEQIDNs:3限定的DNA序列 雜交的核苷酸序列；
[0020] 5)與1)或2)或3)或4)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能 蛋白質的DNA序列；具體的，所述同源性為95%以上；再具體的為96%以上；再具體的為97% 以上；再具體的為98%以上；再具體的為99%以上。
[0021] 上述高嚴謹條件可為用6XSSC，0. 5%SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2XSSC， 0· 1%SDS和IXSSC，(λ1%SDS各洗膜一次。
[0022] 其中，序列表中的SEQIDN2 :1由2517個核苷酸組成，其開放閱讀框架（ORF)為 自5'末端第70-2259位核苷酸，編碼序列表中SEQIDN2 :2所示的蛋白質，即本發明所述 的ZmWAK蛋白。
[0023] 含有所述編碼基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或宿主菌也屬于本發明保 護的范圍。
[0024] 所述重組載體具體為重組表達載體或重組克隆載體。
[0025] 所述重組表達載體可用現有的表達載體構建。所述表達載體還可包含外源基因的 3'端非翻譯區域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。 所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3'端。使用所述基因構建重組表達 載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型、組成型、組織特異型或誘導型啟動 子，它們可單獨使用或與其它的啟動子結合使用；此外，使用本發明的基因構建重組表達載 體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子。為了便于對轉基因植物細胞或植物 進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入在植物中表達可產生顏色變化 的酶或發光化合物的基因（GUS基因、GFP基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記 物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等）或是抗化學試劑標記基因（如抗除莠劑基因）等。 從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉化植株。
[0026] 所述重組表達載體具體為在出發載體PCAMBIA1300的多克隆位點插入具有SEQ IDNs:3所示核酸序列的DNA片段所得的質粒。
[0027] 擴增本發明所述編碼基因全長或其任意片段的引物對也屬于本發明保護的范圍。
[0028] 本發明的另一個目的是提供所述蛋白、所述編碼基因或所述的重組載體、表達盒、 轉基因細胞系或宿主菌在增強植物抗絲黑穗病中的應用。
[0029] 所述的應用中，所述植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述單子葉植物具體為玉 米。
[0030] 本發明的還一個目的是提供所述蛋白、所述編碼基因或所述的重組載體、表達盒、 轉基因細胞系或宿主菌在培育轉基因植物中的應用；所述轉基因植物與所述目的植物相 t匕，所述轉基因植物對絲黑穗病的抗性增強。
[0031] 所述植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述單子葉植物具體為玉米。
[0032] 本發明的還一個目的是提供一種培育轉基因植物的方法，是將所述編碼基因或權 利要求4所述的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或宿主菌導入目的植物，得到轉基因植 物；所述轉基因植物與所述目的植物相比，所述轉基因植物對絲黑穗病的抗性增強。
[0033] 所述方法中，所述植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述單子葉植物具體為玉米。
[0034] 本發明的還一個目的是提供一種分子標記，為下述1)或2):
[0035] 1) -條引物具有序列表中SEQIDN2 :4所示的核苷酸序列，另一條引物具有序列 表中SEQIDNs:5所不的核苷酸序列；
[0036] 2) -條引物的核酸序列為序列表中SEQIDN2 :4所示的核苷酸序列的反向互補 序列，另一條引物的核酸序列為序列表中SEQIDN2 :5所示的核苷酸序列的反向互補序 列。
[0037] 本發明的再一個目的是提供所述分子標記物在鑒定和/或檢測所述編碼基因或 待測植物是否抗絲黑穗病中的應用。
[0038] 所述應用中，所述植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述單子葉植物具體為玉米。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0039] 圖1為使用分子標記genoWAK2進行轉ZmWAK基因玉米鑒定的結果圖。
[0040] 圖2為轉ZmWAK基因玉米與非轉基因玉米的表型鑒定結果圖。
[0041] 圖3為轉ZmWAK基因玉米與非轉基因玉米的抗病率統計結果。
【具體實施方式】
[0042] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0043] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0044] 下述實施例中所用的材料Ji1037、絲軸黑粉菌和高感絲黑穗病自交系Huangza〇4 見文獻ChenY,ChaoQ,TanG,ZhaoJ,ZhangM,JiQ,etal.Identificationand fine-mappingofamajorQTLconferringresistanceagainstheadsmutinmaize. TheorApplGenet2008:117:1241-52.和ZhaoX，TanG，XingY，WeiL，ChaoQ，ZuoW，et al.Marker-assistedintrogressionofqHSRltoimprovemaizeresistancetohead smut.MolecularBreeding2012;30:1077-88.的報道，公眾可從中國農業大學獲得上述材 料。
[0045] 下述實施例中所用的玉米材料HiII見文獻ArmstrongC，GreenC，Phillips R.DevelopmentandavailabilityofgermplasmwithhighTypeIIcultureformation response.Maizegeneticscooperationnewsletterl991.的報道，公眾可從中國農業大 學獲得上述材料。
[0046] 實施例I、玉米基因ZmWAK的制備
[0047] 1、總RNA的提取
[0048] 收集上一年發病植株病纓，置陰涼干燥處避光保存，作為第二年的接種源。利用 100目的篩子對病纓進行初篩，過濾掉植物殘留的維管組織，收集黑粉孢子用于接種。將 高抗絲黑穗病玉米自交系Jil〇37接種絲軸黑粉菌48h后，使用Invitrogen公司提供的 TriZol試劑提取接種后的Ji1037根部組織總RNA。
[0049] 2、ZmWAK基因全長cDNA的獲得
[0050] 第一鏈cDNA的合成使用試劑盒BDSMART?RACEcDNAAmplificationKit，RACE 所用引物序列為：
[0051] WAK-3'RACE: 5 ' -AACTACACCTTCAAGGCATCCGACC-3 '
[0052] WAK-5'RACE:5' -GACTTCGAACTGGAACCTGATCTCG-3'
[0053] 將上述5'和3'RACE產物克隆到pEASY-Tl載體(購買自北京全式金生物技術有限 公司）上，選擇陽性克隆分別測序、拼接后即可獲得ZmWAK基因全長cDNA的序列，如序列表 SEQIDNs:l所示，共2517bp，其中編碼區長2190bp，該編碼區序列如序列表中SEQIDNs: 1中第70-2259位核苷酸所示，編碼序列表中SEQIDN2 :2所示的氨基酸序列，共730個氨 基酸殘基。
[0054] 利用以下引物從Jil037的cDNA中擴增可得到ZmWAK編碼區全長的cDNA轉錄本。
[0055] fIcWAKL: 5，-ATGTCATCACTCCTGTTGCGAG-3，
[0056] flcWAKR:5, -ATGTGCCGACCGACCATTC-3，
[0057] 經測序，上述引物對擴增出的核酸片段具有序列表中SEQIDNs:1的第70-2350 位核苷酸所示核酸序列，包含ZmWAK基因編碼區核酸序列。
[0058] 實施例2、玉米基因ZmWAK的功能驗證
[0059] (一 )、表達載體的構建
[0060] 通過對M〇17BAC文庫的篩選，獲得了一個包含候選區段的陽性克隆MO-J12。利用Sau3AI對陽性克隆進行部分酶切，選擇電泳分離后片段大于IOkb的片段進行純化回收。同 時，利用BamHI對pCAMBIA1300載體進行酶切純化回收。將目的基因片段和載體酶切產物 用T4DNA連接酶，16°C連接過夜，電擊轉化。選擇陽性克隆進行測序，結果表明插入載體的 序列為序列表中SEQIDNs:3所不的核酸序列，該序列包含有ZmWAK基因的基因組序列。將 該在PCAMBIA1300載體的BamHI酶切位點插入具有SEQIDNs:3所示核酸序列的DNA片段 的質粒命名為P1300-WAK。將該具有序列表中SEQIDNs:3第4001-10000位核苷酸序列的 片段命名為ZmWAK。
[0061] (二)、互補轉基因試驗
[0062] UHiII(感玉米絲黑穗病）的獲得
[0063] 玉米材料HiII為親本A和B的雜交F1，經過鑒定親本A和B都感玉米絲黑穗病。
[0064] 2、表達載體的轉化
[0065] 將上述制備得到的表達載體P1300-WAK轉化到農桿菌EHA105中，利用農桿菌介導 法將表達載體轉化入感絲黑穗病玉米材料HiII的幼胚中，利用潮霉素對轉化陽性愈傷進 行篩選，最后得到轉基因陽性植株。同時設置轉空載體對照。
[0066] 3、轉ZmWAK基因玉米的鑒定
[0067] 使用分子標記gen〇WAK2對轉基因后代進行鑒定
[0068] 取玉米幼苗時期的實驗組和對照組植株葉片，提取待測植株基因組DNA，以該基因 組DNA為模板，以CldH2O為空白對照，未轉染表達載體的玉米材料HiII基因組DNA為陰性 對照，表達載體質粒為陽性對照，PCR擴增時所用引物序列為：
[0069]genoWAK2F:5, -TTAAGGCCTAGGCAACGCTC-3,；
[0070]genoWAk2R:5，-GCGTGAGCCTATCTAGCGAC-3，。
[0071] 上述genoWAK2F的核酸序列見序列表中SEQIDNs:4所示；genoWAk2R的核酸序列 見序列表中SEQIDNs:5所示。上述genoWAK2F和genoWAk2R組成的引物對是根據ZmWAK 基因編碼鏈的反向互補鏈設計的。
[0072] 將擴增產物在瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，檢測結果顯示，上述選取的實驗組植 株和表達載體質粒陽性對照組中均可以檢測到約446bp的條帶，而CldH2O空白對照和未轉 染表達載體的玉米材料HiII陰性對照組中均未檢測到相應的DNA分子片段，說明ZmWAK基 因已整合到上述實驗組玉米材料HiII的基因組中。
[0073](三)、轉ZmWAK基因玉米的表型
[0074] 將上述鑒定為陽性的Ttl代轉基因植株進行自交得到T1代。將T1代陽性植株與高 感絲黑穗病自交系Huangza〇4進行雜交得到T1F1后代。對T1F1代進行自交得T1F2代；T1F1 代與高感絲黑穗病自交系回交得BC1T1Fiq
[0075] 使用分子標記gen〇WAK2對T1Fp I\F2、BC1T1F1代植株進行基因型鑒定。鑒定過程 同本實施例中轉ZmWAK基因玉米的鑒定過程一樣，不同的是將上述實驗組和對照組植物更 換為T1Fp T1F2JC1T1F1代植株。
[0076] 使用分子標記gen〇WAK2進行基因型鑒定的部分結果見圖1所示。圖1中，M表示 2-kbmarker，泳道1的模板為表達載體質粒，泳道2的模板為親本A的基因組DNA，泳道 3的模板為親本B的基因組DNA，泳道4為CldH2O空白對照，泳道5-16的模板為#17-2轉 基因事件Tl代陽性植株。
[0077] 按照基因型鑒定結果將后代分為兩種類型：
[0078] 將可檢測到446bp條帶的植株定義為帶有轉ZmWAK基因插入片段的后代，根據檢 測結果，屬于此類型的植株包括：# 17-2、#9-21的T1F1代植株、植株# 17-2的T1F2代和BC1T1F1 代植株含有轉基因插入片段的分離后代單株；
[0079] 將未檢測到446bp條帶的植株定義為不帶轉基因插入片段的后代，根據檢測結 果，屬于此類型的植株包括：#17-2、#9-21的T1F1代植株、植株#17-2的T1F2代和BC1T1F1代 植株不帶轉基因片段的同胞分離后代單株。
[0080] 對上述兩種類型的后代進行表型鑒定。對于玉米絲黑穗病，單株表型鑒定準確，具 體鑒定標準為：將玉米雌雄穗含有黑粉孢子或是表現出畸形生長的植株定為感病，所有表 現正常的植株為抗病。然后對上述兩種類型的后代進行的抗病率進行統計，最后計算兩種 類型的后代在抗病率上是否存在顯著差異，以鑒定基因的功能。同時設置轉空載體對照。
[0081] 表型鑒定過程：取上一年病株的病纓，收集黑粉孢子避光通風貯藏，作為來年的接 種源。將需要鑒定的玉米種子播種于育苗盤中，種子上覆蓋含有1%。黑粉孢子的土壤進行人 工接種。在育苗盤中接種生長一個月后，將接種的幼苗移栽入地里繼續生長發育。在玉米 乳熟期進行性狀鑒定。鑒定時觀察玉米的雌穗和雄穗是否出現典型癥狀，必要時需要將雌 穗的苞葉剝開，觀察內部是否存在黑粉病纓。
[0082] 表型鑒定結果見圖2。圖2結果顯示#17-2的分離后代BC1T1F1代中，帶有轉基因 的插入片段的單株（見圖2中標記為轉基因的植株），其雌穗表現正常，能夠順利吐絲授粉。 而分離后代BC1T1F1代中不帶有轉基因插入片段的單株(見圖2中標記為非轉基因的植株)， 其雌穗被病菌的黑粉孢子取代，不能正常吐絲授粉。轉空載體對照的表型與圖2中標記為 非轉基因的植株的表型一致。
[0083] 抗病率統計結果見圖3。圖3結果顯示，兩個轉基因事件#17-2和#9-21的T1代 轉基因陽性植株與黃早四雜交的分離后代T1F1代中帶有轉ZmWAK基因插入片段的植株(見 圖3A中標記為轉基因的統計結果，**表示p〈0. 01)，以及植株#17-2的T1F1代中轉基因陽 性植株與黃早四雜交的BC1T1F1代植株(見圖3B中標記為轉基因的統計結果，*表示p〈0. 05) 和自交后代T1F2代植株(見圖3C中標記為轉基因的統計結果，**表示p〈0. 01)中帶有轉 ZmWAK基因插入片段的植株，其絲黑穗抗性顯著高于其同世代中不帶有轉ZmWAK基因插入 片段的同胞植株(見圖3A-C中標記為非轉基因的統計結果)。
[0084] 上述實驗結果表明，玉米基因ZmWAK可顯著增強玉米對絲軸黑粉菌的抗性，可用 于制備高抗絲黑穗病玉米。
【權利要求】
1. 一種蛋白，是如下1)或2)的蛋白： 1) 序列表中的SEQ ID Ns. 2所示的氨基酸序列組成的蛋白質； 2) 將序列表中的SEQ ID Ns . 2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代 和/或缺失和/或添加且與植物抗絲黑穗病相關的由1)衍生的蛋白質。
2. 權利要求1所述蛋白的編碼基因。
3. 根據權利要求2所述的編碼基因，其特征在于：所述編碼基因具有下述核苷酸序列 之一： 1) 序列表中SEQ ID Ns :1第70-2259位的核苷酸序列； 2) 編碼序列表中SEQ ID Ns :2蛋白質序列的多核苷酸序列； 3) 序列表中SEQ ID Ns :3所示的核苷酸序列； 4) 在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID Ns:l或SEQ ID Ns:3限定的DNA序列雜交 的核苷酸序列； 5) 與1)或2)或3)或4)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白 質的DNA序列；具體的，所述同源性為95%以上；再具體的為96%以上；再具體的為97%以 上；再具體的為98%以上；再具體的為99%以上。
4. 含有權利要求2或3所述的編碼基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或宿主菌； 所述重組載體具體為重組表達載體或重組克隆載體。
5. 根據權利要求4所述的重組表達載體，其特征在于：所述重組表達載體具體為在出 發載體PCAMBIA1300的多克隆位點插入具有SEQ ID N2:3所示核酸序列的DNA片段所得的 質粒。
6. 擴增權利要求2或3所述編碼基因全長或其任意片段的引物對。
7. 權利要求1所述的蛋白和權利要求2-3任一所述的編碼基因和權利要求4所述的重 組載體、表達盒、轉基因細胞系或宿主菌在增強植物抗絲黑穗病中的應用； 或，在培育轉基因植物中的應用；所述轉基因植物與所述目的植物相比，所述轉基因植 物對絲黑穗病的抗性增強。
8. -種培育轉基因植物的方法，是將權利要求2-3任一所述的編碼基因或權利要求4 所述的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或宿主菌導入目的植物，得到轉基因植物；所述轉 基因植物與所述目的植物相比，所述轉基因植物對絲黑穗病的抗性增強。
9. 一種分子標記，為下述1)或2): 1) 一條引物具有序列表中SEQ ID Ns :4所7]^的核昔酸序列，另一條引物具有序列表中 SEQ ID Ns :5所示的核苷酸序列； 2) -條引物的核酸序列為序列表中SEQ ID Ns :4所示的核苷酸序列的反向互補序列， 另一條引物的核酸序列為序列表中SEQ ID N2:5所示的核苷酸序列的反向互補序列。
10. 權利要求9所述的分子標記物在鑒定和/或檢測權利要求2或3所述編碼基因或 待測植物是否抗絲黑穗病中的應用。
【文檔編號】C12N15/29GK104341494SQ201310346549
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年8月9日 優先權日:2013年8月9日
【發明者】徐明良, 左為亮, 譚國慶, 晁青, 陳永勝, 趙賢容, 張楠, 邢躍先, 魏萊, 趙晶, 張博琦, 夏遠峰 申請人:中國農業大學