唾液腺組織特異性的轉基因載體及其構建方法

唾液腺組織特異性的轉基因載體及其構建方法
【專利摘要】本發明公開了一種唾液腺組織特異性的轉基因載體及其構建方法。所述唾液腺組織特異性的轉基因載體是通過將小鼠腮腺蛋白啟動子上游調控區序列和可視化篩選neo-EGFP融合雙標記整合到piggyBac轉座系統和Lox-Cre酶系統中構建得到，該轉基因載體可使目的蛋白在特定組織表達，實現大片段的高效整合效率；且該載體還具有便于篩選的綠色熒光標記和真核細胞篩選的新霉素抗性基因，使轉基因細胞篩選和轉基因動物鑒定更簡單、直接、準確；本發明的轉基因載體是一種唾液腺特異表達高效整合通用載體，可用于轉基因小鼠和豬等動物方面轉基因應用。本發明首次克隆FVB小鼠上游調控區，克隆方法簡單高效，有效克服了大片段載體構建難度。
【專利說明】唾液腺組織特異性的轉基因載體及其構建方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，具體地說，本發明涉及一種唾液腺組織特異性的高效整合轉基因載體及其構建方法，本發明還涉及小鼠腮腺蛋白上游調控區的PCR擴增片段及其克隆方法。
【背景技術】
[0002]傳統載體構建主要借助基因工程限制性內切酶、T4連接酶以及PCR技術把目的片段連接到相應的載體骨架上，然后經過酶切鑒定，測序驗證，完成載體構建。根據實驗需要有時需要連接多個片段，常因限制性酶切位點限制，使實驗設計越來越困難，載體片段越來越大而導致T4連接酶效率低下，載體構建難度大。因此，傳統載體構建技術在大載體(12Kb以上)載體構建方面很難成功。
[0003]腮腺蛋白是腮腺中表達豐度最高的蛋白。腮腺蛋白基因定位在小鼠2號染色體上，在基因組中該基因以單拷貝形式存在，且主要在腮腺特異表達，還有研究顯示其在唾液腺的頜下腺和舌下腺也有低表達。研究顯示該基因主要是由腮腺蛋白基因的上游調控區(11.5Kb)和下游序列(約2.5~3kb)(即腮腺蛋白啟動子PSP)調控的，但其調控基因僅在唾液腺中調控表達，在全身其他組織器官不表達。唾液腺表達外源蛋白的轉基因動物原理就是借助腮腺蛋白啟動子可以把目的蛋白(酶或者藥物)在腮腺、舍下腺以及下頜下腺等唾液腺體經表達后直接分泌到動物唾液中，經口腔進入動物消化道，來發揮其功能。
[0004]小鼠腮腺啟動子(PSP)載體應用方面最近的報道還是2001年，由加拿大的學者Serguei P.Golovan在制備環境友好動物時應用的,該載體結構比較簡單,僅用植酸酶基因代替原來腮腺蛋白基因，沒有篩選標記和熒光標記，整合效率也比較低，且整合進基因組多已頭尾串聯形式，這種整合模式在基因組內，更容易被沉默和丟失，因為沒有篩選標記，該載體只適合原核注射或者ICS`I (胞漿注射)方法生產轉基因動物，動物中經濟價值較大是豬，但豬受精卵不透明，看不到原核。且豬早期胚胎收集難度大，技術難題大。其載體結構如圖1所示。
[0005]2006年由中國農業大學伊海芳構建2個豬腮腺蛋白啟動子(PSP)載體，除了載體骨架，這兩個載體都采用豬PSP部分上游調控區序列(IOkb)連接植酸酶基因，其差異在其后面加尾信號:一個是bGH-pA ;另一個是豬腮腺蛋白PSP下游的Poly-PA。這兩個載體都帶一個藥物篩選基因neo。雖然這兩個載體可以進行藥物篩選，但沒有可視標記，對篩選轉基因細胞很難確認，仍是傳統載體，其整合模式與Serguei P.Golovan構建小鼠腿腺蛋白載體類似。但豬腮腺蛋白啟動子由于其研究還不夠透徹，目前分析，在其上游IOKb調控區內，調控元件不全，可能在其它區域還存在其它增強子區，導致其下游蛋白酶基因表達量低。2個豬腮腺蛋白啟動子(PSP)載體結構如圖2所示。

【發明內容】

[0006]基于此，為了克服上述現有技術的缺陷，本發明提供了一種唾液腺組織特異性的轉基因載體及其構建方法。
[0007]為實現上述發明目的，本發明采取了以下技術方案:
[0008]一種唾液腺組織特異性的轉基因載體的構建方法，包括以下步驟:
[0009](I)、分別以質粒 pcDNA3.1 (+)和 pT2AL200R175_CAGGS_EGFP 為模板，SEQ ID NO: 5和SEQ ID N0:6、及SEQ ID N0:7和SEQ ID NO:8為引物進行第一次PCR擴增，獲得帶有若干重疊序列的neo基因和EGFP基因；各取0.5-3 μ L混合后作為模板進行第二次PCR擴增，純化得到neo-EGFP融合基因；用EcoR I和Xba I雙酶切pcDNA3.1 (+)和neo-EGFP融合基因，純化回收酶切產物，連接，構建得到pcDNA-Neo-T2A-EGFP載體；
[0010](2)、以質粒 pPB-UbC-EGFP-neo 為模板，分別以 SEQ ID NO: 9 和 SEQ ID NO: 10、及 SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12 作為引物，進行 PCR 擴增得到 Not 1-5-PB-Not I，Xho 1-3-PB-Xho I，分別采用Not I和Xho I酶切后，連接在載體pPSPBGPneo-XynB上，得到載體 pPSPBGPneo-PB-XynB ；
[0011](3)、以步驟(1)得到的pcDNA-neo-T2A-EGFP載體為模板，用長片段PCR體系，SEQID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 作為引物進行 PCR擴增得到 infusion-CMV-neo-T2A_EGFP 片段，切膠純化；用Cla I和Bgl II雙酶切步驟⑵得到的載體pPSPBGPneo-PB-XynB，對目的片段切膠純化；將infusion-CMV-neo-T2A-EGFP片段重組到pPSPBGPNeo-PB-XynB載體的兩個1xp 位點中間，得到 pPSPBGPneo-T2A-EGFP-PB-XynB 載體；
[0012](4)、以步驟(3)得到的 pPSPBGPneo-T2A-EGFP-PB-XynB 載體為模板，SEQ IDNO: 15和SEQ ID NO: 16作為引物，進行PCR擴增，得到載體中的pPB-lox—neoEGFP—loxp片段，并添加AgeI限制性內切酶位點，純化，得到新載體骨架；
[0013](5)、以小鼠腮腺蛋白基因上游調控區的PCR擴增片段為模板，SEQ ID N0:17和SEQID勵:18為引物，擴增得到小鼠腮腺蛋白上游調控區的下游400%?片段，將400%?片段與新載體骨架pPB-lox-neoEGFP-`loxp中的重組序列進行重組，得到中間載體I ;
[0014](6)、以小鼠腮腺蛋白基因上游調控區的PCR擴增片段為模板，以SEQ ID N0:19和SEQ ID N0:20為引物，擴增得到小鼠腮腺蛋白上游調控區的下游4706bp片段；將其重組到步驟(5)的中間載體I的StuI位點，即為中間載體2 ；
[0015](7)、以小鼠腮腺蛋白基因上游調控區的PCR擴增片段為模板，以SEQ ID N0:21和SEQ ID NO: 22為引物，利用AgeI位點，擴增得到小鼠腮腺蛋白上游調控區的下游3956bp片段；將其重組到步驟出)的中間載體2上，得到載體pPB-MusPSP-neo-EGFP，即為唾液腺組織特異性的轉基因載體。
[0016]在其中一個實施例中，所述步驟(5)-(7)中的小鼠腮腺蛋白基因上游調控區的PCR擴增片段的克隆方法為:以FVB小鼠基因組DNA為模板，SEQ ID N0:1和SEQ ID NO: 2為引物，KOD-FX聚合酶進行第一次PCR擴增；以第一次擴增的產物為模板，SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4為引物，進行第二次PCR擴增，即得。
[0017]在其中一個實施例中，所述步驟(5)-(7)中第一次PCR擴增的反應程序為:94°C2min ；98°C 10s, 74 °C 13min, 5cycles ；98°C 10s, 72 °C 13min, 5cycles ；98°C 10s, 70 °C13min, 5cycles ；98°C 10s, 68°C 13min, 30cycles ；68°C 7min ;所述第二次 PCR 擴增的反應程序為:94°C 2min ；98°C 10s, 68°C 13min, 30cycles ；68°C 7min。
[0018]在其中一個實施例中，步驟(1)中所述第一次PCR的反應程序為:98°C 2min ；98°C 10s，68°C 50s，35 個循環；72°C IOmin ;第二次 PCR 反應程序:98°C 2min ；98°C 10s,68°C lmin40s，35 個循環；72°C IOmin0
[0019]在其中一個實施例中，步驟(2)中所述PCR的反應程序為:94°C 30s ；55°C 30s, 35個循環；72°C 30s, 72°C 3min，30個循環；步驟(3)中所述PCR的反應程序為:98°C 2min ；98 °C 10s, 68 °C 4min，35個循環；72°C IOmin ;步驟(4)-(7)中所述PCR的反應程序為:980C Imin ；98°C IOs ；60°C 5s ；72°C 2min; 35 個循環；72°C 2min。
[0020]本發明還提供了上述構建方法構建得到的唾液腺組織特異性的轉基因載體。
[0021]與現有技術相比，本發明具有以下有益效果:
[0022]1、本發明的唾液腺組織特異性的轉基因載體是通過將小鼠腮腺蛋白啟動子(MusPSP)上游12.1kb的上游調控區序列和可視化篩選neo-EGFP融合雙標記整合到piggyBac高效轉座系統和Lox-Cre酶系統中而構建得到的,該轉基因載體可以實現目的蛋白在特定組織表達(具有在小鼠，豬等動物腮腺特異表達的能力)，可在轉座酶輔助下實現大片段(IOkb以上)的高效整合效率；且該載體還具有便于篩選的綠色熒光標記EGFP和真核細胞篩選的neo新霉素抗性基因，使轉基因細胞篩選和轉基因動物鑒定更簡單、直接、準確；同時考慮公眾對篩選標記安全擔憂，該標記又可以借助loxP-cre酶系統一次性精確測定刪除。只需要把目的基因插入本發明的轉基因載體中ASCI位點，就可以用于轉基因動物小鼠和豬等動物生產，具有簡單，方便，安全的特點。
[0023]2、本發明的轉基因載體是一種唾液腺特異表達高效整合通用載體，可用于轉基因小鼠和豬等動物方面轉基因應用，既可以用于傳統的原核注射，胞漿注射，又可以用于體細胞克隆細胞系篩選等，與現代轉基因平臺有很好的兼容性。
[0024]3、本發明通過4片段重組方法，即利用多對重疊引物對大片段序列擴增，將其人為打斷后，利用擴增片段產生的同源重組接頭，在重組酶輔助下，一段段重組在一起，首次克隆FVB小鼠上游調控區，并克隆到載體中，經測序，該調控區不同于文獻報道的調控區。該克隆方法簡單高效，在技術上有效克服了大片段載體(12Kb以上)構建難度。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為Serguei P.Golovan構建的轉植酸酶載體；
[0026]圖2為中國農業大學伊海芳(2006)構建的兩個豬腮腺蛋白轉基因載體；
[0027]圖3為本發明實施例1的pPB-MusPSP-neoEGFP載體的構建示意圖；
[0028]圖4為實施例1中克隆得到的MusPSP的PCR圖譜，其中A為MusPSP上游調控區克隆(_11503bp ~+1390bp) ;B 為 MusPSP 上游調控區克隆(_11325bp ~+980bp)；
[0029]圖5為實施例1中Neo-T2A-EGFP的酶切鑒定電泳圖，其中1、2、3分別代表T2A-EGFP (765bp)，neo-T2A (835bp)，neo-T2A_EGFP (1600bp)；
[0030]圖6為實施例1中pcDNA-Neo-T2A-EGFP的酶切鑒定電泳圖，其中1、2代表pcDNA-Neo-T2A-EGFP的目的條帶1590bp，3代表1和2的質粒對照；
[0031 ] 圖7為實施例1中pPSPBGPneo-PB- XynB載體的酶切鑒定電泳圖，其中M代表Marker2000 ; 1、2 為 pPSPBGPneo-PB-XynB 質粒對照，3、4 分別代表該質粒 Xho I 和 Not I 的酶切結果；
[0032]圖8為實施例1中pPSPBGPneo-T2A-EGFP-PB_XynB載體的酶切鑒定電泳圖，其中M 代表 DL DNA15000Marker ;泳帶 I 代表 pPSPBGPneo-T2A-EGFP-PB_XynB 載體質粒對照，2、3代表1的酶切結果，箭頭所指為目的條帶2935bp ；
[0033]圖9為實施例1中小鼠腮腺蛋白上游調控區(MusPSP)克隆的構建示意圖；
[0034]圖10為實施例1中MusPSP調控區片段l(-3143bp~+865bp)克隆質粒AscI，NotI酶切鑒定圖譜；其中帶1，2，3，4，5為不同克隆酶切鑒定，箭頭指示目的帶；
[0035]圖11為實施例1中MusPSP調控區片段2 (_7849bp~-3143) Agel、stul酶切鑒定圖譜；其中帶1，2，3為不同克隆株酶切鑒定；
[0036]圖12為實施例1中MusPSP調控區片段3 (_11805pb~_7849bp)AgeI酶切鑒定圖譜；其中帶1，2，3，4為不同克隆酶切鑒定；
[0037]圖13為實施例2中利用pPB-MusPSP-neoEGFP載體轉染PEF細胞篩選結果對比分析；上圖照片為40倍鏡下，分別在488nm波長激發光下(左圖)和普通光下(右圖)的觀測結果，C1、C2、Z3、Z4代表各組轉染對應的觀測結果；其中，C1、C2分別為單質粒轉染對照I (環狀質粒轉染)和單質粒轉染對照2 (線性化質粒轉染)；Z3、Z4為雙質粒共轉染的各組；
[0038]圖14為實施例2中pPB-MusPSP-neo-EGFP載體轉染效率分析圖。
【具體實施方式】
[0039]以下結合具體實施例來詳細說明本發明。
[0040]以下實施例中所使用的引物均是委托上海生工生物技術有限公司合成的。
[0041]實施例1唾液腺組織特異性的轉基因載體的構建方法
[0042]請參閱圖3，為本發明的唾液腺組織特異性的轉基因載體的構建方案圖，包括以下步驟:
[0043](I)、小鼠腮腺蛋白上游調控區(PSP)的克隆(包括腮腺蛋白轉錄起始位點及第一內含子)
[0044]取FVB品系小鼠尾組織樣品，抽提其基因組DNA，接著以FVB小鼠基因組DNA為模板，采用KOD-FX聚合酶(Τ0Υ0Β0，日本)進行PCR擴增。首先采用引物mpsp3497-Fl (SEQ IDNO:1), mpspl6390-Rl(SEQ ID NO:2)進行第一次PCR擴增，得到小鼠腮腺蛋白上游調控區(_11503bp~+1390bp)，結果如圖4A所示；然后采用嵌套引物mPSP-3675_F2 (SEQ ID NO: 3)和mPSP-15980-R2(SEQ ID NO: 4)，以第一次擴增的產物為模板，進行第二次PCR擴增，擴增小鼠腮腺蛋白區域(_11325bp~+980bp)，結果如圖4B所示，得到克隆FVB品系腮腺蛋白上游調控區MusPSP，其中引物序列如表1所示，MusPSP與文獻報道的序列對比的分析結果見表2。經與NCBI中提交的鼠PSP腮腺蛋白上游調控區增強子區(U73190.1, X68699.1)序列比對分析，兩個增強子區相識性達99%，核心啟動子區(轉錄起始位點上游300bp)與小鼠數據庫(UCSC)比對結果完全一致，分析結果顯示本研究獲得MusPSP調控區與Golovan，S.P等(2001)制備轉基因豬和小鼠采用的腮腺蛋白上游調控區并不是同一來源的。
[0045]表1小鼠腮腺蛋白上游調控區(PSP)的克隆引物
【權利要求】
1.一種唾液腺組織特異性的轉基因載體的構建方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)、分別以質粒PCDNA3.1(+)和 PT2AL200R175-CAGGS-EGFP 為模板，SEQ ID NO: 5 和SEQ ID N0:6、及SEQ ID N0:7和SEQ ID NO:8為引物進行第一次PCR擴增，獲得帶有若干重疊序列的neo基因和EGFP基因；各取0.5_3 μ L混合后作為模板進行第二次PCR擴增，純化得到neo-EGFP融合基因；用EcoR I和Xba I雙酶切pcDNA3.1 (+)和neo-EGFP融合基因，純化回收酶切產物，連接，構建得到pcDNA-Neo-T2A-EGFP載體； (2)、以質粒pPB-UbC-EGFP-neo 為模板，分別以 SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO: 10、及 SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12 作為引物，進行 PCR 擴增得到 Not 1-5-PB-Not I，Xho 1-3-PB-Xho I，分別采用Not I和Xho I酶切后，連接在載體pPSPBGPneo-XynB上，得到載體 pPSPBGPneo-PB-XynB ； (3)、以步驟(1)得到的pcDNA-neo-T2A-EGFP載體為模板，用長片段PCR體系，SEQIDNO: 13 和 SEQ ID NO: 14 作為引物進行 PCR 擴增得到 infusion-CMV-neo-T2A_EGFP 片段，切膠純化；用Cla I和Bgl II雙酶切步驟(2)得到的載體pPSPBGPneo-PB-XynB，對目的片段切膠純化；將infusion-CMV-neo-T2A-EGFP片段重組到pPSPBGPNeo-PB-XynB載體的兩個1xp 位點中間，得到 pPSPBGPneo-T2A-EGFP-PB-XynB 載體； (4)、以步驟(3)得到的pPSPBGPneo-T2A-EGFP-PB-XynB 載體為模板，SEQ ID NO: 15 和SEQ ID NO: 16作為引物，進行PCR擴增，得到載體中的pPB-lox-neoEGFP-loxp片段，并添加AgeI限制性內切酶位點，純化，得到新載體骨架； (5)、以小鼠腮腺蛋白基因上游調控區的PCR擴增片段為模板，SEQID NO: 17和SEQ IDNO: 18為引物，擴增得到小鼠腮腺蛋白上游調控區的下游4009bp片段，將4009bp片段與新載體骨架pPB-lox-neoEGFP-loxp中的重組序列進行重組，得到中間載體I ; (6)、以小鼠腮腺蛋白基因上游調控區的PCR擴增片段為模板，以SEQID NO: 19和SEQID N0:20為引物，擴增得到小鼠腮腺蛋白上游調控區的下游4706bp片段；將其重組到步驟(5)的中間載體I的StuI位點，即為中間載體2 ； (7)、以小鼠腮腺蛋白基因上游調控區的PCR擴增片段為模板，以SEQID N0:21和SEQID NO:22為引物，利用AgeI位點，擴增得到小鼠腮腺蛋白上游調控區的下游3956bp片段；將其重組到步驟(6)的中間載體2上，得到載體pPB-MusPSP-neo-EGFP，即為唾液腺組織特異性的轉基因載體。
2.根據權利要求1所述的唾液腺組織特異性的轉基因載體的構建方法，其特征在于，所述步驟(5)-(7)中的小鼠腮腺蛋白基因上游調控區的PCR擴增片段的克隆方法為:以FVB小鼠基因組DNA為模板，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2為引物，KOD-FX聚合酶進行第一次PCR擴增；以第一次擴增的產物為模板，SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4為引物，進行第二次PCR擴增，即得。
3.根據權利要求2所述的唾液腺組織特異性的轉基因載體的構建方法，其特征在于，所述第一次 PCR 擴增的反應程序為:94°C 2min ;98°C 10s, 74 °C 13min, 5cycles ；98 °C 10s, 72 °C 13min, 5cycles ；98 °C 10s, 70 °C 13min, 5cycles ；98 °C 10s, 68 °C13min, 30cycles ；68 °C 7min ;所述第二次 PCR 擴增的反應程序為:94 °C 2min ；98 °C10s, 68°C 13min, 30cycles ；68°C 7min。
4.根據權利要求1所述的唾液腺組織特異性的轉基因載體的構建方法，其特征在于，步驟(1)中所述第一次PCR的反應程序為:98°C 2min ；98°C 10s,68°C 50s，35個循環；72°C IOmin ;第二次 PCR 反應程序:98°C 2min ；98°C 10s，68°C lmin40s，35 個循環；72°CIOmin0
5.根據權利要求1所述的唾液腺組織特異性的轉基因載體的構建方法，其特征在于，步驟(2)中所述 PCR 的反應程序為:94°C 30s ；55°C 30s，35 個循環；72°C 30s, 72°C min，30個循環；步驟⑶中所述PCR的反應程序為:98°C 2min ；98°C 10s，68°C 4min，35個循環；72°C IOmin ;步驟(4)-(7)中所述 PCR 的反應程序為:98°C Imin ；98°C IOs ；60°
C 5s;72°C 2min;35 個循環；72°C 2min。
6.權利要求1-5任一項所述的構建方法構建得到的唾液腺組織特異性的轉基因載體。
【文檔編號】C12N15/66GK103509812SQ201310343067
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年8月7日 優先權日:2013年8月7日
【發明者】張獻偉, 吳珍芳, 李紫聰, 劉德武 申請人:吳珍芳, 李紫聰