一種鹵醇脫鹵酶的快速篩選方法
【專利摘要】本發明涉及一種酶的篩選方法，特別涉及一種鹵醇脫鹵酶的篩選方法。用pH顯色經過初篩和復篩兩步法來篩選高酶活的鹵醇脫鹵酶。本發明使用深孔板進行微型化培養，實現了高通量培養和粗酶液的高通量制備；突破性的利用pH的變化來篩選高酶活的鹵醇脫鹵酶，效率高，成本低、速度快；消耗的培養基和試劑少；本發明使得可機械化自動化操作以實現，借助自動化的高通量篩選儀器可以進一步大幅度降低勞動量，提高篩選通量。
【專利說明】一種南醇脫南酶的快速篩選方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種酶的篩選方法，特別涉及一種鹵醇脫鹵酶的篩選方法。
【背景技術】
[0002] 齒醇脫齒酶（halohydrindehalogenase,HHDH)是一種具有催化活性的水解酶，能 夠可逆性作用于鄰羥基鹵化物(鄰鹵醇）形成環氧化物及環氧化物的開環。
[0003] 環氧化物被公認為有機合成中最重要、應用最廣泛的合成中間體之一，環氧化 物手性合成和開環對于手性藥物的合成非常重要。例如阿托伐他汀鈣的側鏈中間體A5 ((R) _ 4 -氰基-3 -羥基丁酸乙酯）的酶法合成中，就是利用鹵醇脫鹵酶作為生物催化劑。
[0004] 天然的鹵醇脫鹵酶在工業化過程中存在生產成本高、酶活低、穩定性差等現象，制 約了這類酶在大規模生產中的應用，通過篩選得到高酶活的鹵醇脫鹵酶是降低生產成本的 重要方法之一。定點突變在鹵醇脫鹵酶的改造中扮演著重要的角色，通過此手段已對該類 酶的某些特性如穩定性、轉換數及對應體選擇性等進行了改造，并獲得了一些好的突變體。 但該方法存在篩選容量過大、篩選過程復雜，且費用昂貴、費時費力等特點。
[0005]目前，鹵醇脫鹵酶的篩選主要利用氣相色譜（GC)檢測產物的生成量來計算酶活 的值，從而篩選到酶活較高的鹵醇脫鹵酶，如專利US7588928中，就是用這種方法進行篩選 的。但在篩選過程中由于突變體很多，使用的儀器和檢測費用昂貴、過程復雜且費時費力， 不利于大規模的推廣使用。
[0006] 在利用鹵醇脫鹵酶催化的過程中，反應體系中由于有HC1的生成，pH會逐漸減小， pH的變化速率與反應的快慢有直接的關系，在相同條件下，而反應的快慢與酶活的大小直 接相關。因此，可以利用反應體系pH的變化速率來快速篩選具有高酶活的鹵醇脫鹵酶。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的是為了克服現有篩選鹵醇脫鹵酶的方法成本高及工作量大和周期 長的不足等問題。
[0008] 實現本發明目的的技術方案是本發明提供了一種鹵醇脫鹵酶的快速篩選方法，是 基于深孔板的微型化培養與基于pH耦聯變化的篩選方法。具體的方法如下：
[0009] 取含有鹵醇脫鹵酶基因的大腸桿菌單菌落，經稀釋菌濃度后接種于裝有液體培養 基的深孔板的孔中，每個孔有一個特定的編號；于30?40°C溫度下，180?220rpm的搖床 中培養4?10h;然后加入終濃度為ImM的IPTG(異丙基-0 -D-硫代吡喃半乳糖苷)，于 28?35°C溫度下、180?220rpm的搖床中繼續培養10?20h;將深孔板重復進行超低溫冷 凍后室溫融化；將深孔板離心處理5?30min;深孔板的深孔中的上清液為粗酶液。以微量 化梯度稀釋法將粗酶液稀釋待測。取反應管，加入反應底物，去離子水和pH指示劑，加入稀 釋的待測粗酶液，以原始的鹵醇脫鹵酶作為對照，于30?70°C水浴中反應10?30min，根 據反應過程中體系顏色的變化情況進行初篩，根據初步測定結果，選擇對應的克隆進行搖 瓶復篩，復篩時在反應體系中加入反應底物、去離子水，用pH計在線監測體系的pH變化，力口 入稀釋的待測粗酶液，以原始的鹵醇脫鹵酶作對照，于30?70°C水浴反應10?30min，根 據反應過程中體系pH變化速度的快慢篩選出高酶活的鹵醇脫鹵酶。
[0010] 初篩時，反應初時體系的顏色為藍紫色，隨著反應的進行，pH下降，體系的顏色由 藍紫變為紫色，后來變為黃色。篩選出比對照顏色變化快的鹵醇脫鹵酶單菌落進行復篩。
[0011] 復篩：在初篩出的鹵醇脫鹵酶單菌落中篩選出，在復篩開始后單位時間內pH變化 量比作為對照的原始的鹵醇脫鹵酶快的鹵醇脫鹵酶單菌落，即為高酶活的鹵醇脫鹵酶。
[0012] 本發明進一步的方案：
[0013] 挑取含有鹵醇脫鹵酶基因的大腸桿菌單菌落，適當稀釋菌濃度，接種于裝有液體 培養基的深孔板的孔中，每一孔由板號、行號和列號的組合標記，使每個孔有一個特定的 編號。蓋上深孔板的三明治蓋子，于30?40°C、180?220rpm搖床培養4?10h。加入終濃 度為ImM的IPTG(異丙基-3 -D-硫代吡喃半乳糖苷)，于28?35°C、180?220rpm搖床 繼續培養10?20h。結束后把深孔板放入-80°C超低溫冰箱，待溫度穩定后從超低溫冰箱 中拿出深孔板至室溫融化，然后再按以上過程2遍或2遍以上凍融菌體細胞。將深孔板放置 于孔板離心機,5000?10000Xg離心5?30min。深孔板的深孔中的上清液為粗酶液。以 微量化梯度稀釋法將粗酶液適當稀釋。在反應管中加入反應底物、去離子水和pH指示劑， 加入稀釋的待測粗酶液，以原始的鹵醇脫鹵酶作對照，于30?70°C水浴反應10?30min， 根據反應過程中體系顏色的變化情況進行篩選，根據初步測定結果，選擇對應的克隆進行 搖瓶復篩，獲得高酶活的鹵醇脫鹵酶。
[0014] 復篩時在反應體系中加入反應底物、去離子水，用pH計在線監測體系的pH變化， 加入稀釋的待測粗酶液，以原始的鹵醇脫鹵酶作對照，于30?70°C水浴反應10?30min， 根據反應過程中體系pH變化速度的快慢篩選出高酶活的鹵醇脫鹵酶。
[0015] 鹵醇脫鹵酶的單克隆菌落，來自于對原始基因序列進行人工定點突變后獲得的單 克隆菌落突變體，或是對原始基因序列進行隨機突變后獲得的單克隆菌落突變體，或是未 經突變的含鹵醇脫鹵酶的菌落。
[0016]采用微量化梯度稀釋法稀釋菌濃度的具體步驟為：用帶濾芯的無菌移液吸頭以8 通道移液器，自深孔板的A1?H1孔中吸取0.lmL鹵醇脫鹵酶粗酶液，移至裝有0. 9mL無菌 生理鹽水的深孔板的A2?H2孔中，振蕩混勻，再用8通道移液器吸取0.lmLA2?H2,對應 地移至深孔板A3?H3深孔中，如此逐級稀釋至適當濃度。
[0017] 所述液體培養基為：蛋白胨8?15g/L、酵母粉2?10g/L、甘油8?15g/L、磷酸 二氫鉀 0? 5 ?1. 5g/L、硫酸鎂 0? 1 ?0? 5g/L，pH7. 0、0?IMPa滅菌 30min。
[0018]上述的深孔板可以是：6孔板、12孔板、24孔板、48孔和96孔板。深孔板的三明治 蓋，是從上依次由帶孔的不銹鋼蓋子、除菌微濾膜片和硅膠孔墊三層組成，不銹鋼蓋子和硅 膠孔墊上的孔與深孔板的深孔對應，以保證各微孔獨立地與外界交換空氣。培養基裝液量 為深孔板孔體積的5?30%。
[0019] 所用的反應底物為4 -X- 3 -羥基丁酸乙酯，其中X為Cl、Br等，氰化鈉，氰化鉀， 鹽酸，硫酸，磷酸，氫氧化鈉中的一種或幾種。此處優選（S) - 4 -氯-3 -羥基丁酸乙酯、氰 化鈉和磷酸。（S) - 4 -氯-3 -羥基丁酸乙酯為反應底物1。
[0020] 反應底物氰化鈉用去離子水配成10% -40%的氰化鈉溶液，緩慢滴加磷酸至pH6. 8。 優選去離子水配成30%的氰化鈉溶液，緩慢滴加磷酸至pH6. 8,此為反應底物2。
[0021] 初篩時底物1的濃度為10 - 50mM，底物2中氰化鈉的濃度為10 - 80mM。
[0022] 初篩所用的pH指示劑為溴百里酚藍、溴甲酚紫、酚紅、中性紅、甲酚紅的一種或幾 種組合。此處優選1. 〇g/l溴甲酚紫鈉鹽和1. 〇g/l的溴百里酚藍鈉鹽水溶液的混合指示 劑。
[0023] 初篩時用的深孔板，反應裝液量為深孔板的5?30%。深孔板放在離心管架中，于 30?70°C、180?220rpm水浴振蕩反應10 - 30min，優選反應條件50°C、200rpm條件下反 應。
[0024] 初篩pH指示劑的加量為反應液體積的0. 005% - 0. 05%，優選加量為0. 02%。
[0025] 復篩時的反應容器為50ml、100ml的三口燒瓶，其中一個燒瓶口可插入pH電極在 線監測pH的變化情況。
[0026] 復篩得到的鹵醇脫鹵酶單菌落做催化反應測酶活，定時取樣用乙酸乙酯萃取底物 和產物，利用GC檢測底物和產物的含量，從而計算出酶活值。
[0027] 鹵醇脫鹵酶酶活的定義：在指定的溫度和pH條件下，每分鐘生成1ymol(R) - 4 -氰-3 -羥基丁酸乙酯所需的酶量，為一個酶活單位（U)。
[0028] 鹵醇脫鹵酶酶活的測定方法：取底物（S) - 4 -氯-3 -羥基丁酸乙酯和氰化鈉至 反應體系濃度分別為30mM，溶于0. 5M磷酸鹽緩沖液（pH7. 0)中，水浴溫度50°C，磁力攪拌， 取稀釋后的鹵醇脫鹵酶適量加入反應體系中，開始計時，20min后取樣，用三倍體積的乙酸 乙酯萃取，用GC測定轉化率。
[0029] 底物及產物的具體分析條件為：色譜柱為0.3mm毛細管柱30m(DIKMA)，FID檢 測器。色譜柱溫度208°C，氣化和檢測溫度均為230°C，載氣流量20 - 30ml/min，進樣量 0? 3 - 0?L，載氣為N2。
[0030] 篩選效果的判斷：
[0031] 1.初篩：反應初時體系的顏色為藍紫色，隨著反應的進行，pH下降，體系的顏色由 藍紫變為紫色，后來變為黃色。篩選出比對照顏色變化快的鹵醇脫鹵酶單菌落。
[0032] 2.復篩：在初篩的鹵醇脫鹵酶單菌落中，篩選出在開始后，單位時間pH變化量比 對照快的。
[0033] 測定酶活：在復篩的鹵醇脫鹵酶單菌落中，選取pH變化量最快的一組測定酶活 值。
[0034] 本發明具有積極的效果：（1)本發明使用深孔板進行微型化培養，實現了高通量 培養和粗酶液的高通量制備；（2)本發明突破性的利用pH的變化來篩選高酶活的鹵醇脫鹵 酶，效率高，成本低、速度快；消耗的培養基和試劑少；（3)本發明使得可機械化自動化操作 以實現，借助自動化的高通量篩選儀器可以進一步大幅度降低勞動量，提高篩選通量。
【具體實施方式】
[0035] (實施例1)
[0036] 1.鹵醇脫鹵酶的初篩
[0037] 挑取含有鹵醇脫鹵酶基因的大腸桿菌單菌落(其中1號孔為原始對照)，接種于裝 有0. 6ml氨芐抗性液體培養基的48孔深孔板的孔中，每個孔的容積為4. 6ml。蓋上深孔板的 三明治蓋子，于37°C、200rpm搖床培養6h后，加入終濃度為ImM的IPTG(異丙基-P-D- 硫代吡喃半乳糖苷)，溫度調整至30°C、200rpm搖床繼續培養20h。
[0038] 所用的培養基為：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、甘油10g/L、磷酸二氫鉀1.Og/L、硫 酸鎂0. 2g/L，pH7. 0、0.IMPa滅菌30min，待冷卻至室溫加氨芐至終濃度100iig/mL。
[0039] 結束后把深孔板放入-80°C超低溫冰箱，待溫度穩定后從超低溫冰箱中拿出深 孔板至室溫融化，然后再按以上過程2遍凍融菌體細胞。將深孔板放置于孔板離心機， lOOOOXg離心30min。深孔板的深孔中的上清液為粗酶液。粗酶液用生理鹽水稀釋10倍。 去離子水用磷酸調pH至6. 8備用。
[0040] 取一個48孔深孔板，每個孔容積4. 6ml，每個孔依次加入53mg反應底物11 (S) -4 -氯-3 -羥基丁酸乙酯，4iiL的反應底物2氰化鈉，0.94mlpH6.8的去離子水，（S)-4 -氯-3 -羥基丁酸乙酯的濃度為10毫摩每升，氰化鈉的濃度為15,0. 2yL混合pH指示劑，蓋 上深孔板的三明治蓋子，于50°C、200rpm水浴振蕩30min，此時反應體系的顏色為藍紫色。 用8通道移液器吸取5yL的稀釋酶液于對應編號的反應孔內，繼續水浴振蕩，開始計時， 觀察每個反應孔的顏色變化情況，選取比原始對照顏色變化快的，對應編號分別為7 #、23#、 26#、39#、43#，對這幾個編號對應的鹵醇脫鹵酶單菌落進行復篩。
[0041] 2.鹵醇脫鹵酶的復篩
[0042] 挑取含有鹵醇脫鹵酶基因的大腸桿菌對應編號為1#、7 #、23#、26#、39#、43#，的單菌 落(其中1號孔為原始對照)，接種于裝有3ml氨芐抗性液體培養基的15ml的離心管，于 37°C、200rpm搖床培養6h后，加入終濃度為ImM的IPTG(異丙基-3 -D-硫代吡喃半乳 糖苷)，溫度調整至30°C、200rpm搖床繼續培養20h。
[0043] 所用的培養基為：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、甘油10g/L、磷酸二氫鉀1. 0g/L、硫 酸鎂0. 2g/L，pH7. 0、0.IMPa滅菌30min，待冷卻至室溫加氨芐至終濃度100iig/mL。
[0044] 結束后加入0. 01%的溶菌酶，待細胞完全破碎后，置于冷凍離心機，4°C、lOOOOXg 離心30min。離心管上清液為粗酶液。粗酶液用生理鹽水稀釋10倍。去離子水用磷酸調 pH至6. 8備用。
[0045] 取5個50ml的三口燒瓶，每個燒瓶依次加入530mg反應底物1，40iiL的反應底物 2,9. 4mlpH6. 8的去離子水，插入pH電極在線監測反應體系的pH,于50°C、200rpm磁力攪 拌30min，此時調整每個反應體系的pH都為6. 82。用移液器吸取50iiL的稀釋酶液于對應 編號1#、7#、23#、26 #、39#、43#的三口燒瓶內，繼續磁力攪拌，開始計時，觀察每個燒瓶5min反 應體系pH的變化情況。
[0046] 3?鹵醇脫鹵酶酶活的測定
[0047] 挑取含有鹵醇脫鹵酶基因的大腸桿菌對應編號為1#、26 #的單菌落(其中1號孔為 原始對照)，接種于裝有25ml氨芐抗性液體培養基的250ml搖瓶中，于37°C、200rpm搖床 培養6h后，加入終濃度為ImM的IPTG(異丙基-3 -D-硫代吡喃半乳糖苷)，溫度調整至 30 °C、200rpm搖床繼續培養20h。
[0048] 所用的培養基為：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、甘油10g/L、磷酸二氫鉀1. 0g/L、硫 酸鎂0. 2g/L，pH7. 0、0.IMPa滅菌30min，待冷卻至室溫加氨芐至終濃度100yg/mL。結束后 離心收集菌體，加入4ml的pH7. 00. 1M的Tris-HC1緩沖液，超聲破碎，待細胞完全破碎后， 置于冷凍離心機，4°C、10000Xg離心30min。離心管上清液為粗酶液。粗酶液用生理鹽水 稀釋10倍。
[0049] 取2個50ml的三口燒瓶，每個燒瓶依次加入530mg反應底物1，40iiL的反應底物 2,9. 4ml0. 5M磷酸鹽緩沖液（pH7. 0)中，水浴溫度50°C，磁力攪拌，取稀釋后的鹵醇脫鹵酶 50iiL加入反應體系中，開始計時，20min后取樣，用三倍體積的乙酸乙酯萃取，用GC測定轉 化率。
[0050] 底物及產物的具體分析條件為：色譜柱為0.3mm毛細管柱30m(DIKMA)，FID檢 測器。色譜柱溫度208°C，氣化和檢測溫度均為230°C，載氣流量20 - 30ml/min，進樣量 0? 3 - 0?L，載氣為N2。
[0051] 通過以上檢測結果，計算出1#原始對照的酶活為127U/ml，26#對應的酶活為 410U/ml，篩選得到的鹵醇脫鹵酶單菌落酶活是原始對照的3. 2倍。
[0052]復篩中在5min時體系的pH變化值：
【權利要求】
1. 一種鹵醇脫鹵酶的快速篩選方法，其特征在于：用pH顯色經過初篩和復篩兩步法來 篩選高酶活的鹵醇脫鹵酶。
2. 根據權利要求1所述的鹵醇脫鹵酶的快速篩選方法，其特征在于：包括如下步驟： (1) 將含有鹵醇脫鹵酶基因的大腸桿菌的單菌落稀釋后接種于裝有液體培養基深孔板 的多個孔中，在搖床中進行兩次培養； (2) 將深孔板超低溫冷凍然后室溫融化，至少重復進行2次； (3) 將前述經過凍融的深孔板進行離心處理，取上清液為粗酶液； (4) 將粗酶液和含有鹵醇脫鹵酶基因的大腸桿菌的單菌落分別加入不同個裝有反應底 物和去離子水及pH指示劑混合液的反應管中，將加入含有鹵醇脫鹵酶基因的大腸桿菌單 菌落的反應管作為參照管，在相同條件下反應，篩選出比參照管顏色變化快的鹵醇脫鹵酶 單菌落，完成初篩； (5) 將初篩所得的鹵醇脫鹵酶單菌落對應的粗酶液分別加入不同個裝有反應底物、去 離子水混合液的反應管中，用pH計在線監測各管內體系的pH的變化，同樣以含有鹵醇脫鹵 酶基因的大腸桿菌單菌落反應管作為參照管，復篩出單位時間內pH變化量比參照管大的 鹵醇脫鹵酶單菌落，即為高酶活的鹵醇脫鹵酶。
3. 根據權利要求2所述的鹵醇脫鹵酶的快速篩選方法，其特征在于：初篩時pH指示劑 的加入量為反應體系液體體積的〇. 〇〇5%-〇. 05%。
4. 根據權利要求2所述的鹵醇脫鹵酶的快速篩選方法，其特征在于：初篩時pH指示加 量為反應體系液體體積的0. 02%。
5. 根據權利要求2所述的鹵醇脫鹵酶的快速篩選方法，其特征在于：初篩所用的pH指 示劑為溴百里酚藍、溴甲酚紫、酚紅、中性紅、甲酚紅的一種或幾種組合。
6. 根據權利要求2所述的鹵醇脫鹵酶的快速篩選方法，其特征在于：初篩所用的pH指 示劑為1. 〇g/l溴甲酚紫鈉鹽和1. 〇g/l的溴百里酚藍鈉鹽水溶液的混合指示劑。
7. 根據權利要求2所述的鹵醇脫鹵酶的快速篩選方法，其特征在于：所述反應底物為 通式為4-X-3-羥基丁酸乙酯，其中X為Cl、Br中之一，或氰化鈉、氰化鉀、鹽酸、硫酸、磷酸、 氫氧化鈉中的一種或幾種組合。
8. 根據權利要求7所述的鹵醇脫鹵酶的快速篩選方法，其特征在于：所述反應底物為 (S) -4-氯-3-羥基丁酸乙酯或氰化鈉或磷酸中一種或幾種組合。
9. 根據權利要求7所述的鹵醇脫鹵酶的快速篩選方法，其特征在于：初篩時反應底物 為（S) -4-氯-3-羥基丁酸乙酯和為氰化鈉的混合物時，（S) -4-氯-3-羥基丁酸乙酯的濃 度為10-50毫摩每升，氰化鈉的濃度為10-80毫摩每升。
10. 根據權利要求9所述的鹵醇脫鹵酶的快速篩選方法，其特征在于：（S)-4-氯-3-羥 基丁酸乙酯的濃度為30毫摩每升，氰化鈉的濃度為30毫摩每升。
【文檔編號】C12Q1/527GK104342483SQ201310321476
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年7月26日 優先權日:2013年7月26日
【發明者】陳令偉 申請人:南京朗恩生物科技有限公司